一種角質(zhì)酶及其制備方法與生產(chǎn)專(zhuān)用菌株的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種角質(zhì)酶及其制備方法與生產(chǎn)專(zhuān)用菌株。本發(fā)明所提供的角質(zhì)酶生產(chǎn)專(zhuān)用菌株為太瑞斯梭孢殼（Thielavia?terrestris）CAU709，它在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC?No.6233。本發(fā)明提供的所述太瑞斯梭孢殼（Thielavia?terrestris）CAU709?CGMCC?No.6233具有高產(chǎn)角質(zhì)酶的能力，通過(guò)硫酸銨沉淀、弱陽(yáng)離子層析和強(qiáng)陰離子層析得到10%回收率的高純度角質(zhì)酶。熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性分析表明：該角質(zhì)酶在65℃以下具有很好的熱穩(wěn)定性并且在較寬范圍的pH范圍具有很好的穩(wěn)定性，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。合成樹(shù)脂的降解分析表明該酶可以降解PET、PBS和PCL，在治理生活垃圾的污染方面具有廣闊應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種角質(zhì)酶及其制備方法與生產(chǎn)專(zhuān)用菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種角質(zhì)酶及其制備方法與生產(chǎn)專(zhuān)用菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]角質(zhì)酶[EC.3.1.1.74]是一種可以降解角質(zhì)并釋放脂肪酸單體的水解酶，是α / β水解酶家族中分子量較小的成員(Holmquist, Μ., 2000.Alpha/Beta-hydrolasefold enzymes:structures，functions and mechanisms.Curr.Protein.Pept.Sc1.1，209-235)。角質(zhì)酶因其在制藥、食品、肽合成等工業(yè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景而受到廣泛關(guān)注(Pio，T.F.，Macedo，G.A.，2007.0ptimiaing the productionof cutinase by Fusarium oxysporum using response surface methodology.Enzyme.Microb.Technol.41，613-619)。 自 Purdy 等人(Purdy，R.Ε.，Kolattukudy，P.E.，1975.Hydrolysis of plant cuticle by plant pathogens.Properties ofcutinase I，cutinase II，and a nonspecific esterase isolated from Fusariumsolani pis1.Biochemistry.14, 2832-2840)首次從 Fusarium solani pisi 分離出角質(zhì)酶以來(lái)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有十多個(gè)屬的真菌或細(xì)菌可以產(chǎn)角質(zhì)酶，如高溫單胞菌屬(Chen, S.，Tong, X.，Woodard, R.W.，Duj G.，Wuj J.，Chen, J.，2008.1dentification andcharacterization of bacterial cutinase.J.Biol.Chem.283，25854-25862)、假單胞菌屬(Sebastian,J.，Kolattukudy, P.E.，1988.Purification and characterization ofcutinase from a fluorescent Pseudomonas putida bacterial strain isolated fromphyllosphere.Arch.Biochem.Biophys.263，77-85)、鏈霉菌屬(Lin, T.S.，Kolattukudy,P.E.，1980.Structural studies on cutinase, a glycoprotein containing novel aminoacids and glucuronic acid amide at the N terminus.Eur.J.Biochem.106，341-351)、炭疽菌屬(Chen, Z.，F(xiàn)ranco, C.F.，Baptistaj R.P.，2007.Purification and identificationof cutinases from Colletotrichum kahawae and Colletotrichum gloeosporioides.App1.Microbiol.Biotechnol.73，1306-1313)和德刀菌屬(Purdy, R.E.