防控香蕉枯萎病的生物制劑和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種防控香蕉枯萎病的生物制劑和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 香(大)蕉是單子葉植物綱、姜目、芭蕉科、芭蕉屬的植物，在世界范圍內(nèi)廣為分布， 主要分布于南北煒20°之間的熱帶亞熱帶地區(qū)，共有130多個(gè)國(guó)家和地區(qū)種植香蕉。香蕉 (Musa spp.)既是重要的經(jīng)濟(jì)作物也是重要的糧食作物，是全球僅次于柑橘的第二大水果； 也是位于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物(Moffat，1999;黃永紅，2011)。由尖孢鐮 刀菌古巴專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense)真菌引起的枯萎病(Fusarium wilt)在全球的大面積爆發(fā)和流行，已嚴(yán)重威脅香蕉產(chǎn)業(yè)并成為制約其可持續(xù)發(fā)展的主要 因素。目前該病在南太平洋、亞洲、非洲、澳洲、美洲熱帶、亞熱帶地區(qū)的香蕉種植園中普遍 發(fā)生(Butler，2013;Hwang et al.，2004)。在中國(guó)廣東、廣西、福建、云南、臺(tái)灣和海南等省 (區(qū)）等香蕉主產(chǎn)區(qū)發(fā)生日趨嚴(yán)重。香蕉枯萎病在蕉園的發(fā)病率為10%_40%，嚴(yán)重的可達(dá) 90%以上，以致蕉園丟荒(劉景梅等，2006)。
[0003] 根據(jù)香蕉枯萎病菌系統(tǒng)進(jìn)化演化分析與致病性實(shí)驗(yàn)證明，目前香蕉枯萎病菌分為 3個(gè)生理小種，24個(gè)營(yíng)養(yǎng)體親和群(￥068)(?1〇6以，2006)。其中，1號(hào)生理小種$〇〇1)侵染 "大密哈"Gros miche 1、Si lk、Taiwan Latundan、IC2和粉蕉，此小種呈世界性分布;2號(hào)生理 小種(Foe 2)侵染煮食蕉，如雜種三倍體Bluggoe，且僅局限在中美洲;4號(hào)生理小種(Foe 4) 侵染所有的Cavendish類(lèi)香蕉、Taiwan Latundan、Gros Michel、Pisang Lilin和Bluggoe (Hwang et al ·，2004;Ploetz，2000 ;Ploetz，2005)。3個(gè)生理小種中，以4號(hào)生理小種危害性 最大，幾乎可以侵染所有蕉種，導(dǎo)致植株枯萎死亡。4號(hào)生理小種根據(jù)溫度的適應(yīng)性不同可 分為兩個(gè)生態(tài)型：熱帶4號(hào)小種（Tropical race 4, TR4)和亞熱帶4號(hào)生理小種 (Subtropical race 4，STR4)，其中最具有毀滅性的生態(tài)型是熱帶4號(hào)小種(Foe TR4)，侵染 當(dāng)前的香蕉主栽品種Cavendish，其巨大的破壞力引起了廣泛的關(guān)注(Ploetz，2006)。目前 我國(guó)存在1號(hào)生理小種和4號(hào)生理小種。前者侵染粉蕉，后者侵染粉蕉和香蕉，尤其是熱帶4 號(hào)生理小種，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)。
[0004] 香蕉枯萎病菌有三種孢子類(lèi)型：大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子 (Pl〇etz，2000)。香蕉枯萎病是一種土傳病害，其孢子通常在土壤中潛伏，適宜條件下從香 蕉的根系侵入球莖或假莖，進(jìn)入植物維管束組織，通過(guò)阻塞水分及養(yǎng)分的供養(yǎng)，最終造成植 株整株枯死。而一旦土壤被香蕉枯萎病菌污染，在缺乏香蕉寄主的情況下，香蕉枯萎病菌也 可以在土壤中存活長(zhǎng)達(dá)30年之久(Li et al.，2011)，這就為有效地防治香蕉枯萎病帶來(lái)相 當(dāng)?shù)碾y度。而目前香蕉枯萎病的防治辦法主要是選育抗病品種、化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治及生物 防治等。盡管做了很多的探索，但到目前為止仍無(wú)有效的防控香蕉枯萎病發(fā)生的化學(xué)藥劑， 因此選育優(yōu)質(zhì)抗病新品種是最根本、最有效的解決辦法(Nel et al.，2007)。然而，香蕉的 栽培品種多為三倍體，通過(guò)傳統(tǒng)的香蕉雜交育種方法培育新品種十分困難。