一種干花豆組培苗的培育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種干花豆組培苗的培育方法，包括以下步驟：1)取干花豆種子經(jīng)消毒處理后接種于無菌芽苗培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到萌發(fā)的干花豆幼苗；2)選取生長健壯的干花豆幼苗，分切成帶腋芽單節(jié)莖段；3)將分切得到的帶腋芽單節(jié)莖段接種于誘導培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，直至長出淡黃色或乳白色幼苗組織；4)將所得幼苗組織切成塊狀，接種于生芽培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到干花豆叢生苗；5)將所得干花豆叢生苗分株，移植于生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到干花豆生根苗。本發(fā)明采用合理的培養(yǎng)基，使培育得到的組培苗生根率高；整個方法簡單易操作，可實現(xiàn)大批量生產(chǎn)，培育得到的干花豆組培苗無菌無毒，經(jīng)煉苗移栽后的成活率高。
【專利說明】一種干花s_組培苗的培育方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物的組織培養(yǎng)技術，具體涉及一種干花豆組培苗的培育方法。
【背景技術】
[0002]干花豆(FordiacaulifloraHemsl)為豆科蝶形花亞科干花豆屬植物，又名野京豆、水羅傘、土甘草、蝦須草、玉郎傘等。干花豆的花期在5~9月，果期在6~11月，其莢果呈棍棒狀，扁平，長7~10cm，寬2~2.5cm,革質，頂端截形，具尖喙，基部漸狹，被平伏柔毛，后漸禿凈，有種子I~2粒；種子呈圓形，扁平，寬約1cm，棕褐色，光滑，種阜膜質，包于珠柄。干花豆性辛、平，味甘、微酸，無毒，具有散淤消腫、止痛寧神、潤肺化痰等功效。在廣西壯、瑤族中用于風濕骨痛、跌打損傷、骨折、小兒癡呆、小兒疳積、肌痿癥、體虛及產(chǎn)婦身體復元等癥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，干花豆具有抗炎、抗氧化、抗衰老、提高記憶力等作用。
[0003]目前，干花豆的采集主要以野生為主，隨著人們的采伐，近些年來干花豆的野外生長面積逐步縮小，在很大程度上限制了干花豆作為藥用植物的利用?，F(xiàn)有干花豆的人工栽培方式主要是采用來自于野生植株馴化所產(chǎn)生的種子進行播種，首先，這種方式存在種子不易萌發(fā)、幼苗易受病蟲害等問題；其次，這種方式難以大批量生產(chǎn)，無法滿足現(xiàn)代規(guī)模化種植的需求。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種干花豆組培苗的培育方法。該方法簡單易操作，可實現(xiàn)大批量生產(chǎn)，培育得到的干花豆組培苗無菌無毒，移栽后成活率高。
[0005]本發(fā)明所述的干花豆組培苗的培育方法，包括以下步驟:
[0006]I)取干花豆種子經(jīng)消毒處理后接種于無菌芽苗培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到萌發(fā)的干花豆幼苗；其中，在培養(yǎng)過程中，每5~7天更換一次無菌芽苗培養(yǎng)基；所述的無菌芽苗培養(yǎng)基配方為:1/2MS+GA3L O~2.0mg/L+蔗糖25~35g/L+NAAl~3mg/L+瓊脂4~8g/L ；
[0007]2)選取生長健壯的干花豆幼苗，分切成帶腋芽單節(jié)莖段；
[0008]3)將分切得到的帶腋芽單節(jié)莖段接種于誘導培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，直至長出淡黃色或乳白色幼苗組織；所述的誘導培養(yǎng)基配方為:MS500~800mg/L+2，4-D2.0~4.0mg/L+椰子汁 200 ~500mg/L+ 活性炭 500 ~1000mg/L+ 瓊脂 500 ~600mg/L, ρΗ5.8 ~6.2 ;
[0009]4)將所得幼苗組織切成塊狀，接種于生芽培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到干花豆叢生苗；所述的生芽培養(yǎng)基配方為:l/2MS+6-BA2~10mg/L ；
[0010]5)將所得干花豆叢生苗分株，移植于生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到干花豆生根苗；所述的生根培養(yǎng)基配方為:1/4MS+IBA4~8mg/L+NAAl~2mg/L ；