，Kolattukudy,P.E., 1975.Hydrolysis of plant cuticle by plant pathogens.Properties of cutinaseI，cutinase II，and a nonspecific esterase isolated from Fusarium solani pis1.Biochemistry.14，2832-2840)等微生物中的角質(zhì)酶也已經(jīng)得到分離和鑒定。角質(zhì)酶既可以水解水溶性酯又可以水解水不溶性的甘油三酯，因此被認(rèn)為是介于羧酸酯酶和脂肪酶的—種酶(Sulaiman，S.，Yamatoj S.，Kanayaj E.，Jaekimj J.，Kogaj Y.，Takanoj K.，Kanayaj S.，2012.1solation of a novel cutinase homolog with polyethylene terephthalatedegrading activity from leaf-branch compost using a metagenomic approach.Appl Environ.Microb 78，1556-1562)。正是由于角質(zhì)酶這一廣泛的底物特性，它可廣泛應(yīng)用于食品、制藥以及化學(xué)工業(yè)中，并且在某些領(lǐng)域中比羧酸酯酶和脂肪酶更具有優(yōu)勢(shì)。比如在奶制品工業(yè)中角質(zhì)酶可以用來(lái)水解脂肪以生產(chǎn)低脂奶制品；傳統(tǒng)加酶洗衣粉中添加脂肪酶可以提高去油污能力，而角質(zhì)酶在水解酯類(lèi)物質(zhì)時(shí)不像脂肪酶需要鈣離子的參與(Carvalho, C.M.L., Aries-Barros, M.R., and Cabral, J.M.S., 1999.Curinases: frommolecular level to bioprocess development.Biotechnol.Bioeng.26, 442-458),所以角質(zhì)酶在生產(chǎn)加酶洗衣粉中更具有優(yōu)勢(shì)；在食品工業(yè)的香料生產(chǎn)中，角質(zhì)酶可以被用來(lái)催化合成短鏈脂肪酸酯；利用動(dòng)物或植物油脂與甲醇反應(yīng)可以制備生物柴油，角質(zhì)酶可以水解水溶性和乳化的甘油三酯所以它在生產(chǎn)生物柴油方面具有很大的應(yīng)用前 景(Dutta, K., Sen, S., Veeranki, V.D., 2009.Production, characterization andopplications of microbial cutinases.Process.Biochem.44, 127-134)；在生物降解方面，角質(zhì)酶可以降解一些有毒物質(zhì)比如殺蟲(chóng)劑馬拉松，也可以降解生活及工業(yè)垃圾比如聚合樹(shù)月旨 PET (Polyethylene terephthalat)、PCL (polycaprolactone)> PAN(Polyacrylonitrile)> PBS (Poly-(butylenes succinate))和尼龍 6.6 等。因此角質(zhì)酶在現(xiàn)代食品工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域中占有重要的地位，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]目前，世界各國(guó)都致力于開(kāi)發(fā)多功能角質(zhì)酶，日本在角質(zhì)酶降解合成樹(shù)脂以治理生活垃圾污染方面研究的較為深入。我國(guó)人口眾多，能源緊缺和生活垃圾處理問(wèn)題無(wú)疑重大且亟待解決。利用角質(zhì)酶來(lái)制備生物柴油以開(kāi)發(fā)新能源可以有效緩解能源緊缺的現(xiàn)狀，通過(guò)角質(zhì)酶降解生活垃圾中的塑料有望成為治理生活垃圾污染的重要途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)角質(zhì)酶的專(zhuān)用菌株。
[0005]本發(fā)明所提供的生產(chǎn)角質(zhì)酶的專(zhuān)用菌株具體為太瑞斯梭孢殼(Thielaviaterrestris) CAU709。該菌已于2012年6月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)06 110:，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC N0.6233。
[0006]所述太瑞斯梭抱殼(Thielaviaterrestris) CAU709 CGMCC N0.6233 菌落鋪展生長(zhǎng)，白色，最后菌落中央變成粉紅色，菌落背面有紅棕色色素產(chǎn)生(圖1A)。采用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲透明，從頂端到基部依次形成緊密、規(guī)則的隔膜，有分化的分生孢子梗，分生孢子梗有隔膜，分生孢子相互連接呈鏈狀或聚成球狀，分生孢子無(wú)色至淡黃色，呈鴨梨狀(圖1B)。該菌最適生長(zhǎng)溫度為45°C。其18S rDNA序列如序列表中序列I所示。
