一種枯草芽孢桿菌lnxm37及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)LNXM37，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），保藏日期為2013年9月9日，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8141。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)LNXM37可用于作物秸稈降解，同時(shí)兼具抑制水稻紋枯病菌、油菜菌核病等植物病原菌的功能，從而促進(jìn)水稻和油菜的生長(zhǎng)，具有很好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種枯草芽孢桿菌LNXM37及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌LNXM37及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]作物秸桿是當(dāng)今世界上僅次于煤炭，石油，天然氣的第四大能源，也是唯一可再生的能源，是最具有利用潛力的生物質(zhì)資源之一。在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中，秸桿資源不經(jīng)過(guò)任何處理而直接用于肥料、燃料和飼料，利用率較低，并且大量的秸桿由于缺乏合適利用方法而被農(nóng)民就地焚燒，一方面是對(duì)資源的一種浪費(fèi)，另一方面，給周邊地區(qū)安全和環(huán)境帶來(lái)了巨大威脅，如釋放出大量一氧化碳、氮氧化物、光化學(xué)氧化劑和懸浮顆粒等對(duì)人體有害的物質(zhì)。
[0003]目前，雖然秸桿利用的方法有很多，在不同地區(qū)的效果也不錯(cuò)，但由于技術(shù)和成本的原因，秸桿在工業(yè)及能源領(lǐng)域的應(yīng)用尚存在一定程度的制約；此外，由于目前收集、運(yùn)輸秸桿成本高而收購(gòu)價(jià)格低，農(nóng)民缺少積極性，因而并未從根本上解決秸桿出路問(wèn)題，農(nóng)民們?nèi)匀辉谀陱?fù)一年地就地焚燒大量秸桿。
[0004]就中國(guó)乃至全世界的秸桿利用情況來(lái)看，秸桿還田是目前適用范圍最廣，最容易推廣的利用方法。秸桿還田可以將秸桿中的C、N、K、P及微量元素釋放到大田，大量研究結(jié)果表明，秸桿還田能有效改善土壤物理性狀，增加土壤養(yǎng)分含量，有利于土壤中有機(jī)質(zhì)的積累，長(zhǎng)期保持秸桿還田，可以有效解決目前中國(guó)耕地生產(chǎn)力和肥力下降問(wèn)題，同時(shí)顯著提高作物產(chǎn)量并減少甚至替代部分化肥的使用。然而，秸桿不經(jīng)處理直接還田在自然條件下腐解速度慢，影響播種、出苗和苗期生長(zhǎng)；而且秸桿覆蓋后會(huì)給病蟲(chóng)害提供越冬場(chǎng)所，易使下茬作物發(fā)生各類(lèi)病蟲(chóng)害。
[0005]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),是一種耐熱、好氧的G+桿狀細(xì)菌,該菌能產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽孢，能顯著抑制病原菌，是一種常見(jiàn)的植物根圍促生細(xì)菌(PGPR)，也是目前生防細(xì)菌中研究和應(yīng)用較多的一類(lèi)細(xì)菌；`同時(shí)，大量的報(bào)道也證實(shí)，芽孢桿菌可以產(chǎn)生胞外纖維素酶、半纖維素酶等，可以有效降解木質(zhì)纖維素。因此，在秸桿降解過(guò)程中，利用可產(chǎn)生降解木質(zhì)纖維素酶類(lèi)的生防枯草芽孢桿菌加速秸桿木質(zhì)纖維素的降解，使養(yǎng)分最有效的釋放；同時(shí)，作為生防菌的芽孢桿菌對(duì)大田作物本身不僅無(wú)害，還兼具對(duì)病原微生物的拮抗作用，從而降低病害發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)?？莶菅挎邨U菌生長(zhǎng)繁殖快、營(yíng)養(yǎng)需求低、對(duì)人畜無(wú)害、能夠抑制多種作物病害并產(chǎn)生脂肽化合物，且其批量生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本較低、施用方便、儲(chǔ)存期長(zhǎng)、不會(huì)讓農(nóng)作物產(chǎn)生抗藥性，這些優(yōu)點(diǎn)使之成為一種理想的作物秸桿降解制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提出一種能夠有效降解作物秸桿、同時(shí)能拮抗作物病原菌的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)LNXM37。
