一種解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法包括如下步驟：①固體平板培養(yǎng)；②液體搖瓶培養(yǎng)；③種子液的制備；④發(fā)酵液的制備；⑤發(fā)酵液濃縮；⑥濃縮液噴霧干燥；⑦200億活孢子/克解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑的制備。解淀粉芽孢桿菌用于防治煙草、番茄和辣椒等作物的青枯病，應用于農(nóng)業(yè)對人畜安全性高、環(huán)境相容性好、有害生物不易產(chǎn)生抗藥性，污染較小。
【專利說明】一種解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法及用途

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法及用途。

【背景技術】
[0002]青枯病是由青枯雷爾氏菌，又稱茄料雷爾菌引起的世界范圍的細菌性土傳病害。病原菌極易從根系、莖部傷口侵人植株，進而危害整個維管系統(tǒng)引起植株萎蔫枯死。該病原菌有著廣泛的寄主范圍及地理分布，可侵染50多個種的300多種植物，包括許多具有重要經(jīng)濟價值的栽培植物，其中煙草、馬鈴薯、花生、番茄、玉米、甘薯、茄子、辣椒、香蕉、草墓、桑、木麻黃、油橄欖、聚合草惟及一些貴重藥材和花卉等植物受害最為嚴重，給作物生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失。特別是煙草，我國是煙草種植和消費大國，也是最重要的經(jīng)濟植物之一。
[0003]長期以來，煙草青枯病等作物的細菌性病害防治均以農(nóng)用鏈霉素等抗生素類農(nóng)藥為主，這類農(nóng)藥防效不穩(wěn)定，見效慢且難以達到理想的防效，更重要的是，隨著人類安全認識的不斷提升，我國已從2008年始禁止各種抗生素類和劇毒用于人和動物，高毒類農(nóng)藥應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，從而造成了防治煙草等作物細菌性病害農(nóng)藥的嚴重缺乏。在微生物防治逐漸成為植物病害防治研究熱點的今天，研究開發(fā)和利用微生物農(nóng)藥來防治煙草等作物的細菌性病害無疑是最佳出路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種能用于防治煙草青枯病的解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法。
[0005]為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種解淀粉芽孢桿菌，其保藏名稱為:Baeillus amgloliquefaciens。
[0006]本發(fā)明從秦嶺烤煙葉面上分離得到一株優(yōu)勢芽孢桿菌作為試驗菌種，對其進行了16SrRNA、atPA基因序列分析，鑒定結果表明，該細菌屬于解淀粉芽孢桿菌，其分類命名為Bacillus amgloliquefaciens。
[0007]進一步的，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amgloliquefaciens)的形態(tài)學和生理化性質(zhì)特征為:菌體呈桿狀，革蘭氏陽性，芽孢橢園形，中生或端生，不膨大，大小為
0.7-0.8 μ m，長2-3 μ m.。常規(guī)生理生化實驗表明，是好氧菌，接觸酶，氧化酶，VP試驗呈陽性，在7%的NaCl中生長，PH5.7生長，水解淀粉，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽。
[0008]本發(fā)明提供了上述解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
(I)固體平板培養(yǎng):用接種環(huán)蘸取解淀粉芽孢桿菌在NA固體培養(yǎng)基上劃線接種，于30°C培養(yǎng)72小時，得到菌種I，所述菌種I能在4°C以下保存三個月。
[0009](2)液體搖瓶培養(yǎng):取一環(huán)菌種I接入裝有液體NA培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，于30°C、200r/min培養(yǎng)24小時，得到菌種II。
[0010](3)種子液的制備:根據(jù)種子量需要量，選用合適的三角瓶，按照0.05%-0.5%的比例向裝有液體NA培養(yǎng)基的三角瓶中接入菌種II，于30°C、200r/min培養(yǎng)24小時或更長時間，種子液的孢子數(shù)達到0.6X 19左右，即為種子液。
