一種裸花紫珠脫毒微繁方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種裸花紫珠脫毒微繁方法，涉及利用植物脫毒微繁殖及組織培養(yǎng)的方法，解決裸花紫珠繁殖周期長(zhǎng)、增殖效率低和成本高的問(wèn)題。方法：①外植體消毒；②無(wú)菌苗培養(yǎng)；③微枝培養(yǎng)，將增生的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)接于壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)；④增殖培養(yǎng)，將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1～2個(gè)腋芽進(jìn)行培養(yǎng)；⑤生根培養(yǎng)，待微枝生長(zhǎng)長(zhǎng)度為2.0～3.0cm，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中；⑥煉苗培養(yǎng)，將生根培養(yǎng)的裸花紫珠苗于蔭棚煉苗7～10d；⑦將經(jīng)過(guò)煉苗后裸花紫珠苗移栽于育苗杯，即完成裸花紫珠的脫毒微繁。本發(fā)明中裸花紫珠的脫毒微繁方法，具有繁殖周期短，增殖率高、苗木性狀一致、成本低、生根率和移苗成活率高、生長(zhǎng)周期不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種裸花紫珠脫毒微繁方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種裸花紫珠的組培快速繁殖的技術(shù)，本發(fā)明屬于種子種苗、農(nóng)業(yè)生 物技術(shù)和藥用植物栽培領(lǐng)域。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003] H繁HCallecarpa. nudiflora Hook, et Arn)為馬鞭草科紫珠屬植物，以 其干燥葉片入藥，收載于《中國(guó)藥典》1977年版。具有止血散瘀、抗菌消炎之功效，是裸花 紫珠片、裸花紫珠分散片、裸花紫珠膠囊、裸花紫珠顆粒、裸花紫珠栓等近40余種中成藥的 重要原料。由于裸花紫珠為重要的醫(yī)藥原料，野生資源破壞嚴(yán)重，采集野生資源已經(jīng)不能滿 足生產(chǎn)需要，開(kāi)展規(guī)范化生產(chǎn)是解決藥材短缺的有效途徑，而種苗繁育是規(guī)范化生產(chǎn)的重 要組成部分，由于裸花紫珠果實(shí)成熟周期較長(zhǎng)，種子成熟度不一，加上種子狹小，種皮堅(jiān)硬， 于是裸花紫珠種苗繁育周期較長(zhǎng)，出苗不一致，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需要，這使裸花紫珠在 我國(guó)境內(nèi)的推廣栽培和資源利用受到了極大的限制。
[0004] 利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立裸花紫珠脫毒微繁體系是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)裸花紫珠優(yōu)質(zhì)種 苗的有效途徑，其關(guān)鍵技術(shù)之一在于脫毒方法的建立、微枝培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，不 同激素組合及其濃度對(duì)此影響很大。CN102870678A公開(kāi)了一種組織培養(yǎng)快速繁殖裸花紫珠 的方法，通過(guò)利用扦插繁殖的裸花紫珠的新枝為外植體，進(jìn)行接種培養(yǎng)、擴(kuò)繁培養(yǎng)、生根培 養(yǎng)、煉苗移栽。國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到裸花紫珠果實(shí)外植體的組織培養(yǎng)、脫毒微繁等研究的報(bào)道， 本專(zhuān)利通過(guò)對(duì)脫毒方法的建立、微枝培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，建立了裸花紫珠種子外植 體的脫毒微繁方法，為裸花紫珠種苗的工業(yè)化生產(chǎn)的奠定了基礎(chǔ)。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決裸花紫珠繁殖周期長(zhǎng)、增殖效率低、成本高和遺傳穩(wěn)定 性差的問(wèn)題，而提供的一種低成本、穩(wěn)定一致、增殖效率高的裸花紫珠脫毒微繁方法。
[0007] 裸花紫珠的脫毒微繁方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)：①外植體消毒，將清洗后的裸花紫珠 果實(shí)外植體在超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30?60s后，然后用無(wú)菌 水沖洗3?5次，再用質(zhì)量濃度為0. 1%的氯化汞溶液消毒12?15min，然后用無(wú)菌水沖 洗3?5次；②無(wú)菌苗培養(yǎng)，將種子從消毒后的果實(shí)外植體中剝離出，接種于以改良MS固 體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. Of 0. 03mg/L的赤霉素、0. Of 0. 03 mg/L的NAA和質(zhì) 量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后在溫度為25?28°C、 濕度為70%?80%、光照強(qiáng)度為80?100 lx、光照8?10 h/d的條件下培養(yǎng)至無(wú)菌芽長(zhǎng)度 為0. 5?I. 0 cm ;③微枝培養(yǎng)，將增生的無(wú)菌芽一起轉(zhuǎn)接于以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng) 基，且還包含質(zhì)量濃度為0. 5?1. 0%的有機(jī)附加物，質(zhì)量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為 5. 6?6. 