[0007]所述太瑞斯梭抱殼(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233在制備角質(zhì)酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用所述太瑞斯梭孢殼(Thielaviaterrestris) CAU709 CGMCC N0.6233 制備角質(zhì)酶的方法。
[0009]該方法具體包括如下步驟:發(fā)酵培養(yǎng)所述太瑞斯梭孢殼(Thielavia terrestris)CAU709 CGMCC N0.6233，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即獲得角質(zhì)酶。
[0010]在上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度可為35°C -55°C，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間可為2-6天，所述發(fā)酵培養(yǎng)的方式可為旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度具體為50°C，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間具體為3天。
[0011]所述旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速可為150-250轉(zhuǎn)/分鐘，具體如200轉(zhuǎn)/分鐘；旋轉(zhuǎn)半徑可為20-30mm,具體如26mm。[0012]在上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有小麥麩皮、橄欖油、胰蛋白胨、KH2PO4' MgSO4.H20、CaCl2' FeSO4.H2O 和吐溫 80 ；
[0013]所述小麥麩皮在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有2_3g所述小麥麩皮，所述橄欖油在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.5-1.5g所述橄欖油，所述胰蛋白胨在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.5-1.5g所述胰蛋白胨，所述KH2PO4在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.1-0.2g所述KH2PO4，所述MgSO4.Η20在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.01-0.1g所述MgSO4.Η20，所述CaCl2在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.01-0.05g所述CaCl2，所述FeSO4.Η20在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0-0.005g所述FeSO4.Η20，所述吐溫80在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0-0.5g所述吐溫80，所述培養(yǎng)基的pH為6.0-7.0。 [0014]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基的配方具體如下:小麥麩皮25g，橄欖油10g，胰蛋白胨 10g, KH2PO4 1.5g，MgSO4.H2O 0.5g，CaCl2 0.2g，F(xiàn)eSO4.H2O 0.01g，吐溫 80
1.0g,定容至 1L, pH6.5。IX IO5Pa 下濕熱滅菌 20min。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種角質(zhì)酶。
[0016]本發(fā)明所提供的角質(zhì)酶具有序列表中序列2-序列6所示的氨基酸序列。
[0017]所述角質(zhì)酶可由所述太瑞斯梭孢殼(Thielavia terrestris) CAU709CGMCCN0.6233分泌得到。
[0018]所述太瑞斯梭抱殼(Thielaviaterrestris) CAU709CGMCC N0.6233 在如下 a)和
b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0019]a)降解角質(zhì)；
[0020]b)降解樹(shù)脂，特別是合成樹(shù)脂。
[0021]在上述應(yīng)用中，所述樹(shù)脂具體可為合成樹(shù)脂中的聚己內(nèi)酯(PCL)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚丁二酸丁二醇酯(PBS)中的至少一種。
[0022]在本發(fā)明中，所述角質(zhì)具體為角質(zhì)纖維。
[0023]本發(fā)明提供的所述太瑞斯梭抱殼(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233具有高產(chǎn)角質(zhì)酶的能力，通過(guò)硫酸銨沉淀、弱陽(yáng)離子層析和強(qiáng)陰離子層析得到10%回收率的高純度角質(zhì)酶。有機(jī)溶劑穩(wěn)定性分析表明該角質(zhì)酶在多種有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，可以用于非水反應(yīng)體系中制備生物柴油，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。合成樹(shù)脂的降解分析表明該酶可以降解PET、PBS和PCL，在治理生活垃圾的污染方面具有廣闊應(yīng)用前景。
