一種耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株lj及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ及其應(yīng)用，其分類命名為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus，其保藏編號為:CGMCCNO.7570。本發(fā)明對其進(jìn)行耐鹽度分析、對農(nóng)作物致病性測試以及菌株對致病菌抑制效果試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株耐鹽度為25%-30%，對農(nóng)作物無致病性，菌株對煙草細(xì)菌性病害、病毒性病害、真菌性病害都有較理想的抑制效果。該菌株可與大量元素進(jìn)行復(fù)配，保存期長，有效活菌率高。該菌株可以在鹽堿地使用，有改良土壤，抵抗病害，提高產(chǎn)量等良好效果。本發(fā)明解決了微生物制劑在特殊環(huán)境中為植物防病和促生等起到積極效果，該菌劑有耐鹽促生菌與防病促生菌的作用，適合鹽漬、堿土和酸性土壤的改良。
【專利說明】一種耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干旱和半干旱地區(qū)因長期滴灌栽培引起的土壤次生鹽潰化、化肥使用超量低效及土傳病害嚴(yán)重等作物苗期生產(chǎn)中的突出問題，以及農(nóng)用微生物菌劑在生產(chǎn)及應(yīng)用中存在活菌數(shù)低、功能單一、持效性與穩(wěn)定性差等問題，因此有必要以特殊環(huán)境中的微生物與植物互作為植物耐鹽、防病和促生途徑，對不同生物環(huán)境中耐鹽促生菌與防病促生菌的資源挖掘與整理、生物學(xué)特性與作用機(jī)進(jìn)行制研究。面對日益嚴(yán)重的土壤鹽潰化現(xiàn)象，分離耐鹽基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因耐鹽植物，開發(fā)利用鹽堿地是世界各國密切關(guān)注的研究方向，耐鹽菌也稱為兼性嗜鹽菌，能夠在有鹽環(huán)境和無鹽環(huán)境中生長繁殖，耐鹽度可高達(dá)20%，它最主要的特點(diǎn)是兼性嗜鹽，能生長的環(huán)境范圍廣，是耐鹽菌的基因的豐富來源，雖然生長在極端環(huán)境下的一些極端嗜鹽菌耐鹽度較高，但是在低鹽或無鹽的條件下確不能生長。所以在普通環(huán)境下分離得到的耐鹽菌應(yīng)該具有更普遍的生物學(xué)意義。
[0003]水溶耐鹽功能菌適合鹽潰、堿土和酸性土壤的改良。水溶耐鹽功能菌能分解出多種代謝產(chǎn)物，通過提高植物體內(nèi)酶的活性，促進(jìn)作物生長發(fā)育，刺激根系分生組織細(xì)胞的分裂與增長，使幼苗發(fā)根快，次生根增多，根的數(shù)量增加，根系伸長，因而能大大加強(qiáng)作物吸收能力。水溶耐鹽功能菌增殖時會釋放出高活性的分解酵素及多種促進(jìn)因子，提高肥料使用率，促進(jìn)植物吸收養(yǎng)分；溶解土壤中無效態(tài)磷，提高肥效；產(chǎn)生的聚麩胺酸具有較強(qiáng)的保水保肥能力。如美國亞利桑那大學(xué)已收集了數(shù)千種鹽生植物，發(fā)現(xiàn)其中有幾種可望用于糧食作物；用硫酸和硫酸鐵快速中和土壤堿性。如美國在西部許多地區(qū)采用硫酸銨降低PH，以提高土壤透水性；在酸性土壤上種植耐酸多年生牧草或施用石灰石、硅酸鹽和酸化磷礦粉
坐寸ο
[0004]水溶耐鹽功能菌適合配合生物肥料、有機(jī)肥肥料、生物菌肥等一起使用，水溶耐鹽功能菌更適合添加到水溶性肥料中施用，如噴灌、滴灌的，有添加到?jīng)_施肥、葉面肥、復(fù)合肥、有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥、大量元素水溶肥、中量元素水溶肥以及微量元素水溶肥等。
[0005]我國鹽堿地面廣量大，改造治理及合理開發(fā)利用這些資源是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一，也對改善生態(tài)環(huán)境，推動區(qū)域經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)可持續(xù)發(fā)展具有特別重要意義。其中生物改良具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，主要包括種植耐鹽植物、使用微生物菌肥等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ及其應(yīng)用，本發(fā)明從鹽堿地區(qū)和鹽場淤泥等生態(tài)條件下分離篩選較高耐鹽度的菌株，可為耐鹽基因的克隆及轉(zhuǎn)基因耐鹽植物的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，更可以用于耐鹽微生物菌劑的研究與開發(fā)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):[0008]本發(fā)明篩選到一種耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ，其分類命名為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為:CGMCC N0.7570。
[0009]所述菌株LJ的耐NaCl的耐鹽度為25%_30%。所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株U菌落呈白色，表面粗糙，邊緣不規(guī)則，LJ菌落大小為2-4mm，易挑起，扁平，無突起，粉質(zhì)，菌體短桿狀，具運(yùn)動性，可形成芽孢。
[0010]本發(fā)明提供了所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備抑菌劑中的應(yīng)用，所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株U對煙草黑脛病病原菌、煙草赤星病病原菌、煙草鐮刀菌、煙草青枯病病原菌和煙草普通花葉病毒有抑菌作用。
