用于防治赤霉病病害的組合物和方法
【專利摘要】本文提供了包含微生物菌株和培養(yǎng)物的組合物及其使用方法。某些菌株、培養(yǎng)物，及其組合物可用于防治例如各種作物植物的赤霉病病害。還提供了生物防治組合物及使用其預(yù)防、抑制或治療植物病原體的發(fā)育或病害的發(fā)展以及維護(hù)植物產(chǎn)量的方法。
【專利說明】用于防治赤霉病病舍的組合物和方法
[0001]序列表的并入
[0002]所附序列表的內(nèi)容以引用的方式完整地并入本文。所附的名稱為“SGI1520_1W0_ST25.txt”的文件是2012年7月24日創(chuàng)建的，大小為55Kb。該文件可在使用Window OS的計(jì)算機(jī)上使用Microsoft Word存取。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及植物病原性病害的生物防治。具體地，它涉及可用于防治諸如小麥和大麥的谷類植物上的赤霉病病害的組合物和方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]赤霉病，也稱為頭部瘡痂病(head scab)、粉紅色霉菌(pink mold)、頭部發(fā)白(whiteheads)和硬化瘡痂病(tombstone scab),是折磨著全世界,尤其美國、歐洲和中國的小麥、大麥和數(shù)種其他谷類作物的破壞性病害。在世界上的潮濕和半潮濕谷類種植區(qū)，包括印度、俄羅斯、法國、德國和英國，這種病害可達(dá)到流行水平并且對(duì)谷物，尤其小麥和大麥造成大范圍損害。尤其，在美國，小麥瘡痂病或赤霉病是更具損害性的小麥病害之一。從全國范圍來看，這種病害已經(jīng)使小麥產(chǎn)業(yè)蒙受數(shù)百萬美元的產(chǎn)量損失。在中西部和高平原，小麥瘡痂病是近年來小麥生產(chǎn)的主要障礙。赤霉病除了攻擊小麥外，還攻擊大麥、燕麥、玉米和許多其他谷類并在其上繁殖。
[0006]這種嚴(yán)重的植物病害可由數(shù)種植物病原體引起，但主要由真菌屬鐮刀菌屬(Fusarium)的數(shù)種物種引 起。例如，小麥赤霉病病害的致病物包括許多不同的鐮刀菌屬物種，例如，黃色鐮刀菌(F.culmorum)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)(有性型，玉米赤霉菌(Gibberella zeae))、燕麥鍵刀菌(F.avenaceum)(有性型,燕麥赤霉菌(G.avenacea))、梨孢鐮刀菌(F.poae),以及非鐮刀菌屬病原體諸如雪霉葉枯菌(Microdochium nivale)(有性型，雪腐明梭抱菌(Monographella nivalis))和Microdochium majus。在美國、歐洲和世界上大多數(shù)農(nóng)業(yè)重要國家，赤霉病的主要致病物為禾谷鐮刀菌(有性型，狹義的玉米赤霉囷)。
[0007]這些病原體通常在植物殘?bào)w上生存。它們在開花期間侵襲并損害谷物頭部的小穗，從而阻止或部分阻礙谷物的谷物頭部的發(fā)育。因此，侵襲的瘡痂病病原體可滅殺谷物頭部的一部分或整個(gè)谷物頭部。一些受感染種子活力低下并且經(jīng)常無法發(fā)芽。發(fā)芽的受感染種子由于冠腐病或根腐病而經(jīng)常在苗期早期死亡，導(dǎo)致后面的作物植物站立欠佳。健康幼苗在出苗時(shí)也可能會(huì)被感染。除了站立欠佳、不穩(wěn)(unthrifty)之外,如果條件對(duì)病害發(fā)展有利，那么病原體侵染造成的產(chǎn)量損失也可能會(huì)相當(dāng)高。
[0008]鐮刀菌屬的真菌病原體蔓延到世界各地的谷物栽培區(qū)，并且已知會(huì)造成嚴(yán)重的損害，尤其是在開花期和灌漿期之間具有高降雨量的地區(qū)更是如此。當(dāng)禾谷鐮刀菌是致病物時(shí)，這種病害是首要關(guān)注的，不但因?yàn)樗嗽斐僧a(chǎn)量損失之外還會(huì)降低受污染谷物的商業(yè)價(jià)值，而且還因?yàn)殓牭毒腥具€可能會(huì)導(dǎo)致單端孢霉烯霉菌毒素在谷物中的累積，從而威脅到人類和牲畜的健康。單端孢霉烯是全世界谷類的主要霉菌毒素污染物，導(dǎo)致非反芻動(dòng)物拒食、嘔吐、腹瀉和體重減輕并且在暴露水平高時(shí)對(duì)其他動(dòng)物和人類的健康構(gòu)成威脅。這一威脅已因?yàn)樵诿绹坦如牭毒曜罱蚋叩漠a(chǎn)毒能力或活力的轉(zhuǎn)變而加劇。最經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素是脫氧瓜萎鐮菌醇(DON，也稱為嘔吐毒素)和玉米烯酮(ZEA)。尤其是脫氧瓜萎鐮菌醇是非常危險(xiǎn)的毒素，導(dǎo)致食用受感染谷物的人和動(dòng)物發(fā)生胃腸功能紊亂，伴有出血性病狀等，在一些情況下導(dǎo)致死亡。因?yàn)槊撗豕衔牼紝?duì)PH的變化和高溫一般具有穩(wěn)定性，所以解毒可能非常困難。因此，受污染超出一定水平的谷物不能以任何的釀造、加工或牲畜飼料的形式使用，因而經(jīng)常需要銷毀。
[0009]迄今為止，已利用各種策略防治作物植物上的赤霉病。有前途的供選方案包括化學(xué)措施、對(duì)抗性作物栽培品種的開發(fā)，及田地作物輪作和耕作的傳統(tǒng)實(shí)踐。在這些供選方案中，化學(xué)殺害蟲劑在減輕赤霉病侵染方面可能有些效果，但是有關(guān)殺真菌劑在作物發(fā)育后期，通常在就在收獲前幾周的開花期的使用的殘留擔(dān)憂減低了它們的吸引力。使用傳統(tǒng)育種和遺傳工程開發(fā)抗性栽培品種代表另一種可選的病害防治替代方案，這方面也出現(xiàn)進(jìn)展。報(bào)道的遺傳工程進(jìn)展的實(shí)例包括改變植物激素的產(chǎn)量或操縱植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。近年來，在傳統(tǒng)育種領(lǐng)域中，已在理解對(duì)赤霉病病害的抗性的遺傳基礎(chǔ)方面取得相當(dāng)大的進(jìn)展，并且已報(bào)道賦予抗性的許多基因和數(shù)量性狀基因座(QTL)。然而，在提高作物對(duì)赤霉病病害的抗性方面的進(jìn)展緩慢，主要是因?yàn)檠芯窟@種病害的難度。事實(shí)上，目前對(duì)牽涉到抗性或敏感性的機(jī)制的了解相對(duì)很少。另外，作為該病害的主要致病物的鐮刀菌屬物種的遺傳多樣性經(jīng)常引發(fā)關(guān)于化學(xué)殺真菌劑和抗性栽培品種的功效將如何耐久的擔(dān)憂。因此，目前大規(guī)模生產(chǎn)的幾乎所有的小麥栽培品種仍然易受感染。 [0010]另外，盡管有望通過傳統(tǒng)實(shí)踐諸如在收獲后犁地來掩埋受致病物，例如，禾谷鐮刀菌侵染的作物殘茬在防治赤霉病病害方面取得一些成功，但是常規(guī)的收獲后田地耕作與少耕的土壤保持實(shí)踐不相容。鑒于接種物可能會(huì)長距離散布并且多種多樣的作物可以充當(dāng)病原體的替代寄主，作物輪作經(jīng)常是站不住腳的解決方案。除了環(huán)境中殺害蟲劑殘留問題之外，殺害蟲劑抗性及谷物中DON含量增加的實(shí)例的報(bào)告也可能會(huì)影響到它們的使用。進(jìn)一步地，成本及公共和私營部門對(duì)環(huán)境和食品安全中殺害蟲劑殘留的越來越多的擔(dān)憂使得這種病害防治替代方案不那么有吸引力，并且已導(dǎo)致要求使用盡可能少的殺害蟲劑進(jìn)行作物栽培。