[0011]上述各步驟中，所述光照培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度:晝/夜27±2/17±2°C;光照周期:晝/夜16~20h/8~4h ;光照強度1500~20001x。
[0012]上述所述的培育方法中，[0013]步驟I)中，優(yōu)選是選取色澤鮮亮、充實、飽滿的干花豆種子，該所述的干花豆種子可以是野生植株的種子，也可以是經(jīng)野生植株馴化所得植株所產(chǎn)生的種子，優(yōu)選是采用人工授粉發(fā)育成熟的干花豆種子，具體地，可以選取生長健壯的5年生以上的干花豆母株，在開花時進行人工授粉，在10~12月份，選取人工授粉發(fā)育至基本成熟但是還未開裂的干花豆莢果種子。采用人工授粉發(fā)育成熟的干花豆種子可以進一步提高種子授粉率，從而有利于后續(xù)干花豆幼苗的萌發(fā)率。該步驟中，所述的無菌芽苗培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:1/2MS+GA31.5mg/L+蔗糖30g/L+NAA2mg/L+瓊脂5g/L。該步驟中，通常是對干花豆種子進行常規(guī)的消毒處理，具體的消毒處理可按下述方法進行:取干花豆種子流水沖洗20~30min，在超凈工作臺上用70~75% (體積)的乙醇浸泡30s，無菌水清洗3~5次，在0.1~
0.3% (質量)的升汞中浸泡8~IOmin后，取出，用蒸餾水沖洗3次。 申請人:發(fā)現(xiàn)，在該步驟中的光照培養(yǎng)過程中，通過每5~7天更換一次無菌芽苗培養(yǎng)基的操作不僅可以使干花豆幼苗更快、更好地萌發(fā)，而且萌發(fā)得到長勢更為健壯的干花豆幼苗。
[0014]步驟2)中，選取生長健壯的干花豆幼苗，按現(xiàn)有常規(guī)方法將其分切成帶腋芽單節(jié)莖段，具體按以下方法進行:選取生長健壯的干花豆幼苗，切取帶葉片莖段置于燒杯中，用紗布封口后流水沖洗2~3h，用70~75% (體積)的乙醇浸泡20~30s，然后用0.1~
0.3% (質量)的升汞溶液滅菌5~8min，取出，用無菌水沖洗5次，得到外植體；然后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，在無菌條件下用剪刀將外植體的所有葉片剪下(保留少許葉柄)，再用小刀切割干花豆莖段，使每個莖段含兩個對生的腋芽(長約為I~1.5cm)，SP得到帶腋芽單節(jié)莖段。 [0015]步驟3)中，所述的誘導培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:MS600~800mg/L+2，4-D3.0mg/L+椰子汁300~400mg/L+活性炭700~900mg/L+瓊脂500~600mg/L, ρΗ5.8~6.2，更優(yōu)選為 MS600mg/L+2, 4-D3.0mg/L+ 椰子汁 300mg/L+ 活性炭 700mg/L+ 瓊脂 550mg/L，pH6.0。
[0016]步驟4)中，所述的生芽培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:l/2MS+6-BA4~8mg/L，更優(yōu)選為l/2MS+6-BA6mg/L0
[0017]步驟5)中，所述的生根培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:1/4MS+IBA5~6mg/L+NAAl~1.5mg/L，更優(yōu)選為 l/4MS+IBA6mg/L+NAAl.5mg/L。
[0018]上述培育方法中所述光照培養(yǎng)的培養(yǎng)條件優(yōu)選為:溫度:晝/夜27±2/17±2°C ；光照周期--晝/夜18h/6h ;光照強度1500~20001x。光照強度優(yōu)選為1800~20001x。
[0019]在上述限定的光照培養(yǎng)條件下，干花豆種子在無菌芽苗培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)得到萌發(fā)的干花豆幼苗所需的時間約為20~25天；帶腋芽單節(jié)莖段在誘導培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)直至長出淡黃色或乳白色幼苗組織所需的時間約為10~15天；幼苗組織在生芽培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)得到干花豆叢生苗所需的時間約為20~30天；干花豆叢生苗在生根培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)得到干花豆生根苗所需的時間約為8~20天，判定得到干花豆生根苗的基準與現(xiàn)有技術中其它植株進行生根培養(yǎng)時得到生根苗的要求相同，具體可以是當叢生苗長出I~2cm的完整根系時即認定得到干花豆生根苗了。