[0007]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) LNXM37,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年9月9日，保藏編號(hào)為CGMCCN0.8141。
[0009]該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，無(wú)莢膜，好氧，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。菌落表面粗糙不透明，微黃色。生理生化特性:接觸酶陽(yáng)性，V-P反應(yīng)呈陽(yáng)性，水解淀粉、酪素，不產(chǎn)生吲哚。以16S rDNA 測(cè)序結(jié)果與 Genbank 上(http://www.ncb1.nlm.nih gov/blast/Blast.cgi)已知序列進(jìn)行比對(duì)，與Bacillus subtilis BIl相似度為100%。
[0010]包含所述枯草芽孢桿菌LNXM37和/或其代謝產(chǎn)物并以其為活性成分的微生物制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011]優(yōu)選地，所述微生物制劑為液態(tài)。
[0012]本發(fā)明還提供了上述微生物制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0013](I)將所述枯草芽孢桿菌LNXM37接種于LB固體培養(yǎng)基，于28~37°C下培養(yǎng)14~24小時(shí)獲得菌體；
[0014](2)將步驟(1)獲得的菌體接入LB液體培養(yǎng)基中，于28~37°C下振蕩培養(yǎng)12~24小時(shí)制成種子液；
[0015](3)按體積百分比為5%的接種量，將步驟(2)所得種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28~37°C下發(fā)酵培養(yǎng)至少36~48小時(shí)，收集發(fā)酵液即得所述微生物制劑。
[0016]上述制備方法中，優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下重量百分比的組分:小麥秸桿粉I~3%、優(yōu)選2%，磷酸氫二鉀0.1~0.5%、優(yōu)選0.2%，硝酸鈉0.3~0.8%、優(yōu)選0.5%和葡萄糖0.5~1.5%、優(yōu)選1%。
[0017]本發(fā)明還提供了所述枯草芽孢桿菌LNXM37的應(yīng)用，具體應(yīng)用如下:
[0018]所述枯草芽孢桿菌LNXM37在作物秸桿降解中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述作物秸桿為小麥稻桿；
[0019]所述枯草芽孢桿菌LNXM37在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用；
[0020]所述枯草芽孢桿菌LNXM37在防治油菜菌核病中的應(yīng)用；
[0021]所述枯草芽孢桿菌LNXM37在促進(jìn)水稻和油菜生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌LNXM37對(duì)小麥秸桿等作物秸桿有明顯的降解效果，并且對(duì)水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌等植物病原菌有明顯的抑制效果。本發(fā)明枯草芽孢桿菌LNXM37單獨(dú)作用于秸桿時(shí)，秸桿秸桿失重率可達(dá)35.2%，纖維素降解率達(dá)26.0%，半纖維素降解率達(dá)25.2%，木質(zhì)素降解率達(dá)48.5%。
[0023]保藏信息
[0024]保藏日期:2013年9月9日；
[0025]保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng):CGMCC)，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，100101 ；
[0026]保藏編號(hào):CGMCCN0.8141。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為實(shí)施例1分離的部分菌株的BOX-PCR指紋圖譜。
[0028]圖2為基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0029]圖3為實(shí)施例2所述對(duì)31株生防芽孢桿菌的平板篩選的部分結(jié)果(A)、胞外外切纖維素酶活(B)和半纖維素酶活(C)測(cè)定結(jié)果。[0030]圖4為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌LNXM37單獨(dú)降解時(shí)小麥秸桿粉的失重率曲線(xiàn)。
[0031]圖5為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌LNXM37單獨(dú)降解時(shí)小麥秸桿粉的纖維素降解率曲線(xiàn)。