[0011]總起來說，盡管在開發(fā)防治赤霉病的技術(shù)方面取得相當(dāng)大的進(jìn)展，但是減少這種破壞性病害對(duì)谷物產(chǎn)量和質(zhì)量的影響仍然是一個(gè)棘手的問題。因此，鑒定和開發(fā)新赤霉病防治技術(shù)是改進(jìn)許多谷類作物的產(chǎn)量和質(zhì)量所必不可少的。這些問題不僅在美國，而且在全球各地，包括亞洲和歐洲，都亟待解決。
[0012]自從20世紀(jì)90年代中期以來，赤霉病病害的生物防治已經(jīng)吸引相當(dāng)大的關(guān)注。生物防治劑(BCA)，盡管目前的數(shù)量非常有限，但可能是顯著降低由諸如鐮刀菌的病原體引發(fā)的病害的水平的環(huán)境上可接受的方法。公眾接受度、與其他病害管理措施的相容性，及耐久性是支持開發(fā)生物防治赤霉病病害的策略的有利因素之一。生物防治劑可在有機(jī)谷類生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。在常規(guī)生產(chǎn)中，此類藥劑在化學(xué)殺真菌劑不能再施加后，可延長對(duì)穗的保護(hù)至跨越開花期。迄今為止，已經(jīng)在生物防治領(lǐng)域取得顯著進(jìn)展。例如，產(chǎn)孢子細(xì)菌(諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的物種)和酵母菌(諸如隱球菌屬(Cryptococcus)的物種)的某些菌株在防治赤霉病病害和減少霉菌毒素污染上顯示出一些前景。然而，盡管取得這些和其他進(jìn)展，但仍然需要用于赤霉病病害的生物防治的改良微生物體。盡管BCA已成為更能讓人接受的植物病原體解決方案并且BCA產(chǎn)品已得到比以往任何時(shí)候都更高的程度的銷售，但是迄今為止很少有人嘗試開發(fā)生物防治赤霉病病害的策略和拮抗微生物體。此外，鐮刀菌屬某些種及赤霉病病害的其他致病物的生命周期提示，該病原體可以潛在地易受使用處于不同發(fā)育階段的拮抗微生物體的生物防治技術(shù)影響。因而，需要鑒定優(yōu)選具有不同作用模式的新生物防治劑，以及可幫助有效預(yù)防或阻抑赤霉病病害發(fā)展的生物防治方法。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本文提供了包含微生物菌株和培養(yǎng)物的組合物。某些菌株、培養(yǎng)物，及其組合物可用于防治，例如，包括小麥和其他谷類植物在內(nèi)的各種作物植物的赤霉病病害。還提供了生物防治組合物及使用其預(yù)防、抑制或治療植物病原體的發(fā)育或病害的發(fā)展以及維護(hù)植物產(chǎn)量的方法。還提供了作為生物防治劑的此類組合物與其他農(nóng)業(yè)上有效的防治有害植物病原體的化合物或組合物組合使用的方法。
[0015]在一方面，本發(fā)明提供了具有對(duì)抗赤霉病病害的阻抑活性的分離的微生物菌株。根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的微生物菌株選自由微桿菌屬、芽孢桿菌屬、球腔菌屬和貪噬菌屬組成的組。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物菌株選自由以下組成的組:球腔菌屬菌株SG1-010-H11(保藏號(hào)為NRRL50471)、微桿菌屬菌株SG1-014-C06 (保藏號(hào)為NRRL B-50470)、微桿菌屬菌株SG1-005-G08 (保藏號(hào)為NRRL_-—)、貪噬菌屬菌株SG1-014-G01 (保藏號(hào)為 NRRL B-50469)、芽孢桿菌屬菌株SG1-015-F03 (保藏號(hào)為NRRLB-50760)、芽孢桿菌屬菌株SG1-015-H06(保藏號(hào)為NRRL B-50761)，及其中任何一者的殺蟲活性變異體。根據(jù)一些其他優(yōu)選實(shí)施方案的微生物菌株可包含與序列表中任何一個(gè)核苷酸序列展現(xiàn)至少85%的序列同一性的DNA序列。進(jìn)一步提供了本文所公開的微生物菌株的生物上純的培養(yǎng)物和富集培養(yǎng)物。
[0016]還在本發(fā)明的另一方面提供了組合物，其包含本發(fā)明微生物菌株或其培養(yǎng)物，及農(nóng)業(yè)上有效的量的選自由以下組成的組的化合物或組合物:殺螨劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、殺昆蟲劑、殺微生物劑、殺線蟲劑、殺害蟲劑和肥料。在這個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，組合物可被制備成選自由以下組成的組的制劑:乳狀液、膠體、粉狀物(dust)、顆粒劑、小丸劑、粉劑(powder)、噴灑劑、乳狀液和溶液。在一些其他實(shí)施方案中，組合物可與載體一起提供。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，載體為農(nóng)業(yè)上可接受的載體。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體為植物種子。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物為種子包衣制劑。在本公開中進(jìn)一步提供了用根據(jù)本發(fā)明的組合物包衣的種子。
[0017]在本發(fā)明的另一方面，提供了預(yù)防、抑制或治療植物病原體的發(fā)育的方法。該方法涉及在寄主植物的生長培養(yǎng)基或土壤中的寄主植物生長之前或與其同時(shí)，讓本發(fā)明微生物菌株或其培養(yǎng)物在該生長培養(yǎng)基或土壤中生長。在這個(gè)方面的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物病原體引起赤霉病病害。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該植物病原體為禾谷鐮刀菌。
[0018]在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了預(yù)防、抑制或治療植物赤霉病病害的發(fā)展的方法。該方法涉及將有效量的本發(fā)明微生物菌株或其培養(yǎng)物施加至植物上，或施加至植物的周圍環(huán)境中。在一個(gè)實(shí)施方案中，此種赤霉病病害由真菌禾谷鐮刀菌引起。在這個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，將微生物菌株或其培養(yǎng)物施加至土壤、種子、根、花、葉、植物的一部分，或整株植物上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物易受禾谷鐮刀菌感染。在一些其他優(yōu)選實(shí)施方案中，該植物為小麥植物、玉米植物、大麥植物，或燕麥植物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明微生物菌株或其培養(yǎng)物被確定為植物上的內(nèi)生菌。
[0019]本發(fā)明的另一個(gè)進(jìn)一步方面提供了非天然產(chǎn)生的植物。非天然產(chǎn)生的植物經(jīng)受本發(fā)明微生物菌株或其培養(yǎng)物的人工感染。在這個(gè)方面的一些優(yōu)選實(shí)施方案中進(jìn)一步提供了非天然產(chǎn)生的植物的種子、生殖組織、營養(yǎng)組織、植物部件和子代。