[0011]所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ對小麥、番茄、辣椒和黃瓜均無致病性。
[0012]本發(fā)明提供了所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備微生物肥料中的應(yīng)用，所述菌株LJ與大量元素的水溶肥料復(fù)配，復(fù)配后活菌數(shù)達(dá)4億/g以上。
[0013]本發(fā)明還提供了所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備用于生物修復(fù)鹽堿地的微生物菌劑中的應(yīng)用，其中所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌含菌量為300億/g以上，菌劑使用量為2kg/畝。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明從鹽堿地篩選到耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株，對該菌株進(jìn)行遺傳分析學(xué)測試和生理生化實(shí)驗(yàn)，確定該菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌；并對其進(jìn)行耐鹽度分析、對農(nóng)作物致病性測試以及菌株對致病菌抑制效果試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株耐鹽度為25-30%，所述菌株LJ對農(nóng)作物無致病性，菌株對煙草細(xì)菌性病害、病毒性病害、真菌性病害都有較理想的抑制效果。該菌株可與大量元素進(jìn)行復(fù)配，保存期長，有效活菌率高。該菌株可以在鹽堿地使用，有改良土壤，抵抗病害，提高產(chǎn)量等良好效果。本發(fā)明解決了微生物制劑在特殊環(huán)境中為植物防病和促生等起到積極效果，該菌劑有耐鹽促生菌與防病促生菌的作用，適合鹽潰、堿土和酸性土壤的改良。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ的平板培養(yǎng)圖。
[0016]圖2是本發(fā)明所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ的耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0018]實(shí)施例1
[0019]一、耐鹽菌株的分離及篩選
[0020] 2012年7月4日從山東濱州煙田煙株根際土壤采集土樣24份，各取土樣Ig懸浮于100mL無菌水中，并以此稀釋至IO5倍。采用Gibbons改良培養(yǎng)基或牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，Gibbons改良培養(yǎng)基配方:酪素水解物5.0g，檸檬酸鈉3.0g，酵母浸粉10.0g,KC12.0g,蛋白胨，5.0g, MgSO4.7H20,20g NaCllOOg, ρΗ7.0。利用 1%、4%、7%、10% 的 NaCl 逐級篩選耐鹽菌株。用移液器分別取土壤稀釋液0.1ml涂布于兩種培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)2~3天，選取在10%鹽濃度生長良好的菌落，經(jīng)反復(fù)劃線純化后保存?zhèn)溆茫Y選到一株耐鹽菌株U。[0021]二、耐鹽菌株LJ的鑒定
[0022]將篩選到的菌株LJ進(jìn)行平板培養(yǎng)，可見菌落呈白色，表面粗糙，邊緣不規(guī)則，LJ菌落大小為2-4mm，易挑起，扁平，無突起，粉質(zhì)，菌體短桿狀，具運(yùn)動性，可形成芽孢。菌株的平板培養(yǎng)圖片如圖1所示。
[0023]對篩選到的耐鹽菌株LJ進(jìn)行細(xì)菌分子遺傳學(xué)分類鑒定:對菌株LJ提取DNA，以該DNA為模板，16S rDNA通用引物為引物，對16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增的片段直接進(jìn)行序列測定。將測序的結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進(jìn)行比對，結(jié)果顯示該菌株16SrDNA序列與GenBank基因庫中芽抱桿菌屬中的Bacillus methylotrophicus的16s rDNA序列同源度最高，同源率達(dá)到99%。通過DNAMAN6.0對Genbank中已有的芽孢桿菌屬的16SrDNA序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯不，菌株LJ16S rDNA與Bacillus methylotrophicus同源性最高，因此可以初步判定該菌株為芽孢桿菌屬的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。
[0024]參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，通過對耐鹽菌株進(jìn)行生理生化測定進(jìn)行初步鑒定:革蘭氏陽性，V-P反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)陽性，吲哚陽性，可厭氧生長，能水解淀粉，硫化氫陰性，能利用檸檬酸鹽，液化明膠，硝酸鹽還原、過氧化氫酶、接觸酶陽性，能水解酪素。
[0025]根據(jù)上述鑒定結(jié)果，該菌株LJ鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus。
[0026]將篩選到的菌株LJ進(jìn)行菌種保藏，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所;保藏日其月:2013年5月8日；保藏編號為:Bacillus methylotrophicus的編號為CGMCCN0.7570。
