專利名稱：畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建方法和右旋糖酐酶的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和蛋白質(zhì)的分泌表達領(lǐng)域，特別是分泌表達右旋糖酐酶的畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建，以及右旋糖酐酶的制備工藝。
背景技術(shù)：
在制糖工業(yè)中，由于受甘蔗品種、天氣、土壤以及糖廠生產(chǎn)環(huán)境的影響，物料中都含有不同量的葡聚糖，造成直接的糖分損失高達1.0%左右；葡聚糖的存在使制糖工藝過程困難增加，主要體現(xiàn)在虛假旋光度的存在、糖液粘度增加、過濾困難、結(jié)晶不正常、能耗增加、品質(zhì)降低等，因此而造成的糖分損失更是直接糖分損失的3—5倍，即傳統(tǒng)制糖過程中因葡聚糖原因造成糖分損失4%左右。因此，如何減少葡聚糖以及控制其負面影響是我國糖業(yè)界一個迫切需要解決的問題。
我國90%以上的制糖企業(yè)采用亞硫酸法制糖工藝，此工藝為了消除葡聚糖等大分子物質(zhì)的影響，采用的清凈工藝通常加入石灰、二氧化硫、聚丙烯酰胺(絮凝劑)、表面活性劑，殺菌劑和脫色劑等數(shù)種物質(zhì)當作提純劑除去葡聚糖、淀粉等，但其清凈效率不高、造成環(huán)境污染，清凈前后的純度差、并增加了外源的非糖物質(zhì)，造成產(chǎn)出的白糖中葡聚糖的含量較高，這也就決定了后工序不可能結(jié)晶出高品質(zhì)糖；直接影響其作為食品原料的加工性狀，如造成飲料渾濁、影響巧克力等糖果的成形和包裝等。隨著人們對食糖及添加食糖的食品質(zhì)量的要求越來越高，葡聚糖的負面影響顯得越來越嚴重。因此，改進現(xiàn)有清凈工藝，提高清凈工藝的效率、減少葡聚糖造成的損失及其負面影響是我國制糖行業(yè)升級的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸之一。
右旋糖酐酶是一種具有催化葡聚糖降解的活性蛋白質(zhì)，可以在較溫和的條件下，除去葡聚糖，將其轉(zhuǎn)化成小分子的單糖或寡糖，降低粘度、加快沉降過濾速度、減少蒸煮時間、降低蒸汽消耗、提高糖的品質(zhì)等，增加蔗糖的回收率。右旋糖酐酶在制糖中的作用效果非常顯著，據(jù)制糖專家James報道，在制糖過程中加入右旋糖酐酶后，糖分回收提高3—5%,糖的質(zhì)量也明顯提高。右旋糖酐酶的應(yīng)用能夠顯著的提升制糖產(chǎn)業(yè)的品質(zhì)和竟爭力。酶法清凈工藝對于提高效率、降低能耗和減少排污有顯著效果，是典型的綠色化學(xué)處理工藝。高效右旋糖酐酶及復(fù)合酶制劑的開發(fā)成功，能夠?qū)崿F(xiàn)節(jié)能降耗、提升品質(zhì)、提升竟爭力， 可有效消除葡聚糖在制糖行業(yè)的負面影響，無疑對制糖行業(yè)清潔生產(chǎn)、技術(shù)進步及促進產(chǎn) 業(yè)發(fā)展具有顯著的積極意義。
目前右旋糖酐酶主要是從薄青霉(Penicillium lilacinum )和細麗毛殼屬(Chaetomium sp.)等菌株培養(yǎng)得到，亦有利用上述來源的基因進行工程菌構(gòu)建的報道，但制備的右旋 糖酐酶不能很好地適應(yīng)制糖過程中的溫度和pH,且制備成本高，因此尚未有大量應(yīng)用于 制糖工業(yè)中的右旋糖酐酶的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是
(1) 提出能分泌表達畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建方法；
(2) 提出利用畢赤酵母工程菌株制備右旋糖酐酶的工藝，其具有培養(yǎng)基碳源普通廉 價，工藝條件簡單，制造成本低等優(yōu)點。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 (1 ).設(shè)計寡核苷酸引物(Primerl: GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2: ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG),引物中分別引入限制性內(nèi)切酶EcoRI和Notl, 以油脂酵母1390基因組DNA為模板；克隆得到右旋糖酐酶基因，并進行測序鑒定。
