水稻組織特異性脆稈控制基因tsbc1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻組織特異性脆稈控制基因TSBC1編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有Seq?ID?No：2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了編碼該蛋白質(zhì)的基因，該基因具有Seq?ID?No：1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了含有上述基因的質(zhì)粒、植物表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還公開了培育植物脆稈的方法：用上述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。本發(fā)明從水稻組織特異性脆稈突變體中克隆的新基因TSBC1，編碼具有兩個SANT結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合域的MYB類轉(zhuǎn)錄因子，主要通過調(diào)控水稻細(xì)胞壁組分合成代謝來控制植株的脆稈性狀。
【專利說明】水稻組織特異性脆稈控制基因TSBC1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻組織特異性脆桿控制基因TSBCl及其應(yīng)用，主要應(yīng)用于植物基因工程。
【背景技術(shù)】
[0002]植株莖桿的支撐力是植物，尤其是農(nóng)作物的重要農(nóng)藝性狀。而莖桿的支撐力又與莖桿組織中相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞壁厚度直接有關(guān)。植物細(xì)胞壁是一種強(qiáng)的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由不同的高聚多糖，芳香族物質(zhì)和蛋白質(zhì)高度有序地組成，其結(jié)構(gòu)對保持細(xì)胞形態(tài)，維持植株直立生長的機(jī)械支撐力具有重要作用[1]。植物細(xì)胞壁的生物合成是一個非常復(fù)雜的代謝過程，涉及纖維素、木質(zhì)素和一些非纖維素成分的合成途徑。因此，細(xì)胞壁中纖維素、木質(zhì)素等主要成分的合成與分布以及沉積是影響植株莖桿支撐力的主要影響因素。對不同細(xì)胞壁突變體的研究是揭示與莖桿支撐力有關(guān)的細(xì)胞壁生物合成生理生化以及分子生物學(xué)機(jī)理有效途徑。
[0003]對于大麥莖桿突變體(brittle culm)的細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)這些突變體脆桿的特征源于細(xì)胞壁變薄，纖維素含量減少，尤其是纖維素合酶復(fù)合體在質(zhì)膜上分布數(shù)量的減少，證明該性狀與纖維素的合成有關(guān)[2]。擬南芥不正常木質(zhì)部突變體((irregularxylem) irxl和irx3進(jìn)行了詳細(xì)的研究發(fā)現(xiàn),這些突變體的成熟莖硬度均明顯降低,有的甚至不能保持莖桿直立，同時木質(zhì)部發(fā)育也不正常。圖位克隆分離了突變體相對應(yīng)的基因表明它們編碼纖維素合酶的催化亞基，證明了植物莖桿的支撐力與纖維素的合成有關(guān)[3’4]。在水稻種也一些脆桿基因的研究。水稻BCl基因編碼了主要在厚壁組織細(xì)胞和維管束中表達(dá)的類-cobra蛋白，降低了細(xì)胞壁厚度和纖維素含量，增加了木質(zhì)素的含量[5]。BClO通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁纖維素合成和阿拉伯半乳聚糖蛋白含量，控制水稻植株的機(jī)械強(qiáng)度，同時影響植物的生長和發(fā)育[6]。Bcl2參與了水稻的細(xì)胞周期進(jìn)程、纖維素微纖維的積累和細(xì)胞壁組分的構(gòu)成[7]。Bcl4編碼水稻核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsNSTl,是一個定位于高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，為基質(zhì)多糖的形成提供了葡萄糖基底物，進(jìn)而調(diào)控纖維素的生物合成M。上述結(jié)果表明除了直接參與纖維素和木質(zhì)素合成的基因外，調(diào)控纖維素和木質(zhì)素有序分布與沉積以及細(xì)胞壁厚度的基因?qū)χ仓甑闹瘟σ灿杏绊憽?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供水稻組織特異性脆桿控制基因TSBC1。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
[0006]一種水稻組織特異性脆桿控制基因TSBC1，上述基因TSBCl所編碼的蛋白質(zhì)具有如序列表所示的氨基酸序列。
[0007]進(jìn)一步地，上述氨基酸序列還添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸 序列或衍生物。
[0008]進(jìn)一步地,上述基因TSBCl,具有如序列表所不的核昔酸序列。[0009]進(jìn)一步地，上述核苷酸序列還添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。
[0010]本發(fā)明還提供了含有上述基因的質(zhì)粒。
[0011]本發(fā)明還提供了含有上述基因的植物表達(dá)載體。
[0012]本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有基因序列。
[0013]作為本發(fā)明的宿主細(xì)胞的改進(jìn):該細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明還提供了一種培育植物脆桿的方法，包括用上述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。