[0024]保藏說(shuō)明
[0025]菌種名稱(chēng):太瑞斯梭孢殼
[0026]拉丁名:(Thielaviaterrestris)
[0027]菌株編號(hào):CAU709
[0028]保藏機(jī)構(gòu):中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0029]保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱(chēng):CGMCC
[0030]地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)
[0031]保藏日期:2012年6月18日
[0032]保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.6233【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為菌株CAU709菌落形態(tài)及光學(xué)顯微鏡下產(chǎn)孢形態(tài)圖。其中，A為菌株CAU709菌落形態(tài)圖為菌株CAU709光學(xué)顯微鏡下產(chǎn)孢形態(tài)圖。
[0034]圖2 為太瑞斯梭孢殼(Thielavia terrestris)CAU709CGMCC N0.6233 產(chǎn)角質(zhì)酶的
產(chǎn)酶歷程。
[0035]圖3 為太瑞斯梭孢殼(Thielavia terrestris)CAU709CGMCC N0.6233 產(chǎn)角質(zhì)酶的電泳圖及酶譜。其中，泳道M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker，泳道I為純化產(chǎn)物，泳道標(biāo)記
2、3分別為脂肪酶酶譜和羧酸酯酶酶譜。
[0036]圖4為所純化角質(zhì)酶的最適pH。其中，?表示甘氨酸/鹽酸(pH 2.5-3.5);□表示檸檬酸/檸檬酸鈉(pH 3.0-6.0) ;●表示MES緩沖液(pH 5.5-6.5) ;實(shí)心方塊表示磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉(pH 6.0-8.0);〇表不Tris-HCl (pH 7.5-9.0) ;▲表不甘氨酸/氫氧化鈉(pH8.6-10.6)。
[0037]圖5為所純化角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定性。其中，?表示甘氨酸/鹽酸(pH 2.5-3.5);口表不檸檬酸/檸檬酸鈉(pH 3.0-6.0) ;●表不MES緩沖液(pH 5.5-6.5) ;實(shí)心方塊表不磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉(pH 6.0-8.0);〇表不Tris-HCl (pH 7.5-9.0);▲表不甘氨酸/氫氧化鈉(pH8.6-10.6)。
[0038]圖6為所純化角質(zhì)酶的最適溫度。
[0039]圖7為所純化角質(zhì)酶的溫度穩(wěn)定性。
[0040]圖8為所純化角質(zhì)酶在0_24h內(nèi)降解PET、PBS和PCL的進(jìn)程圖。其中，實(shí)心方塊表示PCL ；▲ PET ; ?表示 PBS。
[0041]圖9為所純化角質(zhì)酶在0_36h內(nèi)降解PBS顆粒的進(jìn)程圖。其中，標(biāo)號(hào)1_8的試管分別為角質(zhì)酶降解IOOmg PBS顆粒0h，6h，12h，18h，24h，30h, 36h，48h后的情況，標(biāo)號(hào)為9的試管為沒(méi)有添加角質(zhì)酶的PBS顆粒保溫48h的情況。
[0042]圖10為所純化角質(zhì)酶降解PBS后，材料表面形狀的變化。其中，A為PBS顆粒降解前放大25倍的掃描電鏡結(jié)果，B為PBS顆粒降解前放大500倍的掃描電鏡結(jié)果，C為PBS顆粒降解前放大1000倍的掃描電鏡結(jié)果，D為PBS顆粒降解前放大5000倍的掃描電鏡結(jié)果，E為PBS顆粒降解后放大25倍的掃描電鏡結(jié)果，F(xiàn)為PBS顆粒降解后放大500倍的掃描電鏡結(jié)果，G為PBS顆粒降解后放大1000倍的掃描電鏡結(jié)果，H為PBS顆粒降解后放大5000倍的掃描電鏡結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0044]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045]下述實(shí)施例所述引物的合成及測(cè)序工作均由上海生工生物工程有限公司(北京公司)完成。
[0046]下述實(shí)施例的主要原料及試劑:對(duì)硝基苯丁酸酯、丁酸-4-甲基傘形酮、乙酸-1-萘酯、快紅染料和羅丹明B均購(gòu)自Sigma公司；胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；瓊脂購(gòu)自北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司；K2HP04和MgSO4.7H20購(gòu)自北京化工廠；PBS由安徽安慶和興化工有限責(zé)任公司饋贈(zèng)；PET購(gòu)自于天津頂津飲品有限公司。