(2) .利用分泌表達載體pPIC9K，將EcoRI和Notl雙酶切后的右旋糖酐酶基因插入 pPIC9K的多克隆位點(EcoRI和Notl)，并通過連接、轉(zhuǎn)化、酶切等分子生物學(xué)技術(shù)搡作， 構(gòu)建出整合分泌型表達載體(pPIC9K—139)。
(3) .用限制性內(nèi)切酶BglII，對重組表達載體(pPIC9K—139)線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢 赤酵母GS115,借助a—facor分泌信號肽，實現(xiàn)右旋糖酐酶的高效分泌表達，在含有G418 的YEPD平板上進行篩選，測定右旋糖酐酶酶活，得到重組畢赤酵母工程菌株(GS115 —139),該畢赤酵母工程菌株(GS115—139)的右旋糖酐酶可為多拷貝。
一種利用上述畢赤酵母工程菌株(GS115 — 139)制備右旋糖酐酶的工藝，其特征包 括如下工序
(1 )培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.02。/。泡敵組成；
(2) 接種將畢赤酵母工程菌株(GS115—139)接種到上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(3) 誘導(dǎo)接種培養(yǎng)一定時間后，在培養(yǎng)基中流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)右旋糖酐酶，甲醇濃 度在0~1%范圍；
(4) 分離提純右旋糖酐酶釆用離心、過濾的方法分離細胞，然后選擇適當超濾膜 截流、濃縮發(fā)酵液、進行低溫噴霧干燥或載體吸附，得到右旋糖酐酶。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下實質(zhì)性特點和顯著進步
(1)成功實現(xiàn)右旋糖酐酶基因在畢赤酵母中的有效表達，構(gòu)建了能高效分泌表達右 旋糖酐酶的工程菌株，表達量比原始斯達氏油脂酵母菌株AS2.1390高6倍以上。
(2 )本發(fā)明通過BRP分泌系統(tǒng)和a—facor分泌信號肽實現(xiàn)右旋糖酐酶在工程菌中的 分泌表達；克隆宿主菌采用生長速度快、遺傳背景清楚的畢赤酵母。
(3)通過對右旋糖酐酶基因的分子定向進化與改造，以及分泌表達重組載體的構(gòu)建，
實現(xiàn)右旋糖酐酶的高效分泌表達,并以廉價碳源為原料，實現(xiàn)右旋糖酐酶的發(fā)酵工藝放大；
最大限度的降低成本。
具體實施例方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明
酶活定義為1單位酶活(U)表示為lml酶在PH為5.0，溫度55。C下，lmin分解 葡聚糖(dextran) T2000產(chǎn)生1 m mol葡萄糖。 斯達氏油脂酵母AS2.1390的培養(yǎng)
(1) 培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖組成；
(2) 工藝條件溫度為25 35。C， PH5.0-7.0,溶氧量大于20%;
(3) 誘導(dǎo)條件在培養(yǎng)24-48小時后，添加葡聚糖作為誘導(dǎo)劑。 培養(yǎng)96小時后測定培養(yǎng)液中右旋糖酐酶酶活為5U。
實施例1
一種高產(chǎn)右旋糖酐酶的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其包括如下步驟
(1)設(shè)計寡核酐酸引物Primerl: GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2: ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG,引物中分別引入限制性內(nèi)切酶EcoRI和Notl,以油脂酵母13卯基因組DNA為模板，克隆得到右旋糖酐酶基因；
(2 )利用分泌表達載體pPIC9K,將雙酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克 隆位點(EcoRI和Notl),并通過連接、轉(zhuǎn)化、酶切等分子生物學(xué)技術(shù)操作，構(gòu)建出整合 分泌型表達載體pPIC9K—139;