[0020]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了制備農(nóng)業(yè)組合物的方法。該方法涉及將根據(jù)本發(fā)明的微生物菌株或其培養(yǎng)物接種到底土層(substratum)中或底土層上,并讓它在1_37°C的溫度下生長直至獲得許多的、每毫升或每克至少IO2-1O3個(gè)的細(xì)胞或孢子。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其他目的和特征將變得更為顯而易見。
[0022]發(fā)明詳述
[0023]一勝定 SI
[0024]除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語、符號(hào)及其他科學(xué)術(shù)語或?qū)ｉT名詞意圖具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。在一些情況下，具有通常理解的含義的術(shù)語在本文中出于清楚和/或便于參考的目的加以定義，并且在本文中納入此類定義應(yīng)不必解釋為代表與本領(lǐng)域中一般理解的含義有實(shí)質(zhì)性差異。本文描述或提及的許多技術(shù)和程序是熟知的并且通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用常規(guī)方法加以采用。
[0025]除非上下文另 外明確規(guī)定，否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該(所述)”包括復(fù)數(shù)指代。例如，術(shù)語“細(xì)胞”包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，包括它們的混合物。
[0026]在本文可互換使用的關(guān)于微生物體的措辭“拮抗微生物體”和“微生物拮抗劑”，意圖意指受試者菌株表現(xiàn)出的赤霉病病害的抑制程度以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的水平超過未經(jīng)處理的對(duì)照。
[0027]抗生素:如本文所使用的術(shù)語“抗生素”是指能夠滅殺微生物體或抑制微生物體的生長的任何物質(zhì)?？股乜梢酝ㄟ^以下任一種或多種方式生產(chǎn):1)微生物體、2)合成工藝，或3)半合成工藝?？股乜梢允欠置趽]發(fā)性有機(jī)化合物的微生物體。此外，抗生素可以是由微生物體分泌的揮發(fā)性有機(jī)化合物。
[0028]殺細(xì)菌:如本文所使用的術(shù)語“殺細(xì)菌”是指組合物或物質(zhì)增加細(xì)菌的死亡率或抑制細(xì)菌的生長速率的能力。對(duì)細(xì)菌生長速率的抑制通?？闪炕癁殡S著時(shí)間的推移能存活的細(xì)菌細(xì)胞的減少。
[0029]生物防治:如本文所使用的術(shù)語“生物防治”和其縮寫形式“生物防治(biocontrol) ”被定義為使用至少一種除人以外的第二生物體來防治病原體或昆蟲或任何其他不期望的生物體。已知的生物防治機(jī)制的實(shí)例是使用通過與真菌爭奪根表面上的空間而防治根腐病的微生物體或抑制病原體生長或滅殺病原體的微生物體。在生物防治的上下文中的“寄主植物”是易受病原體引起的病害感染的植物。在將諸如真菌物種的生物體從其天然環(huán)境分離出來的上下文中，“寄主植物”是支持真菌生長的植物，例如真菌作為內(nèi)生菌的物種的植物。
[0030]如本文所使用的術(shù)語“谷類”意圖指可能易受赤霉病病害感染的任何谷類物種。報(bào)道易受感染的谷類包括小麥、大麥、燕麥和黑小麥，盡管小麥和大麥?zhǔn)沁@種病害在其中帶來顯著經(jīng)濟(jì)問題的兩種作物。
[0031]“有效量”是指足以影響有益或所需結(jié)果的量。就病害管理、治療、抑制或保護(hù)來說，有效量是足以阻抑、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延遲靶標(biāo)感染或病害狀態(tài)的進(jìn)展的量。因此，措辭“有效量”在本文中用于指相對(duì)于未經(jīng)處理的對(duì)照中發(fā)生的情況獲得病原體發(fā)育水平的降低和/或病原性病害水平的降低所必需的拮抗劑處理劑的量。通常，給定拮抗劑處理劑的有效量在合適的處理?xiàng)l件下提供了相對(duì)于未經(jīng)處理的對(duì)照中發(fā)生的病害水平和/或病原體發(fā)育水平的至少20%，或更通常介于30%至40%之間，更通常介于50-60%之間，甚至更通常介于70%至80%之間，以及甚至更通常介于90%至95%之間的降低。有效量可以在一次或多次施用中施用。液體制劑的實(shí)際施加速率范圍將通常在最小約I X IO3至約I X IOltl能存活細(xì)胞/mL，優(yōu)選在約I X IO6至約5 X IO9能存活細(xì)胞/mL。在大多數(shù)情況下，下面實(shí)施例中描述的本發(fā)明拮抗微生物菌株在范圍為約IX IO6至IX IO9能存活細(xì)胞/mL的施加速率下將是最佳有效的，假定施加模式將實(shí)現(xiàn)與至少約50%的植物組織基本上均勻地接觸。如果拮抗劑作為固體制劑來施加，則應(yīng)該控制施加速率以使得每單位面積的植物組織表面的能存活細(xì)胞數(shù)量與通過前述的液體處理速率獲得的數(shù)量相當(dāng)。通常，當(dāng)以超過106CFU/g(菌落形成單位/克)，優(yōu)選超過107CFU/g，更優(yōu)選108CFU/g，最優(yōu)選109CFU/g的濃度遞送時(shí)，本發(fā)明的生物防治劑是生物上有效的。
[0032]進(jìn)一步地，如本文使用的關(guān)于微生物體的措辭“有效微生物拮抗劑”意圖意指受試者微生物菌株表現(xiàn)出的赤霉病病害的抑制程度以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的水平超過未經(jīng)處理的對(duì)照的水平。通常，有效的微生物拮抗劑在合適的處理?xiàng)l件下具有實(shí)現(xiàn)相對(duì)于未經(jīng)處理的對(duì)照中發(fā)生的病害水平和/或病原體發(fā)育水平的至少20%，或更通常介于30%至40%之間，更通常介于50-60%之間，甚至更通常介于70%至80%之間，以及甚至更通常介于90%至95%之間的降低的能力。
[0033]組合物:“組合物”意圖表示活性劑與至少另一種化合物、載體或組合物的組合，所述至少另一種化合物、載體或組合物是惰性的(例如，可檢測試劑或標(biāo)記或液體載體)或活性的，諸如殺蟲劑。
[0034]分離的微生物菌株、分離的培養(yǎng)物、生物上純的培養(yǎng)物和富集培養(yǎng)物:如本文所使用的，如應(yīng)用于微生物體(例如，細(xì)菌或微真菌)上的術(shù)語“分離的”是指已從其天然產(chǎn)生的環(huán)境中移出和/或純化出的微生物體。因此，如本文所使用的微生物的“分離菌株”是指已從其天然的周圍環(huán)境中移出和/或純化出的菌株。因而，“分離的微生物體”不包括寄居在其天然產(chǎn)生的環(huán)境中的微生物體。進(jìn)一步地，術(shù)語“分離的”未必反映微生物純化的程度。微生物菌株的“實(shí)質(zhì)上純的培養(yǎng)物”是指實(shí)質(zhì)上不含除所需的一種或多種微生物菌株以外的其他微生物的培養(yǎng)物。換句話說，微生物菌株的實(shí)質(zhì)上純的培養(yǎng)物實(shí)質(zhì)上不含其他污染物，所述污染物可以包括微生物污染物以及不期望的化學(xué)污染物。進(jìn)一步地，如本文所使用的，“生物上純的”菌株意圖表示與在自然界通常與其相關(guān)聯(lián)的物質(zhì)分離的菌株。應(yīng)注意，與在自然界通常未發(fā)現(xiàn)的其他菌株或化合物或物質(zhì)相關(guān)聯(lián)的菌株仍被定義為“生物上純的”。特定菌株的單一培養(yǎng)物當(dāng)然是“生物上純的”。如本文所使用的，術(shù)語分離的微生物菌株的“富集培養(yǎng)物”是指含有超過50%、60%、70%、80%、90%或95%的分離菌株的微生物培養(yǎng)物。