[0011](4)發(fā)酵液的制備:選用50L發(fā)酵罐，經(jīng)空消后加入自制培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為0.6，裝料30L，用蒸汽在121°C條件下實消0.5小時后，控制發(fā)酵溫度30土 1°C，通氣20-40L /min，轉(zhuǎn)速150-200r/min，接種量0.05%_1%，發(fā)酵40-48小時，發(fā)酵液孢子量為2 X 19個活孢子/ml時放罐，得解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液。
[0012]其中所述自制培養(yǎng)基的組分及其重量百分比為:酵母粉1%_3%，玉米粉1%_5%，葡萄糖0.8%-3%，氯化鈣0.1%-1%，豆柏粉1% -4%，消泡劑0.1-0.3%，其余為水。
[0013](5)發(fā)酵液濃縮:選用陶瓷膜過濾濃縮，膜孔徑0.05-0.2 μ m，膜面積0.2-0.5 m2，將上述發(fā)酵液27kg進行膜過濾，得濃縮液7.0kgo
[0014](6)濃縮液噴霧干燥:選用每小時脫水量為3kg的離心噴霧干燥塔，將濃縮液7.0kg進行噴霧干燥，進風溫度120-220°C，出風溫度60-90°C，約三小時后可得干粉370克，即為解淀粉枯草芽孢桿菌母藥，其孢子量為2X 111個活孢子/克。
[0015](7)200億活孢子/克解淀粉芽孢桿菌可濕性粉的制備:將上述解淀粉芽孢桿菌母藥和各種助劑進行混合，經(jīng)氣流粉碎后得到200億活孢子/克解淀粉芽桿菌可濕性粉劑產(chǎn)品O
[0016]本發(fā)明的有益效果是:解淀粉芽孢桿菌，能產(chǎn)生芽孢，具有極強的抗逆性，應用于農(nóng)業(yè)對人畜安全性高、環(huán)境相容性好、有害生物不易產(chǎn)生抗藥性，污染較小。

【具體實施方式】
[0017]下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。
[0018]實施例1:解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法 1.1解淀粉芽孢桿菌種子液的獲得:
1.1.1解淀粉芽孢桿菌菌種活化:用接種環(huán)挑取
三環(huán)解淀粉芽孢桿菌凍干菌種于250ml三角瓶中，采用NA培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)18h。
[0019]NA培養(yǎng)基配方:蛋白胨10克，牛肉膏3克，Nacl5克，瓊脂 15 克，蒸餾水 1000ml, PH 值 7.3。
[0020]1.1.2劃線法固體平板培養(yǎng):在NA培養(yǎng)基平板上30 V培養(yǎng)，培養(yǎng)72-120小時，長出單菌落。
[0021]1.1.3試管斜面培養(yǎng):NA試管斜面，挑取上述單菌落接于試管斜面，30°C培養(yǎng)72-96小時，直到孢子散落。
[0022]從上述試管斜面中選用較好的菌種，用無菌水將試管斜面種子沖洗，接于裝有NA培養(yǎng)基的750mL三角瓶中，于30°C、搖床轉(zhuǎn)速200r/min培養(yǎng)24-26小時，菌體含量達到0.6 X 19個/mL左右時，即可作為種子液。
[0023]1.2解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液的制備:
解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉2.8%，玉米淀粉1.4%，葡萄糖1.0%，氯化鈣0.3%，豆柏粉3.0%，消泡劑0.14%，其余為水，調(diào)節(jié)PH 8.1~8.3。
[0024]50升全自動控制不銹鋼發(fā)酵罐進行消毒:用蒸汽121°C消毒 I小時。
[0025]向發(fā)酵罐裝料:裝料系數(shù)為0.6，加入酵母粉840克，玉米淀粉420克，葡萄糖300克，氯化鈣90克，豆柏粉900克，消泡劑42克，加入自來水22升，通入蒸汽，于1211:消毒1.0小時，體積達30升，查無雜菌。
[0026]發(fā)酵最佳參數(shù):發(fā)酵溫度30± I°C，初始PH值為8.1~8.3，通
氣量為1: 1，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，接種量為1%，升溫至30°C，發(fā)酵46-48小時，孢子量為0.6X 1VmL時，即到終點，得26.5公斤的發(fā)酵液。
[0027]1.3發(fā)酵液的濃縮:
將26.5kg的發(fā)酵液裝入膜分離裝置的料液槽，采用孔徑為0.1 μ m的陶瓷膜，膜面積為
0.25 Hi2，開啟循環(huán)泵進行分離，循環(huán)3小時后得到7.0kg濃縮液。
[0028]1.4濃縮液噴霧干燥:
采用脫水量為3kg/h的離心式噴霧干燥塔，進風溫度140
V，出風溫度70°C，將7.0kg解淀粉芽孢桿菌濃縮液進行噴霧干燥，經(jīng)三小時得375g解淀粉芽孢桿菌母粉，經(jīng)檢測孢子量為3.4X 111活孢子/克的解淀粉芽孢桿菌母藥。