優(yōu)良栽培品種 中缺乏高抗種質(zhì)資源，目前生產(chǎn)上種植的的抗病品種主要是通過(guò)篩選體細(xì)胞突變體培育而 成，主要有"Formosana"（Hwang et al ·，2004)、"農(nóng)科一號(hào)"（劉紹欽等，2007)和"抗枯5號(hào)" (黃秉智等，2009)，這些抗病品種均存在這樣或那樣的缺點(diǎn)，如"抗枯5號(hào)"的抗病性雖好，但 生產(chǎn)周期過(guò)長(zhǎng)，果穗商品性不好，口感欠佳，經(jīng)濟(jì)效益差，不為廣大消費(fèi)者和蕉農(nóng)所接受。因 此，加強(qiáng)香蕉分子育種工作意義重大。香蕉枯萎病菌自身的發(fā)育調(diào)控機(jī)理不明，制約了香蕉 抗枯萎病分子育種工作的開(kāi)展。為解決香蕉枯萎病問(wèn)題，需要對(duì)香蕉枯萎病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育 的分子機(jī)理進(jìn)行研究，尋找新的靶標(biāo)位點(diǎn)，篩選、合成有效的化學(xué)或生物防治藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供防控香蕉枯萎病的方法。
[0006] 具體的，實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下。
[0007] 一種防控香蕉枯萎病的方法，包括針對(duì)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)生理小種麥角甾醇 生物合成過(guò)程中相關(guān)蛋白的基因或其相似基因進(jìn)行基因沉默調(diào)控。
[0008] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基因包括相關(guān)蛋白的編碼基因、該編碼基因前端 2000bp內(nèi)的非編碼區(qū)基因和/或該編碼基因末端2000bp內(nèi)的非編碼區(qū)基因；所述相似基因 為在隨機(jī)的50bp內(nèi)，與對(duì)應(yīng)的所述編碼基因或所述非編碼區(qū)基因的序列相似度2 80%的基 因。
[0009] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述相關(guān)蛋白包括3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A還原酶 HMG1、C-24固醇還原酶ERG4、C-24固醇甲基轉(zhuǎn)移酶ERG6、細(xì)胞色素 P450羊毛留醇C-14a-脫甲 基酶ERG11、羥甲基戊二酸-輔酶A合成酶ERG13、C-4固醇甲基氧化酶ERG25及C-3固醇脫氫酶 ERG26中的至少一種。
[0010] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述相關(guān)蛋白為C-24固醇甲基轉(zhuǎn)移酶ERG6和/或細(xì)胞色素 P450羊毛甾醇C-14a-脫甲基酶ERG11。
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述C-24固醇甲基轉(zhuǎn)移酶ERG6的編碼基因序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞色素 P450羊毛留醇C-14a-脫甲基酶ERG11的編碼 基因序列為SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基因沉默調(diào)控包括雙鏈RNA干擾、反義RNA干擾及小分 子RNA干擾中的至少一種。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的防控香蕉枯萎病的方法包括如下步驟：
[0015] 從至少一種所述相關(guān)蛋白的基因或其相似基因中選取特異性核苷酸序列片段進(jìn) 行自由串聯(lián)組合，構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為雙鏈RNA干擾載體、反義RNA干擾載體及小 分子RNA干擾載體中的至少一種；
[0016] 將含有所述表達(dá)框的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化香蕉植株，在香蕉植株內(nèi)組成性的表達(dá)雙鏈 RNA、反義RNA或小分子RNA;或者
[0017] 將含有所述表達(dá)框的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化香蕉內(nèi)生菌或生防菌，再通過(guò)所述香蕉內(nèi)生菌 或生防菌對(duì)香蕉植株進(jìn)行生物防治。