[0035] 如本文所使用的，“內(nèi)生菌”是在其生命期的至少一部分時(shí)間內(nèi)定居在植物內(nèi)而不引起明顯病害的內(nèi)生共體。內(nèi)生菌可垂直傳播(從親代直接傳播至后代)或水平傳播(從個(gè)體傳播至無親緣關(guān)系的個(gè)體)。垂直傳播的內(nèi)生真菌通常是無性的，并且經(jīng)由透入寄主種子的真菌菌絲從母體植物傳播至后代。內(nèi)生細(xì)菌也可以從種子垂直轉(zhuǎn)移至幼苗中(Ferreira等，2008)。相反地，水平傳播的內(nèi)生菌通常是有性的，并且經(jīng)由可被風(fēng)和/或昆蟲媒介擴(kuò)散的孢子傳播。作物植物的內(nèi)生菌由于它們的防治病害和昆蟲侵染以及促進(jìn)植物生長的能力而獲得相當(dāng)多的關(guān)注。
[0036]功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì):如本文所使用的短語“功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)”描述具有至少一種共同特征的那些蛋白質(zhì)。此類特征包括序列相似性、生物化學(xué)活性、轉(zhuǎn)錄模式相似性和表型活性。通常，功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)共享一些序列相似性或至少一種生物化學(xué)活性。在這個(gè)定義內(nèi)，同系物、直向同系物、旁向同系物和類似物被認(rèn)為是功能相當(dāng)?shù)摹Ａ硗?，功能相?dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)一般共享至少一種生物化學(xué)和/或表型活性。功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)將會(huì)引起類似，但未必相同的程度的相同性質(zhì)。通常，在定量測量時(shí)，由于功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)中的一者是另一者的至少20%，更通常介于30%至40%之間，甚至更通常介于50-60%之間，甚至更通常介于70%至80%之間，甚至更通常介于90%至95%之間，甚至更通常介于98%至100%之間，功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)給出相同的特征。
[0037]殺真菌:如本文所使用的，“殺真菌”是指組合物或物質(zhì)降低真菌的生長速率或增加真菌的死亡率的能力。
[0038]鐮刀菌屬真菌:為了本發(fā)明的目的，應(yīng)理解，術(shù)語鐮刀菌屬真菌的使用意圖包括這種生物體的有性(有性型)階段，并且還包括無性(無性型)階段，它們也分別稱為完全和非完全真菌階段。例如，禾谷鐮刀菌的變形階段是玉米赤霉菌，赤霉病病害的致病物。這種病害通常在當(dāng)花或種子頭部接種了分生孢子時(shí)發(fā)生，該分生孢子由子囊孢子的不完全形式產(chǎn)生，子囊孢子由這種真菌的完美形式產(chǎn)生。
[0039]突變體:如本文 所使用的，有關(guān)微生物體的術(shù)語“突變體”或“變異體”是指親代菌株的修飾，其中所需生物活性與親代菌株表達(dá)的生物活性類似。例如，在微桿菌屬的情況下，“親代菌株”在本文被定義為誘變之前的原始微桿菌屬菌株。突變體或變異體可以自然產(chǎn)生，無需人為干預(yù)。它們也可以通過用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和組合物處理獲得或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和組合物獲得。例如，親代菌株可用化學(xué)物諸如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍、乙基甲烷砜處理，或通過使用Y、X射線照射處理，或UV-照射處理，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他方式處理。
[0040]殺線蟲:如本文所使用的術(shù)語“殺線蟲”是指物質(zhì)或組合物增加線蟲的死亡率或抑制線蟲的生長速率的能力。
[0041]病原體:如本文所使用的術(shù)語“病原體”是指能夠在植物或動(dòng)物中產(chǎn)生疾病的生物體，諸如藻類、蛛形綱動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、昆蟲、線蟲、寄生植物、酵母菌、原生動(dòng)物或病毒。如本文所使用的術(shù)語“植物病原體”是指感染植物的病原性生物體。
[0042]同一性百分比:如本文所使用的“序列同一性百分比”是通過在比較窗口中比較兩個(gè)最佳局部比對(duì)的序列確定的，所述比較窗口由兩個(gè)序列之間的局部比對(duì)的長度限定。與用于兩個(gè)序列的最佳比對(duì)的參考序列(不包含添加或缺失)相比較，比較窗口中的氨基酸序列可包含添加或缺失(例如缺口或突出端)。兩個(gè)序列之間的局部比對(duì)僅包括根據(jù)取決于用來進(jìn)行比對(duì)的算法(例如BLAST)的標(biāo)準(zhǔn)視為足夠相似的每個(gè)序列的區(qū)段。如下計(jì)算同一性百分比:確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)目從而產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較窗口中的總位置數(shù)并將結(jié)果乘以100。比較用序列的最佳比對(duì)可通過Smith和Waterman (1981) Add.APL.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman 和 Wunsch (J.Mol.Biol.48:443，1970)的總體同源性比對(duì)算法、Pearson 和Lipman (Proc, Natl.Acad.Sc1.USA85:2444, 1988)的相似性搜索方法、這些算法的探試實(shí)施(NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ)或通過觀察來進(jìn)行。假設(shè)有兩個(gè)經(jīng)鑒定用于比較的序列，優(yōu)選使用GAP和BESTFIT確定它們的最佳比對(duì)。通常，使用默認(rèn)值缺口權(quán)重5.00和缺口權(quán)重長度0.30。多核苷酸或多肽序列之間的術(shù)語“基本序列同一性”是指這樣的多核苷酸或多肽，其包含使用該程序與參考序列相比較具有至少50%的序列同一性，優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列。