[0015]作為本發(fā)明的培育方法的改進(jìn):轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍法。
[0016]具體的說:本發(fā)明所提供的從水稻組織特異性脆桿突變體中克隆的新基因TSBC1，具有如圖4和Seq ID No:1所示的DNA序列。也包括在取代一個核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因，還含具有相同功能并能達(dá)到本發(fā)明目的的基因序列。
[0017]本發(fā)明中Se ID No:2所示的蛋白質(zhì)屬于SANT類的MYB-DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，其中進(jìn)行一個或幾個氨基酸的替換、插入或缺失氨基酸所獲得的功能類似物。TSBCl與擬南芥AtMYB103蛋白同源性為66% ；AtMYB103蛋白編碼一種名為SNDl家族的轉(zhuǎn)錄因子，也具有MYB-DNA結(jié)合域，并調(diào)節(jié)S木質(zhì)素單體的合成。
[0018]本發(fā)明所提供的含有圖4和Seq ID No:1所示序列的基因或部分基因片段的載體，如圖7所示，該載體可以表達(dá)由上述核苷酸序列編碼的多肽或同源類似物。
[0019]本發(fā)明所提供的植物脆桿的培育方法，是一種用TSBCl進(jìn)行高效植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法；具體地說，是利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以影響農(nóng)作物莖桿機(jī)械強(qiáng)度方法。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)選實施方式包含以下步驟:
[0021]一、水稻組織特異性脆桿突變體tsbcl的分離和遺傳分析:
[0022]本發(fā)明所采用的水稻組織特異性脆桿突變體是將粳稻品種(Japonica)“秀水110”經(jīng)重離子12C6+ (能量:80MeV/u ;劑量:80Gy)輻照處理后，再通過大量篩選而得到的表型穩(wěn)定的脆桿突變體tsbcl。該突變體與野生型相比，莖桿表現(xiàn)出明顯脆性，而葉片和穗部枝梗等表現(xiàn)正常，株高略微降低，穗型變成彎穗，如圖1所示。大量的雜交實驗證明，我們所得到的是一個符合單基因控制遺傳規(guī)律的隱性突變體。
[0023]二、圖位克隆控制水稻組織特異性脆桿的TSBCl基因:
[0024](一)為了分離TSBCl基因，本發(fā)明首先建立了一個大的多態(tài)性高的定位群體，由突變體tsbcl (粳稻)與南京11品種(秈稻)雜交而形成的F2群體，再通過圖位克隆的方法，并利用SSR等分子標(biāo)記對TSBCl位點(diǎn)進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第8染色體短臂上，并介于SSR標(biāo)記RM8018和RM5068之間，見圖2。
[0025]( 二)TSBCl基因的精細(xì)定位及物理定位:
[0026]通過已測序的TSBCl位點(diǎn)區(qū)域的基因組序列，發(fā)展新的標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位，最終將TSBCl基因定位于SSR標(biāo)記RM5647和RM22392間的102kb范圍之內(nèi)(圖2A)。通過分析此區(qū)段的開放閱讀框(ORF)推測候選基因，即對該范圍內(nèi)的候選基因進(jìn)行序列分析，測序后發(fā)現(xiàn)只有TSBCl候選基因的序列在野生型與tsbcl突變體之間存在差異，而其它14個的序列在野生型與tsbcl突變體間均無差異。
[0027](三)TSBCl基因的鑒定和功能分析:[0028]將TSBCl基因構(gòu)建到常規(guī)植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻脆桿突變體tsbcl中，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使tsbcl突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻(圖7B);證明了本發(fā)明正確克隆了 TSBCl基因(圖3)。
[0029]本發(fā)明的有益效果:
[0030]在水稻中，TSBCl基因功能的喪失造成莖桿的纖維素含量減少，半纖維素含量增加，厚壁組織細(xì)胞變薄，機(jī)械支撐力下降而形成脆桿性狀。進(jìn)一步的實驗表明，該基因編碼具有2個SANT-DNA結(jié)合域的Myb類轉(zhuǎn)錄因子，主要通過調(diào)控細(xì)胞壁的成份變化來影響植物莖桿的機(jī)械強(qiáng)度。該基因在揭示細(xì)胞壁次生代謝的分子機(jī)理，了解植物機(jī)械輕度的形成機(jī)理等方面具有重要的理論價值。機(jī)械強(qiáng)度是作物的重要農(nóng)藝性狀，在品種改良和秸桿利用中占有重要的地位。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以對植物的機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行改良，培育具有脆而不倒、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新品種，對于解決秸桿焚燒難題、實現(xiàn)秸桿就地還田、保護(hù)環(huán)境等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是水稻野生型秀水110 (WT)與脆桿突變體tsbcl的表型圖；
[0032]圖2是TSBCl在水稻第8染色體上的定位圖(A)、基因預(yù)測(B)和基因結(jié)構(gòu)(C)；
[0033]圖3是TSBCl基因的DNA序列；
[0034]圖4是TSBCl基因的cDNA序列；
[0035]圖5是TSBCl基因編碼的氨基酸序列；
[0036]圖6是載體骨架(A)和互補(bǔ)載體構(gòu)建質(zhì)粒圖譜(B)；
[0037]圖7是空白載體轉(zhuǎn)基因植株(A)`和恢復(fù)野生型表型的轉(zhuǎn)基因植株(B)。
【具體實施方式】