[0029]實施例2:解淀粉芽孢桿菌室內(nèi)抑菌試驗
選擇的病原菌有:煙草青枯病菌、辣椒瘡痂菌、柑桔瘡痂病菌、白菜軟腐病菌、水稻白葉枯病菌、辣椒根腐病菌、馬鈴薯環(huán)腐病菌、獼猴桃潰瘍病菌、菜豆細菌性疫病菌、黃瓜細菌性角斑病菌。
[0030]選用質(zhì)量體積比為100mg/L，10mg/L, lmg/L的解淀粉芽孢桿菌分別對上述病原菌進行抑菌試驗，試驗結果如下表1:
解淀粉芽孢桿菌的抑菌譜表1

【權利要求】
1.一種解淀粉芽孢桿菌，保藏名稱為:Bacillus amyloliquefaciens,其特征在于,解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amgloliquefaciens)的形態(tài)學和生理化性質(zhì)特征為:菌體呈桿狀，革蘭氏陽性，芽孢橢園形，中生或端生，不膨大，大小為0.7-0.8 μ m，長2-3 μ m。常規(guī)生理生化實驗表明，是好氧菌，接觸酶，氧化酶，VP試驗呈陽性，在7%的NaCl中生長，PH5.7生長，水解淀粉，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽； 進一步的，解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)方法包括以下步驟:
(I)固體平板培養(yǎng):用接種環(huán)蘸取解淀粉芽孢桿菌在NA固體培養(yǎng)基上劃線接種，于30°C培養(yǎng)72小時，得到菌種I。
(2)液體搖瓶培養(yǎng):取一環(huán)菌種I接入裝有液體NA培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，于30°C、200r/min培養(yǎng)24小時，得到菌種II。
(3)種子液的制備:根據(jù)種子量需要量，選用合適的三角瓶，按照0.05%-0.5%的比例向裝有液體NA培養(yǎng)基的三角瓶中接入菌種II，于30°C、200r/min培養(yǎng)24小時或更長時間，種子液的孢子數(shù)達到0.6X 19左右，即為種子液。
(4)發(fā)酵液的制備:選用50L發(fā)酵罐，經(jīng)空消后加入自制培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為0.6，裝料30L，用蒸汽在121 °C條件下實消0.5-1小時后，控制發(fā)酵溫度30±1°C，通氣20-40L /min，轉(zhuǎn)速150-200r/min，接種量0.05%_1%，發(fā)酵40-48小時，發(fā)酵液孢子量為2 X 19個活孢子/ml時放罐，得解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液。
(5)發(fā)酵液濃縮:選用陶瓷膜過濾濃縮，膜孔徑0.05-0.2 μ m,膜面積0.2-0.5 Ilf，將上述發(fā)酵液27kg進行膜過濾，得濃縮液7.0kgo
(6)濃縮液噴霧干燥:選用每小時脫水量為3kg的離心噴霧干燥塔，將濃縮液7.0kg進行噴霧干燥，進風溫度120-220°C，出風溫度60-90°C，約三小時后可得干粉370克，即為解淀粉枯草芽孢桿菌母藥，其孢子量約為2X 111個活孢子/克。
(7)200億活孢子/克解淀粉芽孢桿菌可濕性粉的制備:將上述解淀粉芽孢桿菌母藥和各種助劑進行混合，經(jīng)氣流粉碎后得到200億活孢子/克解淀粉芽桿菌可濕性粉劑產(chǎn)品O
2.根據(jù)權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于:所述的自制培養(yǎng)基的組分及其重量百分比為:酵母粉1%_3%，玉米粉1%_5%，葡萄糖0.8%-3%，氯化鈣0.1%-1%，豆柏粉1%-4%，消泡劑0.1%-0.3%，其余為水，調(diào)節(jié)PH 8.1~8.3。
3.根據(jù)權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于:所述的NA培養(yǎng)基配方:蛋白胨10克，牛肉膏3克，Nacl5克，瓊脂15克，蒸餾水1000ml，PH值7.3。
4.根據(jù)權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于:所述菌種I能在4°C以下保存三個月。
5.根據(jù)權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于:所述的解淀粉芽孢桿菌可以用于防治煙草、番茄和辣椒等作物的青枯病。
【文檔編號】A01N25/14GK104046576SQ201310083560
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月17日 優(yōu)先權日:2013年3月17日
【發(fā)明者】張海華, 黃帶輝, 張小平 申請人:江西順泉生物科技有限公司