rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了rsmA基因參與固氮施氏假單胞菌在植物根部定殖和促生方面的功能。研究表明，該基因的存在對微生物在根表的定向運動及高效定殖具有負(fù)調(diào)控作用，通過基因敲除、基因突變等有效手段使該基因的功能喪失后可以提高菌株在固體介質(zhì)上的運動能力，并在植物根表產(chǎn)生更強的定殖能力，進而促進植物的生長。
【專利說明】rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]rsmA基因是在革蘭氏陰性菌中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。在有些細菌的報道中，提到該基因參與微生物的中心碳代謝、菌體運動、生物膜及致病性等相關(guān)的生理過程，但是尚未見報道其在參與植物生長方面的功能。
[0003]微生物菌肥中使用的微生物多是從植物根際分離到的植物根際促生菌(PGPR)，當(dāng)這些促生菌在植物“根部定殖”，即在植物根表和近根土壤中穩(wěn)定繁殖時，菌體可以利用植物根分泌的有機物作為碳源，例如有機酸，糖類，氨基酸等，這一獨特的生態(tài)環(huán)境使得植物促生菌大量繁殖，形成非常高的菌密度，然后利用自身的生物固氮、溶磷解鉀、分泌植物激素等方法促進植物生長的作用，實現(xiàn)植物-微生物互惠互利的高效共生關(guān)系。
[0004]固氮施氏假單胞菌A1501是我國科學(xué)家分離到的一株聯(lián)合固氮菌。但是在田間環(huán)境下存在的眾多的土著微生物會與A1501競爭氮素、碳素等營養(yǎng)物質(zhì)。因此，大幅提高固氮施氏假單胞菌A1501在植物根部的定殖能力，使其在眾多的根際微生物中獲得競爭優(yōu)勢，大量定殖到植物根表并發(fā)揮促生作用， 非常重要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是尋找有關(guān)參與固氮施氏假單胞菌水稻根部定殖和促生相關(guān)的基因。
[0006]本發(fā)明人在其實驗室完成的A1501基因組中找到rsmA基因，該基因在A1501基因組中編號(Locus tag)為PST1371，對應(yīng)的蛋白編碼在NCBI數(shù)據(jù)庫編號是ABP79066.1。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 rsmA基因參與固氮施氏假單胞菌在植物根部定殖和促生方面的功能。研究表明，該基因的存在對微生物在根表的定向運動及高效定殖具有負(fù)調(diào)控作用，通過基因敲除、基因突變等有效手段使該基因的功能喪失后可以提聞菌株在固體介質(zhì)上的運動能力，并在植物根表產(chǎn)生更強的定殖能力，進而促進植物的生長。
[0007]即，rsmA基因作為負(fù)調(diào)控因子行使功能，當(dāng)通過基因工程的手段使該基因的功能缺失后，獲得的基因工程菌株具有更高的運動能力、生物膜合成能力以及更強的水稻根部定殖和促生能力。本發(fā)明涉及所述的突變菌的產(chǎn)生方法及其產(chǎn)生的菌株在微生物肥料產(chǎn)業(yè)中具有應(yīng)用前景。
[0008]基因組分析表明，在固氮施氏假單胞菌A1501中存在一個跟大腸桿菌csrA的氨基酸序列87%的相似度，和銅綠假單胞菌rsmA基因氨基酸序列同源性高達97%的類似物。我們通過同源重組的方法對固氮假單胞菌中的rsmA基因進行整合突變使其功能缺失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變株在固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)發(fā)生明顯的變化，菌落變得干燥，不易從培養(yǎng)基上剝離。野生型A1501在含0.5%瓊脂的LB平板上，幾乎不發(fā)生swarm運動，但RsmA突變株的swarm運動能力極大的增強,此外，RsmA的突變導(dǎo)致了菌體生物薄膜生成量明顯增加。此外，通過接種野生型及突變株菌株于水稻幼苗根部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rsmA功能的缺失導(dǎo)致了固氮假單胞菌在水稻根部定殖能力和促生能力都大幅增強。
[0009]本發(fā)明人通過對Pseudomonas stutzeri A1501的全基因組序列和基因注釋分析，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建rsmA基因功能缺失的突變株可以用于生產(chǎn)增強固氮作用的微生物菌肥。