[0043] 可針對(duì)存在于公共或?qū)Ｓ袛?shù)據(jù)庫中的提交核酸或氨基酸序列搜索查詢核酸和氨基酸序列。此類搜索可使用 National Center for Biotechnology Information BasicLocal Alignment Search Tool (NCBI BLAST v2.18)程序完成。NCBI BLAST 程序可在因特網(wǎng)上從 National Center for Biotechnology Information (blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast, cgi)獲得。通常，可以使用以下的NCBI BLAST參數(shù):過濾選項(xiàng)設(shè)為“默認(rèn)”，比較矩陣設(shè)為“BL0SUM62”，缺口成本設(shè)為“存在:11，延伸:1”，字體大小設(shè)為3，預(yù)期值(E閾值)設(shè)為le-3，并且局部比對(duì)的最小長度設(shè)為查詢序列長度的50%。序列同一性和相似性也可以使用 GenomeQuest? 軟件(Gene-1T, Worcester Mass.USA)確定。
[0044]如本文所使用的術(shù)語“殺害蟲”是指物質(zhì)或組合物降低害蟲，即不期望生物體的生長速率，或增加害蟲的死亡率的能力。
[0045]生物防治劑對(duì)植物病原體的“阻抑活性”意指該藥劑阻抑、抑制、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延遲病原體本身的發(fā)育，或由病原體引起的感染或病害狀態(tài)的進(jìn)展的能力。
[0046]變異體:如本文所使用的關(guān)于微生物體的“變異體”是這樣的菌株，其具有它所屬的物種的識(shí)別特征，同時(shí)相對(duì)于親代菌株具有至少一種核苷酸序列變異或可識(shí)別的不同性狀，其中該性狀以基因?yàn)榛A(chǔ)(可遺傳的)。例如，對(duì)于具有殺真菌活性的微桿菌屬SG1-SG1-014-C06菌株，可識(shí)別的性狀包括I)阻抑禾谷鐮刀菌及其有性型玉米赤霉菌的生長的能力；2)阻抑赤霉病病害的發(fā)展的能力；3)具有與微桿菌屬SG1-014-C06的管家基因有大于95%、大于96%、大于97%、大于98%,或大于99%的序列同一性的管家基因，可用于證實(shí)變異體為微桿菌屬SG1-014-C06。
[0047]對(duì)于核酸和多肽，術(shù)語“變異體”在本文用于表示與參考多肽或多核苷酸相比較分別在其氨基酸或核酸序列上具有一些合成產(chǎn)生或天然產(chǎn)生的差別的多肽、蛋白質(zhì)或多核苷酸分子。例如，這些差別包括在參考多肽或多肽中的置換、插入、缺失或任何所需的此類變化的組合。多肽和蛋白質(zhì)變異體可進(jìn)一步由電荷變化和/或翻譯后修飾(諸如糖基化、甲基化、磷酸化等)組成。
[0048]本說明書中提及的所有出版物和專利申請都以引用的方式并入本文，引用程度如同每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埦痪唧w單獨(dú)地指出以引用的方式并入。
[0049]不承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)的論述陳述其作者所聲稱的內(nèi)容，本 申請人:保留質(zhì)疑所引用文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和相關(guān)性的權(quán)利。應(yīng)清楚地了解，盡管在本文中提及許多現(xiàn)有技術(shù)出版物，但是這種提及并不構(gòu)成對(duì)任何這些文獻(xiàn)形成本領(lǐng)域中公知常識(shí)的一部分的承認(rèn)。
[0050]分類學(xué)鑒定的方法
[0051]微生物體經(jīng)?？苫谥苯语@微鏡分析(檢查時(shí)樣品中的所有細(xì)胞是否看起來一樣)、染色特征、簡單分子分析(諸如簡單的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)測定)等辨別。除了如在本公開的實(shí)施例2-3中描述的此類分類學(xué)分析技術(shù)的說明性實(shí)例之外，微生物體的分類學(xué)鑒定還可涉及多達(dá)數(shù)種不同水平的分析，并且每種分析可基于生物體的不同特征。此類分類學(xué)分析可包括基于核酸的分析(例如，針對(duì)個(gè)別特定基因的關(guān)于它們的存在或它們的確切序列的分析，或者對(duì)具體基因或基因家族的表達(dá)的分析)、基于蛋白質(zhì)的分析(例如，在功能水平上使用直接或間接酶測定，或者在結(jié)構(gòu)水平上使用免疫檢測技術(shù))，等等。[0052]a.基于核酸的分析:本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，多種多樣的基于核酸的技術(shù)是已知的并且可用于獲得給定微生物體的分類學(xué)鑒定。這些技術(shù)可用來通過基因序列鑒定細(xì)胞或者可用來鑒定具有具體基因或基因家族的細(xì)胞。可用于分類學(xué)研究的常見基因家族包括16S基因家族、肌動(dòng)蛋白基因家族和重組酶A(recA)基因家族。這些方法通常包括從非常少數(shù)量的細(xì)胞中擴(kuò)增和測序基因，因此經(jīng)?？朔藦南♂尩膽腋∫簼饪s細(xì)胞及其DNA的問題。術(shù)語“核酸擴(kuò)增”一般是指增加樣品或樣本中核酸分子的拷貝數(shù)的技術(shù)?？捎糜诤怂釘U(kuò)增的技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的。核酸擴(kuò)增的實(shí)例是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中使從受試者收集的生物樣品與一對(duì)寡核苷酸引物在允許該引物與樣品中的核酸模板雜交的條件下接觸。將引物在合適的條件下延伸，從模板解離，并接著再退火，延伸并解離從而擴(kuò)增核酸的拷貝數(shù)?；铙w外擴(kuò)增技術(shù)的其他實(shí)例包括鏈置換擴(kuò)增、無轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增、修復(fù)鏈反應(yīng)擴(kuò)增、連接酶鏈反應(yīng)、缺口填充連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增、聯(lián)合的連接酶檢測和PCR，以及無RNA轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增。
[0053]除了本文提供的說明性實(shí)例引物之外，參見，例如，實(shí)施例2-3和序列表，對(duì)于個(gè)別物種或系統(tǒng)發(fā)育組的微生物體，也已經(jīng)照慣例地設(shè)計(jì)了引物并且新的引物正在不斷被設(shè)計(jì)。此類被狹窄靶向的引物可以與本文所描述的方法一起使用，從而僅特異性地篩選和/或鑒定感興趣的微生物體。