[0038]下面根據(jù)附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0039]實施例1:水稻組織特異性脆桿控制基因TSBCl的克隆
[0040]1、TSBCl基因的初步定位:
[0041]水稻(Oryzasativa L.)組織特異性脆桿突變體 tissue-specific brittleculml (tsbcl)，表現(xiàn)為莖桿脆嫩，易折斷，葉片及其他組織不表現(xiàn)脆性或脆性微弱；野生型材料為粳稻品種“秀水110”。純合的tsbcl突變體和秈稻品種南京11號進(jìn)行雜交，F(xiàn)l代自交，得到F2群體，并從中選出84個具有脆桿表型的單株作為定位群體。在拔節(jié)期每株取I克左右的嫩葉，用來提取總DNA。
[0042]采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因DNA。取大約200mg水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于200 μ I超純水中。每一個SSR反應(yīng)用2 μ I DNA樣
品O
[0043]在TSBCl基因的初步定位階段，對由84個F2單株組成的小群體進(jìn)行SSR分析，根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選用水稻12條染色體上相距約20cM的多態(tài)性SSR弓丨物進(jìn)行連鎖分析，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠(EB)染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，結(jié)果表明第8染色體短臂端上的分子標(biāo)記RM408和RM310與突變基因有明顯的連鎖關(guān)系，交換率分別為12.5%和3.6%，分子標(biāo)記基因型分析表明TSBCl基因定位于兩者之間。在兩標(biāo)記之間進(jìn)一步發(fā)掘多態(tài)性分子標(biāo)記，將TSBCl基因定位在SSR標(biāo)記RM8018和RM5068之間約990kb基因組區(qū)間內(nèi)。(引物序列見表1)
[0044]2、TSBCl基因的精細(xì)定位:
[0045]在初步定位的兩個標(biāo)記RM8018和RM5068之間進(jìn)一步發(fā)掘了新的多態(tài)性SSR標(biāo)記(引物序列見表1 )，通過擴(kuò)大定位群體，選取2307個F2脆性單株組成精細(xì)定位群體，基因型分析最終將TSBCl基因精細(xì)定位在SSR標(biāo)記RM5647和RM22392間102Kb區(qū)間范圍內(nèi)(圖2A)。
[0046]表1、用于TSBCll基因定位的SSR標(biāo)記
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種水稻組織特異性脆桿控制基因TSBC1，其特征在于，所述基因TSBCl所編碼的蛋白質(zhì)具有如序列表所不的氣基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻組織特異性脆桿控制基因TSBC1，其特征在于，所述氨基酸序列還添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻組織特異性脆桿控制基因TSBC1，其特征在于，所述基因TSBCl，具有如序列表所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水稻組織特異性脆桿控制基因TSBCl，其特征在于，所述核苷酸序列還添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。
5.一種與權(quán)利要求1-4任意項所述基因TSBCl相關(guān)的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒具有所述基因TSBCl。
6.一種與權(quán)利要求1-4任意項所述基因TSBCl相關(guān)的植物表達(dá)載體，其特征在于，所述植物表達(dá)載體具有所述基因TSBCl。
7.一種與權(quán)利要求1-4任意項所述基因TSBCl相關(guān)的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞具有所述基因TSBCl。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞中的任意一種。
9.一種培育脆性植物的方法，其特征在于，將具有所述基因TSBCl的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培育脆性植物的方法，其特征在于，包括步驟: (1)將粳稻品種Japonica“秀水110”經(jīng)重離子12C6+在能量:80Mev/u ;劑量:80Gy的輻照處理后，再通過大量篩選而得到的表型穩(wěn)定的脆桿突變體tsbcl ； (2)將所述脆桿突變體tsbcl與南京11品種(秈稻)雜交而形成的F2群體，通過圖位克隆，并利用SSR等分子標(biāo)記對TSBCl位點(diǎn)進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第8染色體短臂上，并介于SSR標(biāo)記RM8018和RM5068之間； (3)通過已測序的TSBCl位點(diǎn)區(qū)域的基因組序列，發(fā)展新的標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位，最終將TSBCl基因定位于SSR標(biāo)記RM5647和RM22392間的102kb范圍之內(nèi)； (4)將TSBCl基因構(gòu)建到常規(guī)植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻脆桿突變體tsbcl中。
【文檔編號】A01H5/00GK103695440SQ201410013353
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】劉斌美, 吳躍進(jìn), 葉亞峰, 傅向東, 陶亮之 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院