[0020]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明采用合理的培養(yǎng)基，使培育得到的組培苗生根率高，克服了傳統(tǒng)方法存在的種子不易萌發(fā)、幼苗易受病蟲害等不足；整個方法簡單易操作，可實現(xiàn)大批量生產(chǎn)，培育得到的干花豆組培苗無菌無毒，經(jīng)煉苗移栽后的成活率高?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0021]圖1為實施例1中所得的干花豆叢生苗照片。
【具體實施方式】
[0022]下面以具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
[0023]實施例1
[0024]I)在4月份，選取發(fā)育成熟的、色澤鮮亮、充實、飽滿的干花豆種子流水沖洗20min，在超凈工作臺上用70% (體積)的乙醇浸泡20s，無菌水清洗3次，在濃度為0.3%(質量)的升汞中浸泡8min后，取出，用蒸餾水沖洗3次后接種到無菌芽苗培養(yǎng)基上，每個50ml三角瓶中5~8粒種子，光照培養(yǎng)23d后，得到萌發(fā)的干花豆幼苗；其中，所述無菌芽苗培養(yǎng)基配方為:1/2MS+GA31.5mg/L+蔗糖30g/L+NAA2mg/L+瓊脂5g/L，pH為5.8 ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度15001x，光照時間18h/d，溫度為26~28°C;黑暗處理6h/d，溫度為16~18°C，每6天更換一次培養(yǎng)基；
[0025]2)選取無病、生長健壯的干花豆幼苗，切取帶葉片莖段置于燒杯中，用紗布封口后流水沖洗2h，用70% (體積)的乙醇浸泡20s，然后用0.1% (質量)升汞溶液滅菌5min后，立即用無菌水沖洗5次，得到外植體；用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，在無菌條件下用剪刀將外植體的所有葉片剪下，保留少許葉柄，再用小刀切割干花豆莖段，使每個莖段含兩個對生的腋芽，長1cm，即得到分切好的帶腋芽單節(jié)莖段；
[0026]3)將分切好的帶腋芽單節(jié)莖段迅速接種于誘導培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)10d，得到淡黃色或乳白色幼苗組織； 其中，所述的誘導培養(yǎng)基配方為:MS500mg/L+2，4-D3.0mg/L+椰子汁200mg/L+活性炭500mg/L+瓊脂500mg/L ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度15001x，光照時間18h/d，溫度為26~28°C ;黑暗處理6h/d，溫度為16~18°C ；
[0027]4)將所得的淡黃色或乳白色幼苗組織切成黃豆大小塊狀，接種于生芽培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)28d，得到干花豆叢生苗，如圖1所示；所述的生芽培養(yǎng)基配方為:l/2MS+6-BA2mg/L ；
[0028]5)將所得干花豆叢生苗分株，移植于生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)20d，得到干花豆生根苗；所述的生根培養(yǎng)基配方為:l/4MS+IBA4mg/L+NAAlmg/L ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度20001x，光照時間16h/d，溫度為26~28°C ;黑暗處理8h/d，溫度為16~18°C ；
[0029]6)將所得干花豆生根苗按常規(guī)方法進行煉苗，即得到干花豆組培苗。
[0030]實施例2
[0031]I)選取生長健壯的5年生以上的干花豆母株，在開花時進行人工授粉，在10~12月份，采收人工授粉發(fā)育至基本成熟但是還未開裂的干花豆莢果種子，按常規(guī)方法保存，備用；
[0032]2)在來年的4月份，選取色澤鮮亮、充實、飽滿的干花豆種子流水沖洗20min，在超凈工作臺上用70% (體積)的乙醇浸泡20s，無菌水清洗3次，在濃度為0.1% (質量)的升汞中浸泡IOmin后，取出，用蒸餾水沖洗3次后接種到無菌芽苗培養(yǎng)基上，每個50ml三角瓶中10粒種子，光照培養(yǎng)25d后，得到萌發(fā)的干花豆幼苗；其中，所述無菌芽苗培養(yǎng)基配方為:1/2MS+GA32.0mg/L+ 蔗糖 35g/L+NAAlmg/L+ 瓊脂 8g/L，pH 為 6.2 ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度18001x，光照時間18h/d，溫度為26~28°C;黑暗處理6h/d，溫度為16~18°C，每7天更換一次培養(yǎng)基；
