一種疫霉多糖激發(fā)子Gep1及其在提高植物抗病性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種疫霉多糖激發(fā)子Gep1及其在提高植物抗病性中的應(yīng)用，Gep1多糖激發(fā)子分離純化自煙草疫霉，經(jīng)薄層層析分析，確定該多糖的單糖組成為葡萄糖，Gep1具熱穩(wěn)定性，可耐受酸堿，在100℃高溫處理60min后和pH2-12條件下仍具有活性，將其噴灑在植物葉面，可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性，對煙草花葉病毒病有較好防效。每升疫霉發(fā)酵液可分離獲得6g多糖激發(fā)子，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)激發(fā)子。多糖激發(fā)子施用在田間后，在植物體內(nèi)、土壤和水體中易分解，無殘留，對環(huán)境無污染，對人畜等非靶標(biāo)生物相對安全，不易產(chǎn)生抗藥性。因此，該產(chǎn)品將具有十分廣闊的應(yīng)用與市場前景。
【專利說明】一種疫霉多糖激發(fā)子Gepl及其在提高植物抗病性中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物學(xué)技術(shù)及生物化學(xué)與分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種疫霉多糖激發(fā)子Gepl，還涉及其在提高植物抗病性中應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]糖類激發(fā)子是指具有激活植物自身免疫、提高植物抗病抗逆能力的糖類物質(zhì)，屬于生物源激發(fā)子(Yin H et al.2010)。糖類一直被認(rèn)為是一類惰性化合物，只作為生物體內(nèi)的代謝能量來源或充當(dāng)結(jié)構(gòu)保護(hù)材料(如植物細(xì)胞壁)。Ayers等在1976年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁的寡糖碎片可以誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生植保素(phytoalexin),從此人們對糖類功能開始了新的認(rèn)識。目前，人們已普遍認(rèn)為寡糖是能夠誘導(dǎo)高等植物防御反應(yīng)的激發(fā)子中的一類。它們實現(xiàn)功能的基本原理是通過激發(fā)植物產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PR蛋白)和植保素等，增強植物的抗病性。
[0003]目前已鑒定的真菌激發(fā)子大多數(shù)是低聚糖或糖蛋白，少數(shù)為蛋白質(zhì)或多肽。β -1, 3-β -1, 6-葡寡糖是最具代表性的真菌激發(fā)子，它是從大豆致病菌大雄疫霉菌(Phytophthora megasperma)的細(xì)胞壁水解產(chǎn)物中得到的。當(dāng)濃度為lCT3-lCT4mol/L時，即可誘導(dǎo)大豆葉片產(chǎn)生植保素(Sharp et al.1984)。Smith(1991)從爺病鐮刀菌(Fusariumsolani)中分離得到一種可誘導(dǎo)紫花苜蓿產(chǎn)生豌豆素的脫乙酰殼多糖。許多研究證明，殼多糖能夠有效誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生抗病性，對病害的防治有明顯效果，如可誘導(dǎo)番茄對根腐菌和早疫霉抗性，還可誘導(dǎo)大豆幼苗抗大豆鐮刀菌根腐病(F.0xysporum) (Smith etal.1991)。
[0004]葡聚(寡)糖與其他糖類激發(fā)子的不同之處是其通常包括主鏈與側(cè)鏈，具有β-1，3和β _1，6兩種連接方式。β-D-葡聚糖(β-D-glucan)廣泛存在于真菌、褐藻、地衣及谷物等生物體中，具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，抗細(xì)菌、抗病毒、抗腫瘤和促愈合等生物活性。其降解產(chǎn)物β-葡寡糖能誘導(dǎo)大豆、甜椒、紫花苜蓿、水稻、擬南芥、煙草、小麥和葡萄等多種植物產(chǎn)生抗性，其作用機制可簡單概括如下:首先被植物細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上的受體識別后轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，進(jìn)而引起胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)流、質(zhì)膜去極化、胞外堿化等一系列早期信號反應(yīng)，再經(jīng)過一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧(reactive oxgen species,R0S)等二級信號分子的進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大，包括水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、乙烯(ethylene，ET)等植物激素的積累和釋放來調(diào)控防衛(wèi)基因的表達(dá)，從而積累PR蛋白和次級代謝產(chǎn)物，來誘導(dǎo)植物自身免疫抗性，抵抗病原物質(zhì)的侵染(武維華2003)。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)β -葡寡糖激發(fā)子的結(jié)構(gòu)不同對植物的誘導(dǎo)作用不同。大豆和蝶形花科植物可以識別具分支結(jié)構(gòu)的β-1，3-β-1，6葡七糖(以β-1，6-為主鏈，帶有β_1，3側(cè)鏈)，卻不能識別線性的β -1, 6-葡寡糖。煙草和番茄能夠識別線性β -1, 3-葡寡糖，而歐芹卻不能識別。線性的β_1，6-葡寡糖無法誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗病性，而含一個1，6分支的線性β-1，3-葡五糖卻能誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生植保素(Yamaguchi et al.2000)。