[0047]下述實(shí)施例中所涉及的50mM檸檬酸緩沖液(pH 4.0)的配方如下:分別配制50mM的檸檬酸三鈉溶液和50mM的檸檬酸氫二鈉溶液，然后將這兩種溶液以合適的體積比混合至混合溶液的pH為4.0。
[0048]實(shí)施例1、菌株的分離和鑒定
[0049]一、菌株的分離
[0050]富集培養(yǎng)基:橄欖油20g, (NH4)2SO4 3.0g, K2HPO4 1.0g, MgSO4.7H20 0.5g，瓊脂20g,卡那霉素50mg,青霉素G鈉鹽50mg,定容至1L,調(diào)節(jié)pH至7.0。IX IO5Pa下濕熱滅菌20min。 [0051]分離培養(yǎng)基:200g新鮮土豆沸水煮15min，紗布過(guò)濾取土豆汁，加入15g瓊脂和20g葡萄糖,定容至1L。
[0052]初篩培養(yǎng)基:橄欖油20g，胰蛋白胨 10g，K2HPO4 1.0g，MgSO4.7Η20 0.5g，瓊脂 20g，定容至1L，調(diào)節(jié)pH至7.0。1\10午&下濕熱滅菌2011^11。滅菌后冷卻至60°C，往培養(yǎng)基中加入事先用無(wú)菌過(guò)濾膜(0.22 μ m)除菌的IOmL濃度為1% (w/v)羅丹明B水溶液。
[0053]發(fā)酵培養(yǎng)基:小麥麩皮25g，橄欖油10g，胰蛋白胨10g, KH2PO4 1.5g，MgSO4.H2O0.5g, CaCl2 0.2g，F(xiàn)eSO4.H2O 0.01g，吐溫 80 1.0g，定容至 1L。I X IO5Pa 下濕熱滅菌 20min，pH 6.5。
[0054]取采自中國(guó)北京市區(qū)生活垃圾中的新鮮土樣0.5g至IOmL富集培養(yǎng)基中富集。富集條件為:50°C，200rpm，培養(yǎng)72h。富集三次后將富集培養(yǎng)基中的菌絲體挑至分離培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)分離，在50°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待分離培養(yǎng)基中有菌落長(zhǎng)出，將菌株接種到初篩培養(yǎng)基中。初篩平板中，將在302nm紫外燈照射下菌落周?chē)悬S色熒光圈的菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:50°C，200rpm旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)72h。發(fā)酵結(jié)束后取ImL發(fā)酵液于1.5mL離心管中，離心(10000 X g，IOmin)，取離心后的上清液按照如下方法測(cè)定角質(zhì)酶酶活力，將其中酶活力較高的一株菌編號(hào)為CAU709。
[0055]酶活力測(cè)定方法:角質(zhì)酶活力測(cè)定方法參照Sumby等人(Sumby,K.M.，Matthessj A.H.，Grbinj P.R.，Jiranekj V.，2009.Cloning and characterizationof an intracellular esterase from the wine-associated lactic acid bacteriumOenococcus oen1.Appl.Environ.Microb.75, 6729-6735)的方法:將 50 μ L20mM 對(duì)硝基苯丁酸酯的異丙醇溶液加入到400uL50mM檸檬酸緩沖液(pH 4.0)中，在50°C水浴中預(yù)熱3min,加入50 μ L稀釋至合適倍數(shù)的所述上清液反應(yīng)lOmin。反應(yīng)完畢后加入40C 500 μ L300mM磷酸緩沖液(pH 7.0)并在冰水浴中冷卻2min。最后在410nm處測(cè)量吸光值，再根據(jù)利用對(duì)硝基苯酚(410nm具有最大吸收波長(zhǎng))標(biāo)準(zhǔn)品在410nm下的制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出酶反應(yīng)后生成的對(duì)硝基苯酚的量。酶活力單位(U)定義為在以上條件下，每分鐘反應(yīng)生成I μ mo I對(duì)硝基苯酹所需要的酶量。
[0056]二、菌株的鑒定
[0057]經(jīng)鑒定，證實(shí)本發(fā)明得到的菌株CAU709為太瑞斯梭孢殼(Thielaviaterrestris)。本發(fā)明的菌株太瑞斯梭抱殼(Thielavia terrestris)CAU709,已于2012年6月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCN0.6233。以下詳述其形態(tài)學(xué)鑒定和18S rDNA鑒定。
[0058]1、形態(tài)學(xué)觀察
[0059]將步驟一所得菌株CAU709在PDA平板培養(yǎng)基上培育，觀察菌株生長(zhǎng)情況如下:生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)溫度為45°C。菌落鋪展生長(zhǎng)，白色，最后菌落中央變成粉紅色，菌落背面有紅棕色色素產(chǎn)生(圖1中A)。采用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲透明，從頂端到基部依次形成緊密、規(guī)則的隔膜，有分化的分生孢子梗，分生孢子梗有隔膜，分生孢子相互連接呈鏈狀或聚成球狀，分生孢子無(wú)色至淡黃色，呈鴨梨狀(圖1中B)。