0的壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強(qiáng)度為50?70 lx、光照8?10 h/d的條件下培養(yǎng)至無(wú)菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為15. O?20. O cm,即為微枝；④增殖 培養(yǎng)，將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1?2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度為I. 0?2. 0 cm的莖 段然后接種于以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 5?0. 8mg/L的6-BA、0. 08? 0. I mg/L的NAA和質(zhì)量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的增殖培養(yǎng)基，在溫度 為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強(qiáng)度為80?100 lx、光照8?10 h/d的條件下培 養(yǎng)，視種苗需求數(shù)量可增殖25?30d ;⑤生根培養(yǎng)，待微枝生長(zhǎng)長(zhǎng)度為2. 0?3. 0 cm，轉(zhuǎn)接 于以改良MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基且還含0. 1%?1. 0%活性炭或0. 05?0. I mg/L的 NAA和質(zhì)量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，在 溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強(qiáng)度為80?100 lx、光照8?10 h/d的條件 下培養(yǎng)至裸花紫珠微枝根的生長(zhǎng)長(zhǎng)度為1. 5?2. 0 cm ;⑥煉苗培養(yǎng)，將生根培養(yǎng)的裸花紫 珠苗于隱蔽度為15%?20%的蔭棚，煉苗7?10 d ;⑦將經(jīng)過(guò)煉苗后裸花紫珠苗移栽于含 10%?15%蛭石，10%?15%牛糞，10%?15%椰糠和55%?70%腐殖土的育苗杯，即完成裸 花紫珠的脫毒微繁。
[0008] 上述方案中，所述的改良MS固體培養(yǎng)基由1/2MS培養(yǎng)基，增加75. (Γ100. 0 mg/L 的肌醇制得。
[0009] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，本發(fā)明中步驟②無(wú)菌苗培養(yǎng)為：將消毒后的裸花紫珠種 子接種于以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 01mg/L的赤霉素、0. 01 mg/L的NAA 和質(zhì)量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，本發(fā)明中步驟③中，所述壯苗培養(yǎng)基中有機(jī)附加物為椰 子乳、土豆泥、胡蘿卜泥中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選方案為有機(jī)附加物為質(zhì)量濃度為0. 5% 的椰子乳或1. 5% 土豆泥或1. 5%胡蘿卜泥。
[0011] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，本發(fā)明中步驟④增殖培養(yǎng)中，所述的增殖培養(yǎng)基中6-BA 濃度為 〇· 5mg/L，NAA 濃度為 0· 10mg/L。
[0012] 以下通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案： 實(shí)驗(yàn)材料 本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)所用的裸花紫珠種子為2011年12月份?2012年1月份在海南省儋州、 五指山、白沙、?？诘仁锌h采收的白色成熟的裸花紫珠 WJicarjDa /W￡/i/7ora Hook. Et Arn)果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料。
[0013] 本發(fā)明中所用培養(yǎng)基均含質(zhì)量濃度為2. 5~3· 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0。
[0014] 實(shí)驗(yàn)一：裸花紫珠外植體消毒 一、實(shí)驗(yàn)方法 將裸花紫珠種子分為6組，用75%酒精30?60s和升汞消毒7?15min，無(wú)菌水漂洗5 次至pH=7,重復(fù)3次，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱全光照培養(yǎng)，于10?12d后統(tǒng)計(jì)污染率與增殖 率。
[0015] 本實(shí)驗(yàn)中污染率是指接種IOd后被細(xì)菌或真菌污染的外植體瓶數(shù)占總接種瓶數(shù) 的百分率；褐化率是指接種IOd后外植體褐化變黑的瓶數(shù)占總接種瓶數(shù)的百分率；增殖率 是指接種IOd后外植體開(kāi)展生長(zhǎng)的瓶數(shù)占總接種瓶數(shù)的百分率；增殖系數(shù)是指接種30d后， 與原接種量相比，增殖的倍數(shù)百分率。
[0016] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如表1所示，（1)控制升汞消毒時(shí)間為lOmin，考察75%酒精消毒時(shí)間對(duì)消毒效果的影 響，結(jié)果表明：當(dāng)升汞消毒時(shí)間為10min，30s、45s和60s的酒精消毒對(duì)裸花紫珠果實(shí)的消毒 效果影響不大，其污染率23±3%，增殖率為77%±3% ; (2)控制酒精消毒時(shí)間為30s和60 s， 考察〇. 1%升汞消毒時(shí)間對(duì)消毒效果的影響，結(jié)果表明：消毒效果隨升汞消毒時(shí)間的遞增而 愈好，其中控制酒精消毒時(shí)間為30s，0. 1%升汞消毒時(shí)間為12min，其污染率12±2%，增殖率 為88%±2% ;酒精消毒時(shí)間為30s，0. 1%升汞消毒時(shí)間為15min，其污染率10±2%，增殖率為 90%±2%。所以從本研究得出以下結(jié)論：（1)裸花紫珠果實(shí)的最佳消毒程序?yàn)?5%酒精消毒 3(T60s，0. 1%升汞消毒時(shí)間為12mirTl5 min，其污染率在10%，增殖率為90%。
