一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法，具體步驟如下：1)以連翹屬的連翹為母本，以六道木葉屬的翅果連翹為父本，進(jìn)行屬間人工雜交，收取雜交后的種子；2)種植種子獲得雜交后代材料，參照父本和母本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察統(tǒng)計(jì)，并采用AFLP分子標(biāo)記進(jìn)行雜種鑒定，選取連翹屬與六道木葉屬屬間雜種。本發(fā)明利用連翹屬連翹與六道木葉屬翅果連翹進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，實(shí)現(xiàn)了連翹屬與六道木葉屬屬間基因交流，獲得了屬間雜交新種質(zhì)。在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可豐富連翹屬植物的遺傳信息，為利用屬間雜交進(jìn)行連翹新品種培育成為可能，同時(shí)可進(jìn)行近緣屬親緣關(guān)系研究。
【專利說明】-種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，具體涉及一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 連翅屬（Forsythia)植物均為早春觀花落葉灌木，先葉或同葉開放，花黃色，鐘 狀，花柱二型，蒴果（中國植物志，1992)。
[0003] 19世紀(jì)，西方國家從東方引進(jìn)連翹屬植物，進(jìn)行了廣泛的選擇育種，培育出一批 品種，由于抗逆性強(qiáng)和早春花朵繁密，這些品種在溫帶地區(qū)獲得廣泛栽培應(yīng)用（Rosati et al. ,2007)。德國G0ttin.gen植物園發(fā)現(xiàn)自然雜交種金鐘連翅（ForsythiaXintermedia)， 成為現(xiàn)代連翹品種的主要親本，新品種大量出現(xiàn)（Wyman，1961)。連翹常規(guī)雜交和自然突變 選擇育種工程主要集中于美國、加拿大、波蘭和德國等國家。主要目標(biāo)性狀集中在抗寒性 (用卵葉連翹和東北連翹作為育種親本）、株型和花部性狀的改良等方面。
[0004] 作為觀賞植物，連翹屬植物自身也存在一些不足，如：花期集中于4月到5月，群體 花期僅25天左右；花色單一，僅有黃色系品種；花無香味等。傳統(tǒng)的連翹屬內(nèi)雜交育種無 法解決這些問題。六道木葉屬翅果連翅（Abeliophyllum distichum)花白色或粉色，淡香 (Suk-Pyo Hong&Mae-Ja Han，2002)，與連翹花色差異明顯，與連翹親緣關(guān)系相對較近。采用 翅果連翹與連翹進(jìn)行屬間雜交，有望豐富連翹的花色、花期等性狀。同時(shí)對探討連翹與近緣 屬遠(yuǎn)緣雜交親和性、基因交流機(jī)制具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對目前連翹屬植物花色單一、花期集中的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種獲得 連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法，以改良連翹屬植物觀賞特性。
[0006] 本發(fā)明提供的一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法，具體步驟如下：
[0007] 1)選長花柱的連翹屬的連翹為母本，選短花柱的六道木葉屬的翅果連翹為父本， 進(jìn)行屬間人工雜交，收取雜交后的種子；
[0008] 2)種植種子獲得雜交后代材料，參照父本和母本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察統(tǒng)計(jì)，并采用 AFLP分子標(biāo)記進(jìn)行雜種鑒定，選取連翹屬與六道木葉屬屬間雜種。
[0009] 六道木葉屬的翅果連翹為異型花柱，選取短花柱的植株作為本發(fā)明的母本。同樣 連翹屬的連翹也為異型花柱，選取長花柱的植株作為本發(fā)明的父本。
[0010] 其中，步驟1)所述屬間人工雜交，包括如下步驟：
[0011] a采集短花柱的六道木葉屬翅果連翹的鮮花粉；
[0012] b將長花柱的連翹屬連翹去雄；
[0013] c將步驟a采集的花粉授粉到步驟b連翹屬連翹的柱頭上并套袋；
[0014] d種子發(fā)育成熟后采收。
[0015] 其中，步驟c所述授粉的時(shí)間為上午11-12時(shí)，每天1次，重復(fù)3次。
[0016] 其中，步驟c所述套袋，授粉后套硫酸紙袋，花柱萎蔫后換成網(wǎng)袋。
[0017] 其中，步驟d所述采收，為待種子發(fā)育成熟后采摘、陰干。采收到的種子室溫干燥 條件保存。
[0018] 其中，步驟2)所述種植種子，具體步驟如下：
[0019] 種子采用l〇〇mg/L赤霉素浸種處理6h后，點(diǎn)播于裝有泥炭的穴盤內(nèi)，覆膜，置于溫 室，萌發(fā)后獲得雜交后代材料。
[0020] 其中，步驟2)所述進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察統(tǒng)計(jì)，為連續(xù)3年進(jìn)行表型觀察統(tǒng)計(jì)。
[0021] 其中，步驟2)所述進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察統(tǒng)計(jì)，針對莖、葉、枝條、花的表型。
[0022] 其中，步驟2)所述采用AFLP分子標(biāo)記進(jìn)行雜種鑒定，所用的引物對為：
[0023] E38/M47
[0024] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact- 3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0025] 下游引物 Μ47 :5，-gatgagtcctgagtaacaa- 3'（如 SEQ ID No. 4 所不）
[0026] E38/M55
[0027] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0028] 下游引物 Μ55 :5, -gatgagtcctgagtaacga- 3'（如 SEQ ID No. 7 所示）