(3)用限制性內(nèi)切酶BglII,對重組表達載體pPIC9K—139線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤 酵母GSU5，采用a—factor,實現(xiàn)右旋糖酐酶的分泌表達，在含有G418的YEPD平板 上進行篩選，得到重組畢赤酵母工程菌株GS115—139，該畢赤酵母工程菌株GS115—139 的右旋糖酐酶基因為多拷貝。 實施例2
一種制備右旋糖酐酶的工藝(搖瓶發(fā)酵培養(yǎng))，其步驟如下
(1) 培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.02。/0
甘油組成；
(2) 接種將實施例1的畢赤酵母工程菌株GS115—139按種到上述培養(yǎng)基培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為溫度為28 30'C， PH5.0-5.6,轉(zhuǎn)速250r/min;
(3) 誘導(dǎo)產(chǎn)右旋糖酐酶在接種培養(yǎng)24小時后，添加甲醇作為誘導(dǎo)劑，甲醇濃度在 0~ 1%范圍。培養(yǎng)96小時后測定培養(yǎng)液中右旋糖酐酶酶活為26U。
(4) 分離提純右旋糖酐酶釆用離心、過濾的方法分離細胞，然后選擇適當超濾膜 截流、濃縮發(fā)酵液、進行低溫噴霧干燥或載體吸附，得到右旋糖酐酶(測定其酶活為200U)。
實施例3
一種制備右旋糖酐酶的工藝(搖瓶發(fā)酵培養(yǎng))，其步驟如下
(1 )培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5o/o(w/v)葡萄糖十0.020/0 泡敵組成；
(2) 接種將實施例1的畢赤酵母工程菌株GS115—139按種到上述培養(yǎng)基培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為溫度為30 33。C, PH5.0-5.5,轉(zhuǎn)速200r/min;
(3) 誘導(dǎo)產(chǎn)右旋糖酐酶在接種培養(yǎng)48小時后，添加甲醇作為誘導(dǎo)劑，甲醇濃度在 0~1%范圍。培養(yǎng)96小時后測定培養(yǎng)液中右旋糖酐酶酶活為30U。
(4) 分離提純右旋糖酐酶采用離心、過濾的方法分離細胞 然后選擇適當超濾膜截流、濃縮發(fā)酵液、進行低溫噴霧干燥或載體吸附，得到右旋糖酐酶(測定其酶活為200U)。 實施例4
一種制備右旋糖酐酶的工藝(30L發(fā)酵罐發(fā)酵)，其步驟如下
(1 )培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.02。/0 甘油組成；
(2) 接種將實施例1的畢赤酵母工程菌株GS115—139按種到上述培養(yǎng)基培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件溫度為30 32'C, PH6.0-6.5,溶氧量20%;
(3) 誘導(dǎo)條件在接種培養(yǎng)24小時后，流加甲醇，甲醇濃度在0~1%范圍。培養(yǎng) 96小時后測定培養(yǎng)液中右旋糖酐酶酶活為150U。
(4) 分離提純右旋糖酐酶釆用離心、過濾的方法分離細胞，然后選擇適當超濾膜 截流、濃縮發(fā)酵液、進行低溫噴霧干燥或載體吸附，得到右旋糖酐酶(測定其酶活為 訓(xùn)OU)。
實施例5
一種制備右旋糖酐酶的工藝(30L發(fā)酵罐發(fā)酵)，其步驟如下
(1 )培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.020/。 泡敵組成；
(2) 接種將實施例1的畢赤酵母工程菌株GS115—139按種到上述培養(yǎng)基培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件溫度為28-32。C, PH5.0-7.0,溶氧量23%;
(3) 誘導(dǎo)條件在接種培養(yǎng)48小時后，流加甲醇，甲醇濃度在0~1%范圍。培養(yǎng) 96小時后測定培養(yǎng)液中右旋糖酐酶酶活為165U。
(4) 分離提純右旋糖酐酶釆用離心、過濾的方法分離細胞，然后選擇適當超濾膜 截流、濃縮發(fā)酵液、進行低溫噴霧干燥或載體吸附，得到右旋糖酐酶(測定其酶活為 1180U)。序列表
〈110〉廣州甘蔗糖業(yè)研究所