[0060]2、18S rDNA 鑒定
[0061]使用18S rDNA 通用引物 NSl:GTAGTCATATGCTTGTCTC, NS8:TCCGCAGGTTCACCTACGGA,以菌株CAU709的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增18SrDNA序列。目標(biāo)片段經(jīng)凝膠回收后測(cè)序。測(cè)序獲得可靠序列1659bp (序列I)。將測(cè)序獲得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。
[0062]實(shí)施例2、太瑞斯梭孢殼CAU709在制備角質(zhì)酶中的應(yīng)用
[0063]一、角質(zhì)酶的獲得
[0064]1、發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶
[0065]將實(shí)施例1 得到的太瑞斯梭孢殼(Thielavia terrestris)CAU709CGMCC N0.6233進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基做單因素優(yōu)化，試驗(yàn)表明最佳產(chǎn)酶條件為:2.5%小麥麩皮，1%橄欖油，1%胰 蛋白胨，0.15%ΚΗ2Ρ04，0.05%MgS04.Η20，0.02%CaCl2,0.001%FeS04.Η20，0.1%吐溫80(上述各組分的濃度均為質(zhì)量體積百分含量，即％表示g/100ml)，初始pH 6.5。
[0066]將所述太瑞斯梭抱殼(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233接種于上述優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基中。接種方法為:將該菌在PDA培養(yǎng)基上于45°C條件下培養(yǎng)3天，之后在平板培養(yǎng)基中切取一塊邊長(zhǎng)為Icm的長(zhǎng)有菌絲體的培養(yǎng)基，接至含有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在50°C條件下，200rpm旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)(旋轉(zhuǎn)半徑為26mm)，每隔24h取適量發(fā)酵液，離心(10000 X g，IOmin),離心后的上清液按照實(shí)施例1所述方法測(cè)定其酶活力。
[0067]結(jié)果表明，培養(yǎng)到第4天時(shí)，發(fā)酵液中酶的酶活力最高，達(dá)到90U/mL (圖2)。
[0068]2、角質(zhì)酶的鑒定
[0069]按照步驟I所述，將所述太瑞斯梭孢殼(Thielavia terrestris) CAU709CGMCCN0.6233接種于優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，離心(10000 X g，IOmin)收集含有角質(zhì)酶的發(fā)酵上清液。并按照如下方法對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行純化，獲得純度較高的角質(zhì)酶。
[0070]I)硫酸銨沉淀
[0071]向發(fā)酵上清液中緩慢加入80%飽和度的硫酸銨粉末，冰水浴中攪拌lh，然后1000OXg冷凍離心lOmin，收集沉淀，將沉淀用少量20mM pH 8.0Tris-HCl緩沖液溶解，得到硫酸銨沉淀產(chǎn)物。
[0072]2) CM-Separose 柱純化
[0073]將上述得到的硫酸銨沉淀產(chǎn)物用20mM pH 4.5醋酸緩沖液(緩沖液A)透析16h，過(guò)CM-Separose弱陽(yáng)離子交換柱(GE Healthcare, USA),上樣流速為0.5mL/min。之后將未吸附部分蛋白質(zhì)(角質(zhì)酶未吸附到CM-S印arose弱陽(yáng)離子交換柱上)用20mM pH 8.5Tris_HCl緩沖液(緩沖液B)透析16h,過(guò)Q-Separose強(qiáng)陰離子交換柱(GE Healthcare, USA),上樣流速為0.5mL/min。上樣后用緩沖液洗B脫至洗脫液0D28(I〈0.05 (流速為1.0mL/min)，之后用含有0-50mM NaCl的緩沖液B線(xiàn)性洗脫，將有角質(zhì)酶活力的洗脫液(通過(guò)按照實(shí)施例1所述方法測(cè)定洗脫液酶活力，從而確定所檢測(cè)的洗脫液是否具有角質(zhì)酶活力)超濾濃縮后過(guò)G-75凝膠柱，洗脫液為含有IOOmM NaCl的緩沖液B (流速為1.0mL/min)，收集得到純化產(chǎn)物。