[0032]圖6為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌LNXM37單獨(dú)降解時(shí)小麥秸桿粉的半纖維素降解率曲線(xiàn)。
[0033]圖7為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌LNXM37單獨(dú)降解時(shí)小麥秸桿粉的木質(zhì)素降解率曲線(xiàn)。
[0034]圖8顯示了分離的本發(fā)明枯草芽孢桿菌LNXM37的抑菌活性；從左到右依次為對(duì)水稻紋枯病菌(A)和油菜菌核病菌(B)的抑菌活性效果圖；其中，CK代表空白對(duì)照組，LNXM37代表本發(fā)明枯草芽孢桿菌LNXM37處理組。
【具體實(shí)施方式】
[0035]為更好地說(shuō)明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下。
[0036]實(shí)施例1具有生防效應(yīng)的芽孢桿菌的分離、篩選與鑒定
[0037]采用五點(diǎn)取樣法，于西藏拉薩市、林芝地區(qū)、山南地區(qū)和日喀則地區(qū)，不同環(huán)境條件下共采集35個(gè)土樣，以稀釋涂平板法對(duì)菌株進(jìn)行分離純化，分離得到1388個(gè)菌株。然后，以水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)和油菜菌核病菌(Sc lerotinia sclerotiorum)為指不菌，最后得到311株抑菌效果較好的菌株(抑菌圈直徑> 5mm)。對(duì)這311個(gè)抑菌效果好的分離菌株進(jìn)行基因組rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR)指紋圖譜篩選,共得到 150 個(gè)指紋圖譜不一樣菌株(指紋圖譜見(jiàn)圖1)。對(duì)經(jīng)過(guò)指紋圖譜篩選獲得的150個(gè)菌株進(jìn)行生理生化鑒定，將150個(gè)菌株分為7個(gè)類(lèi)群，然后，從每個(gè)類(lèi)群中選取代表性的菌株共31個(gè)株系進(jìn)行脂肪酸氣相色譜(fatty acid methyl ester, FAME)和16S rDNA分子鑒定(見(jiàn)圖2),最后，綜合表型鑒定和一系列分子鑒定的結(jié)果，將分離的、有生防潛力的31個(gè)芽孢桿菌菌株鑒定為:短小芽孢桿菌(B.pumilus) 11株,臘樣芽孢桿菌(B.cereus) 7株,蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis) 3株,解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) 3株,萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus) 3 株，B.axarquiensis2 株，枯草芽抱桿菌(B.subtilis) I 株，地衣芽抱桿菌(B.1icheniformis) I 株。
[0038]實(shí)施例2兼具生防和秸桿降解潛力菌株的篩選
[0039]以實(shí)施例1所鑒定的31株生防芽孢桿菌為基礎(chǔ)，以平板透明圈法進(jìn)行第一輪初篩，得到可以產(chǎn)生胞外木質(zhì)纖維素降解酶的菌株27株，部分平板篩選結(jié)果見(jiàn)圖3A。緊接著以不同性質(zhì)的多糖底物測(cè)定這27株芽孢桿菌胞外酶活力的大小，胞外外切纖維素酶活和半纖維素酶活測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)圖3B和圖3C。最后綜合初篩和復(fù)篩結(jié)果，得到2株兼具生防和秸桿降解潛力的菌株GBSW19和LNXM37。
[0040]實(shí)施例3菌株LNXM37對(duì)小麥秸桿粉的實(shí)際降解效果綜合測(cè)評(píng)
[0041]將實(shí)施例2所得平板上活化的LNXM37菌株挑至液體LB培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)制成種子液，再以體積百分比為2%的接菌量轉(zhuǎn)接至添加小麥秸桿粉(5目)為唯一碳源的Hutchinson培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),于不同天次收集培養(yǎng)液，并以差重法和改進(jìn)的Van Voest法測(cè)定小麥秸桿粉的失重率、纖維素降解率、半纖維素降解率和木質(zhì)素降解率，最終得到菌株LNXM37對(duì)小麥秸桿粉的實(shí)際降解效果綜合測(cè)評(píng)結(jié)果(見(jiàn)圖4-7)。
[0042]圖4-7結(jié)果顯示:菌株LNXM37單獨(dú)作用于秸桿時(shí)，秸桿失重率可達(dá)35.2%，纖維素降解率達(dá)26.0%，半纖維素降解率達(dá)25.2%，木質(zhì)素降解率達(dá)48.5%。
[0043]實(shí)施例4本發(fā)明枯草芽孢桿菌LNXM37的抑菌活性