[0029] E40/M52
[0030] 上游引物 E4〇 :5，-gactgcgtaccaattcagc- 3，（如 SEQ ID No. 2 所不）
[0031] 下游引物 Μ52 :5，-gatgagtcctgagtaaccc- 3，（如 SEQ ID No. 6 所不）
[0032] 和 / 或 E44/M49
[0033] 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不）
[0034] 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag- 3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
[0035] 其中，步驟2)所述選取連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的標(biāo)準(zhǔn)為：形態(tài)學(xué)的表型特 征介于父母本之間，并出現(xiàn)父母本不具有的新性狀，具有父母本的特有AFLP條帶。
[0036] 本發(fā)明還提供所述獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法在育種中的應(yīng)用。
[0037] 本發(fā)明還提供用于連翹屬與六道木葉屬屬間雜種AFLP分子標(biāo)記鑒定的引物對， 其為：
[0038] E38/M47
[0039] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact- 3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0040] 下游引物 Μ47 :5，-gatgagtcctgagtaacaa- 3'（如 SEQ ID No. 4 所不）
[0041] E38/M55
[0042] 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不）
[0043] 下游引物 Μ55 :5' -gatgagtcctgagtaacga- 3'（如 SEQ ID No. 7 所示）
[0044] E40/M52
[0045] 上游引物 E4〇 :5，-gactgcgtaccaattcagc- 3，（如 SEQ ID No. 2 所不）
[0046] 下游引物 Μ52 :5，-gatgagtcctgagtaaccc- 3，（如 SEQ ID No. 6 所不）
[0047] 和 / 或 E44/M49
[0048] 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不）
[0049] 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag- 3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
[0050] 本發(fā)明提供的利用雜交授粉獲得連翹與翅果連翹屬間雜種的方法，有如下優(yōu)點(diǎn)和 有益效果：
[0051] (1)本發(fā)明利用連翹屬連翹與六道木葉屬翅果連翹進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，實(shí)現(xiàn)了連翹屬 與六道木葉屬屬間基因交流，獲得了屬間雜交新種質(zhì)。
[0052] (2)在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可豐富連翹屬植物的遺傳信息，為利用屬間雜交進(jìn)行連翹新 品種培育成為可能，同時(shí)可進(jìn)行近緣屬親緣關(guān)系研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1連翹（左）、雜種（中）與翅果連翹（右）當(dāng)年生枝條的對 比照片。
[0054] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1連翹（左）、雜種（中）與翅果連翹（右）葉片的對比照 片。
[0055] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1連翹（左）、雜種（中）與翅果連翹（右）二年生枝條的對 比照片。
[0056] 圖4為引物E38/M47在親本及子代中的分離檢測（70-110bp)。
[0057] 圖5為引物E38/M55在親本及子代中的分離檢測（80_130bp)。
[0058] 圖6為引物E40/M52在親本及子代中的分離檢測（70-120bp)。
[0059] 圖7為引物E44/M49在親本及子代中的分離檢測（45-80bp)。

【具體實(shí)施方式】
[0060] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0061] 實(shí)施例1
[0062] 1、連翹與六道木葉屬屬間雜交后代材料的獲得
[0063] 1. 1材料選擇
[0064] 選擇連翹屬的連翹和近緣屬六道木葉屬的翅果連翹。
[0065] 1. 2雜交方法及雜種獲得
[0066] 2011年春，在國家花卉工程中心小湯山苗圃，以長花柱連翹為母本進(jìn)行人工去雄 并套袋隔離，采集短花柱翅果連翹的新鮮花粉，于上午11-12時(shí)授粉，每天一次，授粉3次； 雜交后待柱頭萎蔫后，換成網(wǎng)袋。種子自然成熟后采集，陰干，干燥室溫條件下保存。
[0067] 種子用100mg/L赤霉素水溶液浸種處理6h后點(diǎn)播于裝有泥炭的穴盤內(nèi)，覆膜，萌 發(fā)后獲得屬間雜交后代植株。
[0068] 2、連翹與翅果連翹雜種的鑒定
[0069] 表型鑒定：將雜交父母本及雜交后代于7月份露地定植，進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理。翌年 春，對父母本及后代進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定與統(tǒng)計(jì)，連續(xù)進(jìn)行3年。