[0054]用于制備和使用核酸引物的方法描述在例如Sambrook等(見MolecularCloning:A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989), Ausubel 等(編著)(見 CurrentProtocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, New York, 1998)中。擴(kuò)增引物對(duì)可以來源于已知的序列，例如通過使用預(yù)期用于這一目的的計(jì)算機(jī)程序諸如Primer (WhiteheadInstitute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.)獲得。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解，具體探針或引物的特異性隨著它的長度而增加。因此，例如，包含rRNA編碼核苷酸或其側(cè)接區(qū)域的30個(gè)連續(xù)核苷酸的引物將退火至具有比僅15個(gè)核苷酸的對(duì)應(yīng)引物的特異性更高的特異性的靶標(biāo)序列。因此，為了獲得更高特異性，可以選擇包含諸如16S rRNA的靶標(biāo)核苷酸序列的至少20、25、30、35、40、45、50或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的探針和引物。
[0055]用于制備可用于核酸應(yīng)用(例如，PCR)的核酸的常見技術(shù)包括苯酚/氯仿提取或者使用在市場上可獲得的許多DNA提取試劑盒中的一種。可以進(jìn)行DNA擴(kuò)增的另一種方式是通過將細(xì)胞直接添加至核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物中并且依靠擴(kuò)增的變性步驟來裂解細(xì)胞和釋放DNA。[0056]核酸擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域中熟知的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)一步表征，這些技術(shù)包括電泳、限制性核酸內(nèi)切酶酶切圖譜、寡核苷酸雜交或連接，和/或核酸測序。當(dāng)雜交技術(shù)用于細(xì)胞鑒定目的時(shí)，多種探針標(biāo)記方法可能是有用的，包括熒光標(biāo)記法、放射性標(biāo)記法和非放射性標(biāo)記法。當(dāng)使用核酸測序技術(shù)時(shí)，可以使用各種已知序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行經(jīng)擴(kuò)增核酸分子的核苷酸序列的同系物搜索，所述數(shù)據(jù)庫包括但不限于DDBJ/GenBank/EMBL 數(shù)據(jù)庫。
[0057]b.基于蛋白質(zhì)的分析:除了核酸的分析之外，還可以直接基于特定蛋白質(zhì)的存在(或不存在)在分類學(xué)上表征和鑒定微生物體。此種分析可以是基于具體指定的蛋白質(zhì)的活性，例如通過酶測定或通過共培養(yǎng)的生物體的反應(yīng)，或通過具體指定的蛋白質(zhì)的單獨(dú)存在(其例如可以使用免疫學(xué)方法諸如原位免疫熒光抗體染色來測定)。
[0058]酶測定:舉例來說，可以將熒光或發(fā)色底物類似物包括進(jìn)生長培養(yǎng)基(例如，微量滴定板培養(yǎng)物)中，接著進(jìn)行溫育并針對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行篩選，從而基于它們的酶活性來鑒定培養(yǎng)物。
[0059]共培養(yǎng)反應(yīng):在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以基于共培養(yǎng)生物體(例如報(bào)告生物體)的反應(yīng)(或反應(yīng)程度)來測定由微生物分離株攜帶的酶的活性。
[0060]還可以使用多種方法通過使至少一種抗體或抗體來源分子結(jié)合至微生物體的分子或更具體地分子的表位來鑒定從源環(huán)境中選擇和分離的微生物體。
[0061]抗微生物體蛋白質(zhì)抗體可以使用描述于許多教科書中的標(biāo)準(zhǔn)程序來產(chǎn)生，所述教科書包括 Harlow 和 Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988) ? 可以通過使用常規(guī)程序或通過修改常規(guī)程序來容易地確定特定試劑實(shí)質(zhì)上僅結(jié)合至所需微生物體的蛋白質(zhì)。一種合適的活體外測定利用了蛋白質(zhì)印跡程序(描述于許多標(biāo)準(zhǔn)教科書中，包括 Harlow 和 Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988))。
[0062]更短的抗體片段(抗體來源分子,例如FAb、Fv和單鏈Fv (SCFv))也可以用作特異性結(jié)合試劑。制備這些片段的方法是常規(guī)的。
[0063]與本發(fā)明陣列上的細(xì)胞結(jié)合的抗體的檢測可以使用提供可檢測的信號(hào)例如熒光或發(fā)光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如ELISA測定。
[0064]本發(fā)明的分離的培養(yǎng)物
[0065]如在本公開的實(shí)施例部分中更詳細(xì)描述的， 申請人:已發(fā)現(xiàn)數(shù)種農(nóng)業(yè)上有益的新型微生物體，例如，赤霉病病害的有效阻抑劑。具體地，這些新型拮抗微生物體對(duì)于降低赤霉病的嚴(yán)重性以及對(duì)于抑制小麥赤霉病病害的主要致病物禾谷鐮刀菌的生長有效。從具有大約5，000個(gè)微生物菌株的庫鑒定微生物拮抗劑，所述大約5，000個(gè)微生物菌株是從收集自美國不同地點(diǎn)的野生植物樣品中獲得的?；谠诨铙w外拮抗測定中拮抗微生物體阻抑禾谷鐮刀菌病原體及其有性型玉米赤霉菌的發(fā)育的能力，對(duì)該微生物體進(jìn)行初步選擇。然后，針對(duì)微生物菌株降低真菌感染的嚴(yán)重性的能力及針對(duì)它們維護(hù)種子產(chǎn)量的能力，在溫室研究中在小麥幼苗上對(duì)所選擇的微生物拮抗劑進(jìn)行生物測定，其涉及給幼苗接種微生物菌株，接著重復(fù)接種禾谷鐮刀菌孢子。發(fā)現(xiàn)以這種方式選擇的拮抗微生物體在溫室試驗(yàn)中有效地降低赤霉病的嚴(yán)重性。
[0066] 分類學(xué)分析進(jìn)一步確定本公開中描述的每種拮抗微生物體均是具有近親緣關(guān)系的細(xì)菌的微桿菌屬、細(xì)菌的芽孢桿菌屬、細(xì)菌的貪噬菌屬，或真菌的球腔菌屬。[0067]微桿菌屬是微桿菌科的典型屬，一般被認(rèn)為提供革蘭氏陽性、不形成孢子、呈桿狀的細(xì)菌，其最初在產(chǎn)乳酸細(xì)菌的早期研究期間分離出來。微桿菌屬成員最初的主要特征是它們的顯著耐熱性、存在于乳制品中，及從葡萄糖產(chǎn)生少量L(+)乳酸。與其中物種以相關(guān)肽聚糖類型為特征的微桿菌科的其他屬相比，微桿菌屬物種在肽間橋中或在B型肽聚糖的3位處具有鳥氨酸或賴氨酸。在諸如類異戊二烯醌(MK-11、MK-12、MK-13)、極性脂質(zhì)、脂肪酸及DNA堿基組成的其他化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)中，該屬的成員表現(xiàn)出在微桿菌科的其他屬中發(fā)現(xiàn)的通常的多樣性范圍。微桿菌屬和金桿菌屬這兩個(gè)細(xì)菌屬可以根據(jù)一些分類學(xué)研究聯(lián)系起來。迄今為止，微桿菌屬的成員包含至少33個(gè)物種，它們已從包括土壤、乳制品、植物蟲癭、昆蟲或臨床標(biāo)本在內(nèi)的廣泛范圍的生境分離出來。