[0033]3)選取無病、生長健壯的干花豆幼苗，切取帶葉片莖段置于燒杯中，用紗布封口后流水沖洗2h，用70% (體積)的乙醇浸泡20s，然后用0.1% (質量)升汞溶液滅菌5min后，立即用無菌水沖洗5次，得到外植體；用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，在無菌條件下用剪刀將外植體的所有葉片剪下，保留少許葉柄，再用小刀切割干花豆莖段，使每個莖段含兩個對生的腋芽，長1.5cm,即得到分切好的帶腋芽單節(jié)莖段；
[0034]4)將分切好的帶腋芽單節(jié)莖段迅速接種于誘導培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)15d，得到淡黃色或乳白色幼苗組織；其中，所述的誘導培養(yǎng)基配方為:MS800mg/L+2，4-D3.0mg/L+椰子汁500mg/L+活性炭1000mg/L+瓊脂600mg/L ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度18001x，光照時間18h/d，溫度為26~28°C ;黑暗處理6h/d，溫度為16~18°C ；
[0035]5)將所得的淡黃色或乳白色幼苗組織切成黃豆大小塊狀，接種于生芽培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)20d，得到干花豆叢生苗；所述的生芽培養(yǎng)基配方為:l/2MS+6-BA10mg/L ；
[0036]6)將所得干花豆叢生苗分株，移植于生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)15d，得到干花豆生根苗；所述的生根培養(yǎng)基配方為:l/4MS+IBA8mg/L+NAA2mg/L ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度20001x，光照時間16h/d，溫度為28°C ;黑暗處理8h/d，溫度為16°C ；
[0037]7)將所得干花豆生根苗按常規(guī)方法進行煉苗，即得到干花豆組培苗。
[0038]實施例3
[0039]I)在4月份，選取發(fā)育成熟的、色澤鮮亮、充實、飽滿的干花豆種子流水沖洗30min，在超凈工作臺上用75% (體積)的乙醇浸泡20s，無菌水清洗3次，在濃度為0.1%(質量)的升汞中浸泡IOmin后，取出，用蒸餾水沖洗3次后接種到無菌芽苗培養(yǎng)基上，每個50ml三角瓶中8粒種子，光照培養(yǎng)20d后，得到萌發(fā)的干花豆幼苗；其中，所述無菌芽苗培養(yǎng)基配方為:1/2MS+GA31.0mg/L+蔗糖25g/L+NAA3mg/L+瓊脂4g/L，pH為6.0 ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度18001x，光照時間20h/d，溫度為25~27°C;黑暗處理4h/d，溫度為17~19°C，每5天更換一次培養(yǎng)基；
[0040]2)選取無病、生長健壯的干花豆幼苗，切取帶葉片莖段置于燒杯中，用紗布封口后流水沖洗2h，用70% (體積)的乙醇浸泡20s，然后用0.1% (質量)升汞溶液滅菌6min后，立即用無菌水沖洗5次，得到外植體；用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，在無菌條件下用剪刀將外植體的所有葉片剪下，保留少許葉柄，再用小刀切割干花豆莖段，使每個莖段含兩個對生的腋芽，長1cm，即得到分切好的帶腋芽單節(jié)莖段；
[0041]3)將分切好的帶腋芽單節(jié)莖段迅速接種于誘導培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)12d，得到淡黃色或乳白色幼苗組織；其中，所述的誘導培養(yǎng)基配方為:MS700mg/L+2，4-D2.0mg/L+椰子汁400mg/L+活性炭800mg/L+瓊脂550mg/L ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度20001x，光照時間18h/d，溫度為27~29°C ;黑暗處理6h/d，溫度為16~18°C ；
[0042]4)將所得的淡黃色或乳白色幼苗組織切成黃豆大小塊狀，接種于生芽培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)20d，得到干花豆叢生苗；所述的生芽培養(yǎng)基配方為:l/2MS+6-BA6mg/L ；