[0010]上述構(gòu)建rsmA基因功能缺失的突變株可以采用多種形式，如整合突變方式，也可以采用缺失突變，點突變等方式，只要能夠使rsmA基因功能缺失就可以得到相似的表型和實驗結(jié)果。
[0011]在本發(fā)明的一個實例中，采用同源重組的方式對rsmA基因進行整合突變，獲得了rsmA基因功能缺失突變株。本發(fā)明對所得到的上述rsmA突變株進行了如下測定，證明其可高效定殖水稻，小麥，玉米等禾本科農(nóng)作物根部，并對植物有促生長作用:
[0012]1)菌體 swarming 運動
[0013]即，測定菌體在瓊脂含量為0.4%-0.7%的半固體培養(yǎng)基表面上運動擴散，發(fā)現(xiàn)突變株在固體界面上的swarming運動能力顯著增強，這可以導(dǎo)致菌體在水稻根表定殖后，通過swarming運動形式從定殖初始位點向周圍擴張擴大定殖的面積，使菌體廣泛占據(jù)植物的根表，獲得更好的營養(yǎng)來源，在與其他土著微生物的競爭中占據(jù)先機。
[0014]2)生物膜形成(細菌在固體表面形成一種具有一定三維空間結(jié)構(gòu)的多細胞結(jié)構(gòu)，被稱為生物膜)，發(fā)現(xiàn)突變株生物膜的生成能力增強，證明rsmA的突變促進了施氏假單胞菌生物膜的形成。生物膜的形成對于固氮微生物是非常重要的，形成了生物膜這種特殊的結(jié)構(gòu)，微生物的生長、固氮等多種生理反應(yīng)才能夠被激活并穩(wěn)定進行。
[0015]3)水稻根表競爭性定殖實驗
[0016]在突變株在和固氮假單胞菌A1501野生型的水稻根際競爭性定殖實驗中，發(fā)現(xiàn)rsmA突變株的定殖能力高出野生型10倍以上；
[0017]4)水稻促生實驗
[0018]在實驗室環(huán)境下，采用野生型A1501及rsmA突變株接種水稻植株，在對水稻的促生效果上，無論水稻株高還是植株地上部分與地下部分的干重上都具有明顯的優(yōu)勢。
[0019]5)固氮酶活測定
[0020]實驗發(fā)現(xiàn):rsmA突變株的固氮酶活相對于野生型雖然沒有發(fā)生明顯改變，說明rsmA的缺失對于固氮效率沒有產(chǎn)生影響。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1是rsmA整合突變PCR驗證，圖中:M為trans2Kplus2DNA marker, I為利用pK18mobcon-F與rsmA下游-R為引物，rsmA插入突變株基因組為模板擴增出的800bp片段；
[0022]圖2是A1501野生型和rsmA突變株固氮酶活的測定；
[0023]圖3是A1501和rsmA突變株在固態(tài)培養(yǎng)基上的swarming能力測定，其中，圖左是rsmA基因突變株圖右是野生型A1501 ；
[0024]圖4是A1501和rsmA突變株生物膜生成能力測定對比，rsmA突變株形成的菌膜明顯要比野生型的要厚?！揪唧w實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，而不用于限制本發(fā)明的范圍。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件。
[0026]實施例1以施氏假單胞菌A1501為出發(fā)菌株構(gòu)建rsmA突變株
[0027]本實驗構(gòu)建的rsmA突變株采用的是整合突變的方法?；镜脑頌镈NA同源重組。
[0028]實驗方法:
[0029](I):采用PCR擴增法獲得截短的rsmA基因部分片段，命名為rsmA’，將rsmA’片段連接到PMD-19T克隆載體上，對rsmA’進行DNA測序，確保序列的真實性。
[0030](2):對rsmA’克隆載體進行限制性雙酶切,將切下的rmsA’連接到pK18mob質(zhì)粒上，獲得rsmA’自殺質(zhì)粒。
[0031](3):通過三親結(jié)合方法,rsmA’自殺質(zhì)粒導(dǎo)入到A1501中，利用A15限制性培養(yǎng)基和卡那霉素進行篩選。
[0032](4):質(zhì)粒上的rsmA’和A1501基因組上的rsmA發(fā)生同源單交換。利用pK18mob上的通用引物pK18mobconF和rsmA下游DNA片段的反向引物進行菌落PCR擴增。能擴增出大小約SOObp的條帶的菌株已經(jīng)發(fā)生了同源交換。
[0033]實驗結(jié)果:
[0034]利用pK18mob上的通用引物pK18mobconF和rsmA下游DNA片段的反向引物進行菌落PCR擴增，能擴增出大小約SOObp的條帶(如圖1)。說明已經(jīng)發(fā)生了同源交換，獲得rsmA
突變株。
[0035]實施例2野生型A1501和rsmA突變株的swarming運動
[0036]實驗方法:
[0037](I)從LB平板上挑取新鮮活化的單菌落，接種到含20mL LB液體培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，rsmA突變株培養(yǎng)基需要加入50 μ g/mL的卡那霉素，30°C，200rpm培養(yǎng)過夜。
[0038](2)吸取1%過夜菌培養(yǎng)物接種到含20mL LB液體培養(yǎng)基的50mL三角瓶中。rsmA突變株培養(yǎng)基需要加入50 μ g/mL的卡那霉素。30°C，200rpm培養(yǎng)12小時，測定菌體密度0D600 ~2.5。
[0039](3)在超凈工作臺中吸取2 μ L菌液滴在已經(jīng)放置過夜的含0.5%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基平板的中心點上。待菌液自然干燥后，倒置平板，30°C靜置培養(yǎng)24-48小時。對實驗結(jié)果進行照相記錄。
[0040]實驗結(jié)果: [0041]見圖3。Swarming運動是菌體在固體表面靠鞭毛向周圍擴張的運動形式。在固氮施氏假單胞菌野生型中swarming運動能力很弱，而rsmA突變株的swarming能力大大增強。并且rsmA突變株形成的菌落表面有褶皺，菌落邊緣不規(guī)則，菌落的濕潤程度要比野生型低，形成的菌膜更加致密。這可能是細胞表面性質(zhì)發(fā)生變化造成的。Swarming運動能力增強可以使得菌體在水稻根表定殖后，從定殖位點向周圍擴張，從而增加菌體在水稻根表的定殖面積。
[0042]實施例3野生型A1501和rsmA突變株的生物膜形成[0043]實驗方法:
[0044](I)從LB平板上挑取新鮮活化的單菌落，接種到含20mL LB液體培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，rsmA突變株培養(yǎng)基需要加入50 μ g/mL的卡那霉素，30°C，200rpm培養(yǎng)過夜。
[0045](2)吸取1%過夜菌培養(yǎng)物接種到含20mL LB液體培養(yǎng)基的50mL三角瓶中。rsmA突變株培養(yǎng)基需要加入50 μ g/mL的卡那霉素。30°C，200rpm培養(yǎng)12小時，測定菌體密度0D600 ~2.5。
[0046](3)將IOmL菌培養(yǎng)物4V 4000g離心10分鐘，棄掉上清液，利用生理鹽水懸浮菌體，再次4000g離心10分鐘離心。棄掉上清液，利用A15限制性培養(yǎng)液懸浮菌體，調(diào)節(jié)OD600=L O。
[0047](4)吸取5mL上述菌懸液加入到20X 150mm的帶蓋玻璃試管中。30°C靜置培養(yǎng)48小時。觀察試管內(nèi)液體和空氣交界處菌膜的形成情況。
[0048](5)小心倒掉菌液，輕輕加入蒸餾水洗滌試管，倒掉蒸餾水，重復(fù)一次。加入5mLl%的結(jié)晶紫染液靜置5分鐘，輕柔倒掉染液，利用蒸餾水輕柔洗滌試管兩次，拍照記錄。
[0049]實驗結(jié)果:
[0050]見圖4。在A1501野生型和rsmA突變株的玻璃試管液體和空氣交界處都能形成一層白色褶皺菌膜，rsmA突變株形成的菌膜明顯要比野生型的要厚。同時在兩者的試管管壁菌液最上沿會形成一個菌圈，但rsmA突變株的菌圈明顯要厚的多。
[0051]實 驗結(jié)論:
[0052]rsmA的突變促進了施氏假單胞菌生物膜的形成。
[0053]實施例4野生型A1501和rsmA突變株的水稻根部競爭性定殖試驗
[0054]實驗方法:
[0055](I)水稻種子表面消毒。將水稻種子利用蒸餾水漂洗兩遍，去除種子表面的灰塵，并且去除干癟的水稻種子。70%酒精洗滌種子2分鐘，10%的次氯酸鈉洗滌15分鐘，在洗滌過程中，放到搖床上緩慢搖動。最后利用無菌蒸餾水漂洗5-6遍。
[0056](2)將消毒后的水稻種子放入含有無菌水和紗布的培養(yǎng)皿。30°C催芽4天。
[0057](3)挑選發(fā)芽情況一致5棵水稻幼苗轉(zhuǎn)移到含有20mL水稻培養(yǎng)液的大試管中，每個實驗組設(shè)三個平行組。將水稻幼苗轉(zhuǎn)移到人工氣候培養(yǎng)箱中。27°C，12小時光照，12小時黑暗，相對濕度70%。培養(yǎng)48小時。
[0058](4)從LB平板上挑取新鮮活化的單菌落，接種到含20mL LB液體培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，rsmA突變株培養(yǎng)基需要加入50 μ g/mL的卡那霉素，30°C，200rpm培養(yǎng)過夜。
[0059](5)吸取1%過夜菌培養(yǎng)物接種到含20mL LB液體培養(yǎng)基的50mL三角瓶中。rsmA突變株培養(yǎng)基需要加入50 μ g/mL的卡那霉素。30°C，200rpm培養(yǎng)12小時，測定菌體密度0D600 ~2.5。