Evtushenko和Takeuchi (2006)最近概述了它們的生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育、分類學(xué)、培養(yǎng)方法和長期保存條件的各個(gè)方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易了解可以主要通過以下任一項(xiàng)技術(shù)在分類學(xué)上鑒定微桿菌屬的微生物體:包括細(xì)胞壁肽聚糖的化學(xué)分類學(xué)分析在內(nèi)的上文描述的分類學(xué)鑒定技術(shù)，及如Evtushenko和Takeuchi (2006)和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的16S rDNA序列比較分析，以及本公開的實(shí)施例2-3中描述的那些。如下面詳細(xì)論述的，迄今為止，數(shù)種天然產(chǎn)生的微生物體已被報(bào)道具有對(duì)抗赤霉病病害的拮抗活性。然而，在本發(fā)明之前沒有描述具有此種拮抗活性的微桿菌屬微生物體的報(bào)道。進(jìn)一步地，在本發(fā)明之前，本發(fā)明人沒有獲悉使用微桿菌屬細(xì)菌菌株作為生物防治劑來預(yù)防、抑制或治療赤霉病病害的致病病原體的發(fā)育的任何方法或工藝。
[0068]芽孢桿菌屬是革蘭氏陽性/可變、形成孢子、呈桿狀的細(xì)菌的屬。與和微生物學(xué)早期歷史相關(guān)的其他屬諸如假單胞菌屬或弧菌屬類似，芽孢桿菌屬的將近266個(gè)物種成員遍在地存在，并且它被廣泛地認(rèn)為是具有最大16S多樣性和環(huán)境多樣性的屬之一。芽孢桿菌屬物種可以是專性需氧菌或兼性厭氧菌，并且對(duì)過氧化氫酶測試呈陽性。芽孢桿菌屬在自然界遍在地存在，既包括獨(dú)立生存的物種，又包括病原物種。在應(yīng)激的環(huán)境條件下，細(xì)胞產(chǎn)生可保持長時(shí)間休眠的橢圓形內(nèi)生孢子。這些特征最初定義了該屬，但是并非所有此類物種都具有近親緣 關(guān)系并且許多被轉(zhuǎn)移至其他屬。事實(shí)上，數(shù)項(xiàng)研究已試圖重建該屬的系統(tǒng)發(fā)育。覆蓋有最大多樣性的芽孢桿菌屬特定研究由Xu和Cote [Intl.J.0f Syst.Evol.Microbiol.53(3): 695-704; 2003]使用16S和ITS區(qū)進(jìn)行，在這里該屬被分成10個(gè)組，包括嵌套(nested)的類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短小芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)、海洋芽孢桿菌屬(Marinibacillus)和枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)0然而，根據(jù)更新的研究，芽孢桿菌屬含有非常大的數(shù)量的嵌套分類群且尤其在16S和23S中，它由于Bacillus coahuilensis和其他而被認(rèn)為是乳桿菌目(乳桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、李斯特菌屬等)的并系群(參見,例如,Yarda等,Syst.Appl.Microbiol.31(4): 241-250，2008 ;Yarda等，Syst.Appl.Microbiol.33 (6): 291-299，2010]。在目前分類標(biāo)準(zhǔn)下由炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)、臘狀芽孢桿菌(B.cereus)、蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)、假蕈狀芽孢桿菌(B.pseudomycoides)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)和韋氏芽抱桿菌(B.weihenstephanensis)形成的一個(gè)特定分支應(yīng)當(dāng)是單一物種(在97%的16S同一性內(nèi))，但是由于醫(yī)學(xué)原因，它們被認(rèn)為是分開的物種。除了本公開的實(shí)施例2-3中描述的分類學(xué)分析方法之外，芽孢桿菌屬物種的系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)分析還可以通過多種技術(shù)進(jìn)行，所述技術(shù)包括在Xu和Cote, 2003 ；Yarda等,2008 ；Yarda等，2010中詳細(xì)論述的那些。
[0069]貪曬菌屬最初是通過將爭論產(chǎn)堿菌(Alcaligenes paradoxus)再分類為爭論貪曬菌(Variovorax paradoxus) (Willems等，1991)而創(chuàng)建的，爭論貪卩遼菌被廣泛地認(rèn)為是這個(gè)屬的典型物種。爭論貪噬菌作為新型生物降解劑以及微生物/微生物相互作用和微生物/植物相互作用的模型得到廣泛研究。其他物種包括V.dokdonensis、V.soli (Kim等，2006)和V.boronicumulans (Miwa等，2008)。貪噬菌屬物種在分解代謝上是非常多樣的并且與其他細(xì)菌物種以互利相互作用的方式參與許多生物降解，并因此具有生態(tài)重要性和高應(yīng)用潛力。例如，土壤甲烷營養(yǎng)菌(soilmethanotroph)僅在與爭論貪噬菌菌株一起共培養(yǎng)時(shí)才表現(xiàn)出對(duì)甲烷(非常強(qiáng)烈的溫室氣體)的高親和力，并且這種性狀在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物中通常觀察不到。類似地，已發(fā)現(xiàn)貪噬菌屬的近親屬為光合營養(yǎng)聚生體“聚生染綠菌(Chlorochromatium aggregatum) ”內(nèi)的核心非光合成伴侶。貪曬菌屬的一些物種也具有干擾其他細(xì)菌通訊的能力。貪噬菌屬的另一些其他物種可以與各種生態(tài)系統(tǒng)中的其他生物群(例如，植物)緊密地相互作用。而且，一些寄居于剛好在植物根部外面和/或在植物內(nèi)的區(qū)域中的貪噬菌屬物種已被報(bào)道能夠經(jīng)由以下方式促進(jìn)植物生長:減少乙烯的水平、阻遏群體感應(yīng)控制的發(fā)病機(jī)制，及增加對(duì)重金屬的抵抗力，這些大大有利于植物修復(fù)。除了本公開的實(shí)施例2-3中描述的分類學(xué)分析方法之外，貪噬菌屬物種的系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)分析還可以通過包括本文其他地方詳細(xì)論述的技術(shù)在內(nèi)的多種技術(shù)進(jìn)行。