[0044]a.對(duì)病原細(xì)菌水稻白葉枯病菌的抑菌篩選
[0045]將指示菌病原細(xì)菌水稻白葉枯病菌按一定比例(1:30)加入冷卻到50°C左右的NA培養(yǎng)基中混勻，制成含菌平板，在距離中心2.5cm處十字垂直放置4個(gè)直徑為4_的濾紙片，吸取待測(cè)菌株菌液5 μ 1，接種于濾紙片上，對(duì)照不接種測(cè)試菌，用無(wú)菌水代替，每個(gè)處理重復(fù)三次。置于28°C培養(yǎng)箱共培養(yǎng)2-3天后，觀察并記錄結(jié)果。
[0046]b.對(duì)病原真菌油菜菌核病菌的拮抗篩選
[0047]在26°C培養(yǎng)箱中活化的油菜菌核病病菌PDA平板邊緣打取直徑為0.7cm的菌碟(取指示菌邊緣生長(zhǎng)旺盛的菌絲塊)，接種在新的PDA平板中央。在距離菌塊2.5cm處，呈“十”字形分布的四個(gè)接種點(diǎn)，放上直徑4mm的濾紙小圓片，取待測(cè)菌液5ul點(diǎn)在濾紙片中央，對(duì)照不接種測(cè)試菌，用無(wú)菌水代替，每個(gè)處理重復(fù)3次，放入26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天后，取出觀測(cè)并記錄抑菌結(jié)果。
[0048]c.對(duì)病原真菌水稻紋枯病菌的拮抗篩選
[0049]在28°C培養(yǎng)箱中活化的水稻紋枯病菌PDA平板邊緣打取直徑為0.7cm的菌碟(取指示菌邊緣生長(zhǎng)旺盛的菌絲塊)，接種在新的PDA平板中央。在距離菌塊2.5cm處，呈“十”字形分布的四個(gè)接種點(diǎn)，放上直徑7mm的濾紙小圓片，取待測(cè)菌液5ul點(diǎn)在濾紙片中央，對(duì)照不接種測(cè)試菌，用無(wú)菌水代替，每個(gè)處理重復(fù)3次，放入26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天后，取出觀測(cè)并記錄抑菌結(jié)果。`
[0050]本發(fā)明枯草芽孢桿菌LNXM37能夠有效抑制水稻紋枯病菌和油菜菌核病菌，其抑菌圈直徑均>5_，如圖8的A和B所示；對(duì)水稻白葉枯病菌則無(wú)明顯抑制效果。
[0051] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于上述，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LNXM37,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年9月9日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8141。
2.一種微生物制劑，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37和/或其代謝產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物制劑，其特征在于，所述微生物制劑為液態(tài)。
4.如權(quán)利要求3所述微生物制劑的制備方法，包括如下步驟: (1)將所述枯草芽孢桿菌LNXM37接種于LB固體培養(yǎng)基，于28~37°C下培養(yǎng)14~24小時(shí)獲得菌體； (2)將步驟(1)獲得的菌體接入LB液體培養(yǎng)基中，于28~37°C下振蕩培養(yǎng)12~24小時(shí)制成種子液； (3)按體積百分比為5%的接種量，將步驟(2)所得種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28~37°C下發(fā)酵培養(yǎng)至少36~48小時(shí)，收集發(fā)酵液即得所述微生物制劑； 優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下重量百分比的組分:小麥秸桿粉I~3%、優(yōu)選2%，磷酸氫二鉀0.1~0.5%、優(yōu)選0.2%，硝酸鈉0.3~0.8%、優(yōu)選0.5%和葡萄糖0.5~1.5%、優(yōu)選1%。
5.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37在作物秸桿降解中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述作物稻桿為小麥稻桿。
6.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37在防治油菜菌核病中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌LNXM37在促進(jìn)水稻和油菜生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK103589671SQ201310561031
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】高學(xué)文, 臧昊昱, 伍輝軍, 張萬(wàn)寬 申請(qǐng)人:無(wú)錫亞克生物科技有限公司