[0027]三、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ的耐鹽性分析
[0028]將分離純化的耐鹽菌株LJ菌懸液，分別轉(zhuǎn)接相同量到不同鹽濃度的液體培養(yǎng)基中集中，37°C，200r/min搖床培養(yǎng)，觀察生長情況，每隔一段時間測其菌濃度(0D600)，以確定細(xì)菌耐鹽程度。
[0029]耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，可見菌株LJ對氯化鈉有較寬的適應(yīng)范圍，菌株在無鹽情況下不發(fā)生自溶現(xiàn)象，在鹽濃度達(dá)到30%情況下仍然可保持較高的菌體濃度，0-35%的鹽濃度下均可生長，最適鹽濃度為25%-30%。
[0030]四、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ對農(nóng)作物致病性測試實(shí)驗(yàn)
[0031]用無菌注射器將耐鹽菌株LJ的懸浮液注射到小麥、番茄、辣椒和黃瓜的苗莖基部，每苗0.5ml，重復(fù)12次，保濕24h，3天后開始觀察苗莖基部是否出現(xiàn)病斑。
[0032]試驗(yàn)結(jié)果表明，將耐鹽菌懸液接種到小麥、煙草、玉米和西瓜幼苗莖基部，培養(yǎng)3天后均無明顯病斑出現(xiàn)。因此，可以確認(rèn)該株耐鹽菌對上述4種作物無潛在的致病性。
[0033]五、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ對真菌性、細(xì)菌性病害、病毒性病害的抑制作用
[0034]采用平板對峙法測試所述菌株LJ對指示菌的抑菌活性，9cm PDA平板中央接種指示菌煙草黑脛病病原菌，在距離指示菌菌塊2.8cm處接種待測試單菌落，另一側(cè)不接菌，以供測量空白指示菌半徑，25°C恒溫培養(yǎng)5d，觀察指示菌菌絲生長情況，測量抑菌結(jié)果。
[0035]重復(fù)上述步驟，將菌株LJ用于抑制煙草鏈格孢菌(赤星病病原菌)、煙草黑脛病病原菌、尖鐮孢菌煙草變種的實(shí)驗(yàn)中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，該耐鹽菌株LJ對病害的抑制率均可達(dá)到60%以上。[0036]采用雙層平板法，進(jìn)行菌株LJ對煙草青枯病的拮抗作用實(shí)驗(yàn)。先在培養(yǎng)皿中倒入底層固體培養(yǎng)基，凝固后再倒入含有青枯病病原菌和一定稀釋度待檢測菌株的發(fā)酵液的半固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)一段時間后，觀察透明圈大小，測量抑菌結(jié)果，該菌株對青枯病有較強(qiáng)的抑制作用。
[0037]采用局部枯斑法，將充分發(fā)病的TMV煙草嫩葉用滅菌研缽研磨成勻漿，與滅菌后的磷酸緩沖液(PH7.0)1:40比例稀釋。左半葉接種NB培養(yǎng)基與病毒等體積混和液作對照，右半葉接種活性菌株發(fā)酵上清液與病毒等體積混和液作處理，接種后立即用水噴灑葉面，3d后統(tǒng)計枯斑數(shù)目，抑制率計算方法如下:抑制率(％)=[(對照枯斑數(shù)-處理枯斑數(shù))/對照枯斑數(shù)]X 100%。菌株對TMV的抑制效果達(dá)到了 72%，該菌株對其他病害的抑制效果亦非常突出，可以作為廣譜型抗病害生防菌株。
[0038]表1菌株LJ對各種病害致病菌的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株U，其特征在于:其分類命名為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為:CGMCCN0.7570。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株U，其特征在于:所述菌株LJ的耐NaCl的耐鹽度為25%-30%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株U，其特征在于:菌落呈白色，表面粗糙，邊緣不規(guī)則，LJ菌落大小為2-4 mm,易挑起，扁平，無突起，粉質(zhì)，菌體短桿狀，具運(yùn)動性，可形成芽孢。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備抑菌劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ對煙草黑脛病病原菌、煙草赤星病病原菌、煙草鐮刀菌、煙草青枯病病原菌和煙草普通花葉病毒有抑菌作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備抑菌劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ對小麥、番茄、辣椒和黃瓜均無致病性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備微生物肥料中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備微生物肥料中的應(yīng)用，其特征在于:所述菌株LJ與大量元素的水溶肥料復(fù)配，復(fù)配后活菌數(shù)4億/g以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備用于生物修復(fù)鹽堿地的微生物菌劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的耐鹽性甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株LJ在制備用于生物修復(fù)鹽堿地的微生物菌劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌含菌量為300億/g以上，菌劑使用量為2 kg/畝。
【文檔編號】C05F11/08GK104017750SQ201410148953
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】單俊偉, 翟熙倫, 王海華 申請人:青島海大生物集團(tuán)有限公司