[0074]檢測(cè)純化產(chǎn)物的酶活力，酶活力測(cè)定方法同實(shí)施例1，采用Lowry法(Lowry，0.H.，Rosebroughj N.J.，F(xiàn)arr, A.L and Randall, R.J.，1951.Protein measurement withthe folin phenol reagent.J.Biol.Chem.193，265-275)測(cè)定純化過(guò)程中各環(huán)節(jié)所得物中蛋白質(zhì)的總含量。并根據(jù)“比酶活=總酶活/總蛋白”這一公式計(jì)算純化過(guò)程中各環(huán)節(jié)所得產(chǎn)物角質(zhì)酶的比酶活，角質(zhì)酶的回收率。
[0075]結(jié)果如表1所示，從上述可以看出，經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽濃縮、離子交換柱和凝膠柱，得到比酶活為984U/mL的純化產(chǎn)物，純化倍數(shù)和回收率分別為16和10%。
[0076]表1角質(zhì)酶純化過(guò)程中比酶活和回收率的測(cè)定
[0077]
【權(quán)利要求】
1.太瑞斯梭孢殼(Thielaviaterrestris)CAU709,它在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC N0.6233。
2.權(quán)利要求1所述的太瑞斯梭孢殼(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233在制備角質(zhì)酶中的應(yīng)用。
3.一種制備角質(zhì)酶的方法，包括如下步驟:發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的太瑞斯梭孢殼(Thielavia terrestris) CAU709CGMCC N0.6233，收集發(fā)酵產(chǎn)物，獲得角質(zhì)酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為35°C-55°C，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為2-6天，所述發(fā)酵培養(yǎng)的方式為旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150-250轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)半徑為20-30mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有小麥麩皮、橄欖油、胰蛋白胨、KH2PO4, MgSO4.H2O, CaCl2, FeSO4.H2O和吐溫80 ； 所述小麥麩皮在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有2-3g所述小麥麩皮，所述橄欖油在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.5-1.5g所述橄欖油，所述胰蛋白胨在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.5-1.5g所述胰蛋白胨，所述KH2PO4在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.1-0.2g所述KH2PO4，所述MgSO4.Η20在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.01-0.1g所述MgSO4.Η20，所述CaCl2在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0.01-0.05g所述CaCl2，所述FeSO4.Η20在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0-0.005g所述FeSO4.Η20，所述吐溫80在所述培養(yǎng)基中的含量為每IOOmL所述培養(yǎng)基中含有0-0.5g所述吐溫80，所述培養(yǎng)基的pH為6.0-7.0。
7.一種角質(zhì)酶，具有序列表中序列2-序列6所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的角質(zhì)酶，其特征在于:所述角質(zhì)酶是由權(quán)利要求1所述的太瑞斯梭孢殼(Thielavia terrestris) CAU709CGMCC N0.6233 分泌得到的。
9.權(quán)利要求1所述的太瑞斯梭孢殼(Thielaviaterrestris)CAU709CGMCC N0.6233在如下a)或b)中的應(yīng)用: a)降解角質(zhì)； b)降解樹(shù)脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述樹(shù)脂為聚己內(nèi)酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯和聚丁二酸丁二醇酯中的至少一種。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103589645SQ201210286810
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月13日
【發(fā)明者】江正強(qiáng), 徐海博, 楊紹青, 閆巧娟, 劉昱 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)