[0070] 結(jié)果見圖1-3,表明：雜交后代的株型、冠幅、株高、枝條、葉等形態(tài)特征介于雙 親之間，具有父母本綜合性狀。連翹（母本）：連翹生長勢強(qiáng)、當(dāng)年生枝中空，節(jié)間長 5. 4cm±0. 01cm、葉片長卵圓形，粗鋸齒、多三裂葉，葉片大小6. 05cmX4. 04cm ;翅果連翹 (父本）：生長勢弱、當(dāng)年生枝髓實(shí)心，節(jié)間長3. 42cm±0. 02cm、葉片闊卵圓形，全緣，無三裂 葉，葉片大小5. 14cmX3. 56cm ;雜交后代：生長勢居中、當(dāng)年生枝中空、老枝具片狀髓，當(dāng)年 生枝節(jié)間長3. 46cm±0. 01cm、葉片卵圓形，粗鋸齒，多三裂葉，葉片大小5. 36cmX 3. 86cm。
[0071] AFLP分子鑒定：設(shè)計(jì)了 4對多態(tài)性良好的引物對：E38/M47、E38/M55、E40/M52、 E44/M49 (引物序列參見表1，2)，對親本及子代進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并對特異性條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析。
[0072] 表1 AFLP分析所用接頭和引物序列
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 一種獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 選長花柱的連翹屬的連翹為母本，選短花柱的六道木葉屬的翅果連翹為父本，進(jìn)行 屬間人工雜交，收取雜交后的種子； 2) 種植種子獲得雜交后代材料，參照父本和母本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察統(tǒng)計(jì)，并采用AFLP分 子標(biāo)記進(jìn)行雜種鑒定，選取連翹屬與六道木葉屬屬間雜種。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述屬間人工雜交，包括如下步驟： a采集短花柱的六道木葉屬翅果連翹的鮮花粉； b將長花柱的連翹屬連翹去雄； c將步驟a采集的花粉授粉到步驟b連翹屬連翹的柱頭上并套袋； d種子發(fā)育成熟后米收。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c所述授粉的時(shí)間為上午11-12時(shí)，每 天1次，重復(fù)3次。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c所述套袋，授粉后套硫酸紙袋，花柱萎 蔫后換成網(wǎng)袋。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d所述采收，為待種子發(fā)育成熟后采摘、 陰干。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述種植種子，具體步驟如下： 種子采用l〇〇mg/L赤霉素浸種處理6h后，點(diǎn)播于裝有泥炭的穴盤內(nèi)，覆膜，置于溫室， 萌發(fā)后獲得雜交后代材料。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步驟2)所述進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察統(tǒng)計(jì)，針 對莖、葉、枝條、花的表型。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述采用AFLP分子標(biāo)記進(jìn)行雜種鑒 定，所用的引物對為： E38/M47 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物M47:5'-gatgagtcctgagtaacaa-3'（如SEQIDNo·4所示） E38/M55 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 Μ55 :5' -gatgagtcctgagtaacga-3'（如 SEQ ID No. 7 所示） E40/M52 上游引物 E40 :5' -gactgcgtaccaattcagc-3'（如 SEQ ID No. 2 所示） 下游引物 Μ52 :5' -gatgagtcctgagtaaccc-3'（如 SEQ ID No. 6 所示） 和 / 或 E44/M49 上游引物 E44 :5，-gactgcgtaccaattcatc-3，（如 SEQ ID No. 3 所不） 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag-3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
9. 權(quán)利要求1-8所述獲得連翹屬與六道木葉屬屬間雜種的方法在育種中的應(yīng)用。
10. 用于連翹屬與六道木葉屬屬間雜種AFLP分子標(biāo)記鑒定的引物對，其為： E38/M47 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 M47 :5' -gatgagtcctgagtaacaa-3'（如 SEQ ID No. 4 所示） E38/M55 上游引物 E38 :5，-gactgcgtaccaattcact-3，（如 SEQ ID No. 1 所不） 下游引物 M55 :5' -gatgagtcctgagtaacga-3'（如 SEQ ID No. 7 所示） E40/M52 上游引物 E40 :5' -gactgcgtaccaattcagc-3'（如 SEQ ID No. 2 所示） 下游引物 M52 :5' -gatgagtcctgagtaaccc-3'（如 SEQ ID No. 6 所示） 和 / 或 E44/M49 上游引物 E44 :5' -gactgcgtaccaattcatc-3'（如 SEQ ID No. 3 所不） 下游引物 M49 :5' -gatgagtcctgagtaacag-3'（如 SEQ ID No. 5 所示）。
【文檔編號】A01H1/04GK104145807SQ201410366170
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】潘會堂, 申建雙, 張啟翔, 石超, 程堂仁, 王佳, 孫明 申請人:北京林業(yè)大學(xué)