<120>畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建方法和右旋糖酐酶的制備工藝
〈140> 200910039057.1 〈141> 2009-04-28
〈160> 2
〈210> 1
〈211〉 23
〈212> ■
<213>寡核酐酸引物
<400> Primerl
GCGCGAATTC ATGACATTAA TCT 23
<210> 2 〈211〉 26 〈212〉 ■
<213>寡核酐酸引物 〈400> Primer2
ATCGCGGCCG CGTTTATGGA CCATTG 2權(quán)利要求
1.一種畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟(1)設(shè)計寡核酐酸引物Primer1GCGCGAATTCATGACATTAATCT和Primer2ATCGCGGCCGCGTTTATGGACCATTG，引物中分別引入限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI，以油脂酵母1390基因組DNA為模板，克隆得到右旋糖酐酶基因；(2)利用分泌表達載體pPIC9K，將雙酶切后的右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位點(EcoRI和NotI)，并通過連接、轉(zhuǎn)化、酶切等分子生物學(xué)技術(shù)操作，構(gòu)建出整合分泌型表達載體(pPIC9K-139)；(3)用限制性內(nèi)切酶Bgl II，對重組表達載體(pPIC9K-139)線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，采用α-factor，實現(xiàn)右旋糖酐酶的分泌表達，在含有G418的YEPD平板上進行篩選，得到重組畢赤酵母工程菌株(GS115-139)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于所述的畢赤 酵母工程菌株(GS115—139)的右旋糖酐酶基因為多拷貝。
3. —種制備右旋糖酐酶的工藝，其特征包括如下工序為.(1 )培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)培養(yǎng)基由10 x Basal salt+250 x PTMl+5。/。(w/v)葡萄糖+0.020/0 泡敵組成；(2) 接種將如權(quán)利要求1或2所述的畢赤酵母工程菌株(GS115—139)接種到上 述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25 35。C， PH5.(K7.0，溶氧量大于20%;(3) 誘導(dǎo)產(chǎn)右旋糖酐酶接種培養(yǎng)24—48小時后，流加甲醇，甲醇濃度在0~1%范圍；(4) 分離提純右旋糖酐酶采用離心、過濾的方法分離細胞，然后選擇適當超濾膜 截流、濃縮發(fā)酵液、進行低溫噴霧干燥或載體吸附，得到右旋糖酐酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和蛋白質(zhì)的分泌表達領(lǐng)域，提出一種用于制造右旋糖酐酶的畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建方法，包括步驟(1)設(shè)計寡核苷酸引物并以油脂酵母1390基因組DNA為模板；克隆得到右旋糖酐酶基因；(2)利用分泌表達載體pPIC9K，將右旋糖酐酶基因插入pPIC9K的多克隆位點(EcoRI和NotI)，構(gòu)建出整合分泌型表達載體pPIC9K-139；(3)對重組表達載體pPIC9K-139線性化，實現(xiàn)右旋糖酐酶的高效分泌表達，篩選得到重組畢赤酵母工程菌株GS115-139。本發(fā)明成功實現(xiàn)右旋糖酐酶基因在畢赤酵母中的有效表達，構(gòu)建了能高效分泌表達右旋糖酐酶的工程菌株；實現(xiàn)右旋糖酐酶的發(fā)酵工藝放大。
文檔編號C12N15/81GK101638666SQ20091003905
公開日2010年2月3日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者盧英華, 張遠平, 敬科舉, 曾練強, 李雨虹, 梁達奉, 蟻細苗, 亭 郭, 鐘映萍, 陳龍軍, 黃玉南 申請人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所