[0043]5)將所得干花豆叢生苗分株，移植于生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)10d，得到干花豆生根苗；所述的生根培養(yǎng)基配方為:l/4MS+IBA6mg/L+NAAl.5mg/L ;光照培養(yǎng)條件為:光照強度18001x，光照時間16h/d，溫度為26°C ;黑暗處理8h/d，溫度為18°C ；
[0044]6)將所得干花豆生根苗按常規(guī)方法進行煉苗，即得到干花豆組培苗。[0045]田間實驗:
[0046]2013年， 申請人:按本發(fā)明實施例1的方法進行培育，將得到的干花豆組培苗直接移栽于實驗田中，之后按常規(guī)管理方式進行管理，移栽成活率> 95% (移植組培干花豆種苗成活株數(shù)/干花 豆組培苗的總移植株數(shù)X 100% )。
【權利要求】
1.一種干花豆組培苗的培育方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)取干花豆種子經(jīng)消毒處理后接種于無菌芽苗培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到萌發(fā)的干花豆幼苗；其中，在培養(yǎng)過程中，每5~7天更換一次無菌芽苗培養(yǎng)基；所述的無菌芽苗培養(yǎng)基配方為:1/2MS+GA31.0 ~2.0mg/L+ 蔗糖 25 ~35g/L+NAAl ~3mg/L+ 瓊脂 4 ~8g/L ； 2)選取生長健壯的干花豆幼苗，分切成帶腋芽單節(jié)莖段； 3)將分切得到的帶腋芽單節(jié)莖段接種于誘導培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，直至長出淡黃色或乳白色幼苗組織；所述的誘導培養(yǎng)基配方為:MS500~800mg/L+2，4-D2.0~4.0mg/L+椰子汁 200 ~500mg/L+ 活性炭 500 ~1000mg/L+ 瓊脂 500 ~600mg/L, ρΗ5.8 ~6.2 ; 4)將所得幼苗組織切成塊狀，接種于生芽培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到干花豆叢生苗；所述的生芽培養(yǎng)基配方為:l/2MS+6-BA2~10mg/L ； 5)將所得干花豆叢生苗分株，移植于生根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，得到干花豆生根苗；所述的生根培養(yǎng)基配方為:1/4MS+IBA4~8mg/L+NAAl~2mg/L ； 上述各步驟中，所述光照培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為--溫度:晝/夜27±2/17±2°C ;光照周期:晝/夜16~20h/8~4h ;光照強度1500~20001x。
2.根據(jù)權利要求1所述的干花豆組培苗的培育方法，其特征在于:步驟I)中，所述的無菌芽苗培養(yǎng)基配方為:1/2MS+GA31.5mg/L+蔗糖30g/L+NAA2mg/L+瓊脂5g/L。
3.根據(jù)權利要求1所述的干花豆組培苗的培育方法，其特征在于:步驟3)中，所述的誘導培養(yǎng)基配方為:MS600~800mg/L+2，4-D3.0mg/L+椰子汁300~400mg/L+活性炭700 ~900mg/L+ 瓊脂 500 ~600mg/L, ρΗ5.8 ~6.2。
4.根據(jù)權利要求1所述的干花豆組培苗的培育方法，其特征在于:步驟4)中，所述的生芽培養(yǎng)基配方為:l/2MS+6-BA4~8mg/L。
5.根據(jù)權利要求1所述的干花豆組培苗的培育方法，其特征在于:步驟5)中，所述的生根培養(yǎng)基配方為:1/4MS+IBA5~6mg/L+NAAl~1.5mg/L。
6.根據(jù)權利要求1所述的干花豆組培苗的培育方法，其特征在于:所述光照培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度:晝/夜27±2/17±2°C ;光照周期:晝/夜18h/6h ;光照強度1500~20001x。
【文檔編號】A01H4/00GK104012413SQ201410275408
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權日:2014年6月19日
【發(fā)明者】劉金磊 申請人:廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所