[0017] 表1 消毒時(shí)間對(duì)消毒效果的影響

【權(quán)利要求】
1. 一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于裸花紫珠的脫毒微繁方法按以下步驟實(shí) 現(xiàn)：①外植體消毒，將清洗后的裸花紫珠果實(shí)外植體在超凈工作臺(tái)上用質(zhì)量濃度為75%的 乙醇溶液浸泡3(T60s后，然后用無(wú)菌水沖洗3?5次，再用質(zhì)量濃度為0. 1%的氯化汞溶液 消毒12?15min，然后用無(wú)菌水沖洗3?5次；②無(wú)菌苗培養(yǎng)，將種子從消毒的裸花紫珠果 實(shí)中剝離出，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強(qiáng)度為80? 100 lx、光照8?10 h/d的條件下培養(yǎng)至無(wú)菌芽長(zhǎng)度為0.5?1.0 cm;③微枝培養(yǎng)，將增 生的無(wú)菌芽一起轉(zhuǎn)接于壯苗培養(yǎng)基中，在溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強(qiáng)度為 50?70 lx、光照8?10 h/d的條件下培養(yǎng)至無(wú)菌芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為15. 0?20. 0 cm,即為微 枝；④增殖培養(yǎng)，將增壯后的微枝切割成帶有1個(gè)頂芽或1?2個(gè)腋芽、且長(zhǎng)度為1. 0?2. 0 cm的莖段然后接種于增殖培養(yǎng)基，在溫度為25?28°C、濕度為70%?80%、光照強(qiáng)度為80? 100 lx、光照8?10 h/d的條件下培養(yǎng)，視種苗需求數(shù)量可增殖25?30d ;⑤生根培養(yǎng)，待 微枝生長(zhǎng)長(zhǎng)度為2. 0?3. 0 cm，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，在溫度為25?28°C、 濕度為70%?80%、光照強(qiáng)度為80?100 lx、光照8?10 h/d的條件下培養(yǎng)至裸花紫珠微 枝根的生長(zhǎng)長(zhǎng)度為1. 5?2. 0 cm ;⑥煉苗培養(yǎng)，將生根培養(yǎng)的裸花紫珠苗于隱蔽度為15%? 20%的蔭棚，煉苗7?10 d ;⑦將經(jīng)過(guò)煉苗后裸花紫珠苗移栽于含10%?15%蛭石，10%? 15%牛糞，10%?15%椰糠和55%?70% 土壤的育苗杯，即完成裸花紫珠的脫毒微繁；其中步 驟②中誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以改良MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 01~0. 03mg/L的赤霉 素、0· 01~0· 03mg/L的NAA和質(zhì)量濃度為2. 5~3· 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0 ;步驟③中壯 苗培養(yǎng)基是以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含質(zhì)量濃度為0. 5?1. 0%的有機(jī)附 加物，質(zhì)量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0 ;步驟④中增殖培養(yǎng)基是以改良MS 固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含〇. 5?0. 8mg/L的6-BA、0. 08?0. 1 mg/L的NAA和質(zhì)量 濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0 ;步驟⑤中生根培養(yǎng)基是以改良MS固培養(yǎng)基 為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 1%?1. 0%的活性炭或0. 05?0. 1 mg/L的NAA和質(zhì)量濃度為 2. 5?3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于所述的改良MS固 體培養(yǎng)基由1/2MS培養(yǎng)基，增加75. (Γ100. 0 mg/L的肌醇制得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于步驟②中將 消毒后的裸花紫珠種子接種于以改良MS固培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，且還包含0. 01mg/L的赤 霉素、0. 01mg/L的NAA和質(zhì)量濃度為2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值為5. 6?6. 0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于步驟③中，所 述壯苗培養(yǎng)基中有機(jī)附加物為椰子乳、土豆泥、胡蘿卜泥中的一種或多種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于步驟③中，所述 壯苗培養(yǎng)基中有機(jī)附加物為質(zhì)量濃度為〇. 5%的椰子乳或1. 5% 土豆泥或1. 5%胡蘿卜泥。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種裸花紫珠的脫毒微繁方法，其特征在于步驟④增殖 培養(yǎng)中，所述的增殖培養(yǎng)基中包含〇. 5mg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA和質(zhì)量濃度為2. 5~3. 0% 的鹿糖，pH值為5. 6?6. 0。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104221852SQ201310229432
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】張影波, 于福來(lái), 李偉, 龐玉新, 谷陟欣, 黃勝, 徐向平, 王丹, 官玲亮, 袁莉 申請(qǐng)人:九芝堂股份有限公司, 海南九芝堂藥業(yè)有限公司