[0060](6)將IOmL菌培養(yǎng)物4°C 4000g離心10分鐘，棄掉上清液，利用生理鹽水懸浮菌體，再次4000g離心10分鐘離心。棄掉上清液，利用生理鹽水懸浮菌體，調(diào)節(jié)0D_=1.0。
[0061](7)向含有水稻幼苗的大試管中加入2.5mL的A1501菌懸液和2.5mL的rsmA菌懸液，混勻，此時菌體總密度為0D600 乂 0.2。27°C，12小時光照，12小時黑暗，相對濕度70%。培養(yǎng)48小時。
[0062](8)從上述培養(yǎng)試管中取出長勢相近的3棵水稻。在超凈工作臺中用無菌蒸餾水輕輕仔細沖洗根部，利用濾紙將根部水分吸干，重復(fù)沖洗根部2次。將根部剪下，放入含有ImL蒸餾水的1.5mL離心管中，利用渦旋儀劇烈震蕩5分鐘，將所得菌液按10倍梯度稀釋。各梯度吸取100微升液體涂布在含有四環(huán)素或卡那霉素的A15限制性固體平板上。30°C靜置培養(yǎng)48個小時，對平板上的單菌落進行計數(shù)，計數(shù)時選取菌落數(shù)為30-300個平板進行計數(shù)。將震蕩完成的水稻根取出，用濾紙吸干水分。80°C烘箱烘烤I小時。利用分析天平稱取水稻根干重。
[0063]菌體定殖密度計算公式為C=(菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)X 10) +水稻根干重(g)
[0064]實驗結(jié)果:
[0065]A1501的定殖密度為2.34X IO7Cfu/根干重(g)，rsmA突變株的定殖密度為3.60X 108cfu/根干重(g)，為野生型A1501的15.4倍。
[0066]實驗結(jié)論:
[0067]rsmA突變株的競爭性定殖能力比野生型A1501有了很大的提高。
[0068]實施例5野生型A1501和rsmA突變株對水稻幼苗的促生試驗
[0069]實驗方法:
[0070](I)水稻種子消毒、催芽及轉(zhuǎn)接參照本章實施例5。
[0071](2)挑選發(fā)芽情況一致的50株水稻幼苗轉(zhuǎn)移到含有200mL水稻培養(yǎng)液的IL的大燒杯中，分別加入20mL OD6tltlS 1.0野生型A1501及rsmA突變株菌液。。27°C條件下，光照條件為12小時光照，12小 時黑暗，相對濕度70%，培養(yǎng)10天，將幼苗取出，測量水稻的株高(cm)，將水稻根剪下，蒸餾水洗滌2次。濾紙吸干根表水分后將水稻根80°C烘箱烘烤I小時。稱量水稻根干重。
[0072]實驗結(jié)果:10天后，rsmA突變株無論在株高上還是地上干重與地下干重上都具有明顯的優(yōu)勢(見表1)。接種rsmA突變株的水稻株高平均達到23.4± 1.6cm，而野生型菌株高為16.8±1.4cm，而不接種任何菌劑的對照株高平均達到14.6±1.2cm。
[0073]表1野生型A1501及rsmA突變株對水稻的促生能力測定
[0074]
【權(quán)利要求】
1.rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的應(yīng)用，所述rsmA基因的編碼蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫編號是ABP79066.1。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，是rsmA基因參與固氮施氏假單胞菌在植物根部定殖和促生方面的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，是rsmA基因的負(fù)調(diào)控功能的應(yīng)用；所述負(fù)調(diào)控功能是:將該基因的功能缺失，使獲得的基因工程菌株具有更高的運動能力、生物膜合成能力以及更強的植物根部定殖和促生能力。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述功能缺失是通過rsmA基因敲除、基因突變使rsmA基因的功能喪失。
5.權(quán)利要求1、2或3所述的應(yīng)用，所述植物是禾本科農(nóng)作物。
6.權(quán)利要求1、2或3所述的應(yīng)用，所述植物是水稻、小麥或玉米。
7.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，是利用rsmA基因在開發(fā)微生物菌肥中的用途。
【文檔編號】C05F11/08GK103614410SQ201310593220
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】燕永亮, 尚立國, 戰(zhàn)崳華, 林敏
申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所