[0070]球腔菌屬是非常大的真菌屬，具有超過2，000個(gè)物種名稱和至少500個(gè)與多于40個(gè)無性型屬(尤其尾孢菌屬(Cercospora)、假尾孢菌屬(Pseudocercospora)、殼針孢屬(Septoria)、柱隔孢屬(Ramularia)等)相關(guān)的物種。另外，數(shù)千個(gè)無性型缺乏有性型。球腔菌屬包括作為病原體、污水生物、內(nèi)生菌，或具有共生關(guān)系的物種。它們的生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育、分類學(xué)、培養(yǎng)方法和長期保存條件的各個(gè)方面最近已被報(bào)道(參見，例如，Crous等，Persoonia, 23:119-146，2009)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易了解可通過上文描述的任何分類學(xué)技術(shù)或它們的組合 在分類學(xué)上鑒定球腔菌屬的微生物體。最常用的技術(shù)包括如在例如Crous 等，Studies in Mycology, 55:235-253，2006 ;Crous 等，2009,同上文；Goodwin 等，Phytopathology 91: 648-658，2001描述的使用16S rDNA序列和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列比較分析；及本公開的實(shí)施例2-3中描述的那些。
[0071]生物材料的保藏
[0072]已經(jīng)依據(jù)用于專利程序的布達(dá)佩斯條約和其下的規(guī)定(布達(dá)佩斯條約)，將鑒定出具有對(duì)抗赤霉病病害的阻抑活性的純化的微生物菌株培養(yǎng)物保藏于農(nóng)業(yè)研究服務(wù)培養(yǎng)物保藏中心(位于 1815N.University Street, Peoria, IL61604, USA) (NRRL)。這些保藏物的登錄號(hào)如下:
[0073]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的微生物菌株,其選自由微桿菌屬菌株、芽孢桿菌屬菌株、球腔菌屬菌株和貪噬菌屬菌株組成的組，其中所述微生物菌株具有對(duì)抗赤霉病病害的阻抑活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的微生物菌株，其中所述微生物菌株選自由以下組成的組:球腔菌屬菌株SG1-010-H11(保藏號(hào)為NRRL50471)、微桿菌屬菌株SG1-014-C06 (保藏號(hào)為NRRL B-50470)、微桿菌屬菌株SG1-005-G08 (保藏號(hào)為NRRL_-—)、貪噬菌屬菌株SG1-014-G01 (保藏號(hào)為NRRL B-50469)、芽孢桿菌屬菌株SG1-015-F03 (保藏號(hào)為NRRLB-50760)、芽孢桿菌屬菌株SG1-015-H06(保藏號(hào) 為NRRL B-50761)，及其中任何一者的殺蟲活性變異體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的微生物菌株，其中所述微生物菌株包含與序列表中任何一個(gè)核苷酸序列展現(xiàn)至少85%的序列同一'丨生的DNA序列。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌株的生物上純的培養(yǎng)物。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌株的富集培養(yǎng)物。
6.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的微生物菌株或其培養(yǎng)物，及農(nóng)業(yè)上有效的量的選自由以下組成的組的化合物或組合物:殺螨劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、殺昆蟲劑、殺微生物劑、殺線蟲劑、殺害蟲劑和肥料。
7.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的微生物菌株或其培養(yǎng)物，及載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述載體為農(nóng)業(yè)上可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述載體為植物種子。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述組合物被制備成選自由以下組成的組的制劑:乳狀液、膠體、粉狀物、顆粒劑、小丸劑、粉劑、噴灑劑、乳狀液和溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述組合物為種子包衣制劑。
12.—種種子，其具有包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物的包衣。
13.—種預(yù)防、抑制或治療植物病原體的發(fā)育的方法，其中所述方法包括在寄主植物的生長培養(yǎng)基或土壤中的寄主植物生長之前或與其同時(shí)，讓根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的微生物菌株或其培養(yǎng)物在所述生長培養(yǎng)基或土壤中生長。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述植物病原體引起赤霉病病害。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述植物病原體為禾谷鐮刀菌。
16.一種預(yù)防、抑制或治療植物赤霉病病害的發(fā)展的方法，其中所述方法包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的微生物菌株或其培養(yǎng)物施加至所述植物上，或施加至所述植物的周圍環(huán)境中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中將所述微生物菌株或其培養(yǎng)物施加至土壤、種子、根、花、葉、植物的一部分，或整株植物上。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述植物易受禾谷鐮刀菌感染。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述植物為小麥植物、玉米植物、大麥植物，或燕麥植物。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述微生物菌株或其培養(yǎng)物被確定為在所述植物上的內(nèi)生菌。
21.一種非天然產(chǎn)生的植物，其是用根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的微生物菌株或其培養(yǎng)物進(jìn)行人工感染的植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的非天然產(chǎn)生的植物的種子、生殖組織、營養(yǎng)組織、植物部件，或子代。
23.—種制備農(nóng)業(yè)組合物的方法，其中所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的微生物菌株或其培養(yǎng)物接種到底土層中或底土層上，并讓所述微生物菌株或其培養(yǎng)物在1_37°C的溫度下生長直至獲得許多的、每毫升或每克至少IO2-1O3個(gè)的細(xì)胞或孢子。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103974620SQ201280046495
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月25日
【發(fā)明者】C·J·格蘭德利克, W·A·格林, J·S·克羅沃, R·T·麥卡恩 申請人:孟山都技術(shù)公司