[0018] 本發(fā)明利用最新的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和香蕉遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，鑒定和驗(yàn)證了香蕉 枯萎病菌熱帶4號(hào)生理小種早期發(fā)育的關(guān)鍵蛋白和重要的代謝途徑，研究結(jié)果可作為新殺 菌劑的開(kāi)發(fā)和寄主植物誘導(dǎo)基因沉默培育抗病新種質(zhì)的靶標(biāo)位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)麥角留醇生物 合成途徑中的相關(guān)蛋白的表達(dá)與香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)生理小種的發(fā)育具有重要的影響， 從而對(duì)該相關(guān)蛋白的基因或其相似基因進(jìn)彳丁基因沉默調(diào)控，可以有效抑制香焦枯委病菌熱 帶4號(hào)生理小種的發(fā)育，從而對(duì)香蕉枯萎病防控具有良好的效果。
[0019] 本發(fā)明的另一目的是提供防控香蕉枯萎病生物制劑。根據(jù)多靶標(biāo)位點(diǎn)自由組合， 可從上述香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)生理小種的靶標(biāo)基因所表達(dá)的蛋白中，選擇單個(gè)或多個(gè)蛋 白質(zhì)，設(shè)計(jì)藥物組合，用于香蕉枯萎病的化學(xué)防治。也可從上述香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)生理 小種的靶標(biāo)蛋白的編碼基因中，選擇單個(gè)或多個(gè)基因的特異性片段進(jìn)行自由組合，構(gòu)建寄 主植物誘導(dǎo)基因沉默的雙鏈RNA干涉載體、反義RNA干擾載體和小分子RNA干擾載體，進(jìn)行香 蕉遺傳轉(zhuǎn)化培育抗香蕉枯萎病新品系，或構(gòu)建產(chǎn)生雙鏈RNA、反義RNA或小分子RNA的表達(dá)載 體，轉(zhuǎn)入香蕉內(nèi)生菌或生防菌中，用此遺傳重組的香蕉內(nèi)生菌或生防菌進(jìn)行香蕉枯萎病的 生物防治。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到編碼基因前端的5'非編碼區(qū)域和末端3'非編碼區(qū)域都能調(diào)節(jié) 基因的表達(dá)，在上述編碼基因前端和末端2000bp內(nèi)的非編碼區(qū)域進(jìn)行基因調(diào)控，也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0020] 具體的，實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0021] -種防控香蕉枯萎病的生物制劑，其活性成分包括針對(duì)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)生 理小種麥角留醇生物合成過(guò)程中相關(guān)蛋白的基因或其相似基因所構(gòu)建的雙鏈RNA干涉載 體、反義RNA干擾載體或小分子RNA干擾載體，所述雙鏈RNA干涉載體、反義RNA干擾載體或小 分子RNA干擾載體能導(dǎo)致靶標(biāo)編碼基因沉默。
[0022] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基因包括相關(guān)蛋白的編碼基因、該編碼基因前端 2000bp內(nèi)的非編碼區(qū)基因和/或該編碼基因末端2000bp內(nèi)的非編碼區(qū)基因；所述相似基因 為在隨機(jī)的50bp內(nèi)，與對(duì)應(yīng)的所述編碼基因或非編碼區(qū)基因的序列相似度2 80%的基因； 所述編碼基因包括序列如SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.5所示的基因中的至少一種。
[0023] 根據(jù)上述防控香蕉枯萎病的生物制劑，可進(jìn)行香蕉遺傳轉(zhuǎn)化培育抗香蕉枯萎病新 品系，或進(jìn)行香蕉內(nèi)生菌和生防菌遺傳轉(zhuǎn)化獲取防治香蕉枯萎病的新生防菌，其核苷酸序 列，屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到高度相似的核苷酸序列也能引發(fā)基因沉 默，若針對(duì)干擾上述基因表達(dá)的相似核苷酸序列，即與上述基因的開(kāi)放閱讀框、前端或末端 非編碼區(qū)核苷酸序列，在隨機(jī)的50bp內(nèi)，相似度2 80%的核苷酸序列，也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍內(nèi)。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1:本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和原理流程圖；
[0025]圖2:Foc TR4早期生長(zhǎng)發(fā)育的形態(tài)觀