[0006]糖化學(xué)家采用不同結(jié)構(gòu)的葡寡糖，通過測定激發(fā)子的活性及其與細(xì)胞膜的結(jié)合能力來研究葡寡糖的不同結(jié)構(gòu)對誘導(dǎo)植物抗性能力差異的影響。結(jié)果表明，移除葡寡糖非還原端的葡萄糖殘基或改變支鏈結(jié)構(gòu)會顯著降低植物的抗病活性；而增加葡寡糖還原端的葡萄糖殘基、或?qū)ζ溥M(jìn)行烷基及其他基團(tuán)修飾，其活性基本不變。例如，去掉非還原端的3個葡萄糖殘基或支鏈葡萄糖殘基的葡七糖不能或幾乎不能誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生和積累植保素(Yi et al.2003) ?此外，葡寡糖經(jīng)硫酸化后可提高誘導(dǎo)植物抗病的效果(Menard etal.2004)。研究人員還發(fā)現(xiàn)，若要誘導(dǎo)酸性和堿性PR蛋白的表達(dá)，則硫酸化修飾的程度要大于0.4(DS>0.4)，且DS>1.5時，誘導(dǎo)效果更加明顯。例如對于煙草，DS = 2.4的海帶淀粉(β -1, 3葡寡糖)(Iaminaran)可以誘導(dǎo)PR蛋白的表達(dá)，抵抗煙草花葉病毒的侵染。
[0007]煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)是最重要的植物病毒之一,可侵染36科350多種植物，其中最主要的是茄科植物，以煙草和番茄尤重(商鴻生和李振岐2005)。感染TMV的植株的典型癥狀是花葉，發(fā)病初期新葉上發(fā)生“脈明”現(xiàn)象，并逐漸從葉片的基部向頂端發(fā)展，最后擴(kuò)展至整個葉片。受病毒的干擾，葉片厚薄不均，形成皰斑、皺縮，甚至扭曲。嚴(yán)重時葉片呈柳葉狀。早期發(fā)病植株生長緩慢，不能開花結(jié)果，即使結(jié)果其種子也不能發(fā)芽或發(fā)芽率極低(Reinero and Beaehy 1986)。
[0008]寡聚糖不僅能夠調(diào)控植物生長，還能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性相關(guān)的活性物質(zhì)，抑制病害的形成。目前，尚未見從疫霉真菌中分離葡聚糖激發(fā)子的報道。我們從煙草疫霉(Phytophthora parasitica)的培養(yǎng)濾液中分離純化出一種葡聚糖類激發(fā)子,發(fā)現(xiàn)該激發(fā)子能誘導(dǎo)煙草對TMV的系統(tǒng)抗性，其對TMV的防治效果優(yōu)于市售超敏蛋白。研究結(jié)果豐富了葡聚(寡)糖與病原菌互作的理論，同時也為日后開發(fā)應(yīng)用新的生防農(nóng)藥提供了一定的理論支撐。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供了一種疫霉多糖激發(fā)子，該多糖激發(fā)子分離純化自煙草疫霉，經(jīng)薄層層析分析，確定該多糖的單糖組成為葡萄糖， 申請人:將其命名為Gepl。
[0010]本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種疫霉多糖激發(fā)子Gepl在提高植物抗病性中的應(yīng)用。將其噴灑在植物葉面，它可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性，對煙草花葉病毒病有較好防效。
[0011]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0012]一種疫霉多糖激發(fā)子Gepl，通過以下步驟制備得到:
[0013]1.將煙草疫霉(P.parasitica)的發(fā)酵液先用4層紗布過濾，再離心后收集上清液。氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K除去蛋白。再加入4X體積的無水乙醇放置于_20°C沉淀過夜，離心棄上清，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得到的粉末即為粗多糖。
[0014]2.活性物質(zhì)的分離純化及有效成分鑒定:將上述獲得的粗多糖溶于少量的蒸餾水中，依次通過DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-100柱層析進(jìn)一步分離純化,硫酸-苯酚法檢測糖含量繪制洗脫曲線。利用洗脫曲線各峰值的組分進(jìn)行活性檢測。在活性分析后，對有活性的物質(zhì)進(jìn)行真空冷凍干燥進(jìn)行濃縮，即得疫霉多糖激發(fā)子Gepl。
[0015]市售的煙草疫霉或是已公開的煙草疫霉均能完成本發(fā)明。
[0016]以上所述的制備步驟，具體如下:
[0017]1.將發(fā)酵液先用4層紗布過濾，濾液于3000r/min離心1min后，收集上清液。用冷凍干燥法將得到的上清液濃縮成約原體積的1/10 ;向濃縮液中加入1/5體積的氯仿振蕩20min,8000r/min離心1min,除去氯仿和部分蛋白，重復(fù)3次；繼續(xù)向濃縮液中加入終濃度均為20 μ g/mL胰蛋白酶和蛋白酶K于37°C溫育30min后，沸水煮沸5min，4°C、8000r/min離心取上清；向除去蛋白的濃縮液中加入4X體積的無水乙醇放置于_20°C沉淀過夜，4°C、8000r/min離心5min,棄上清,沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得到的粉末即為粗多糖；
[0018]2.粗多糖溶于蒸餾水后，加入無水乙醇，終濃度為60%，置于-20°C冰箱過夜，4°C、8000r/min離心20min取上清，向上清液中加入無水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到80%后，置于-20°C冰箱過夜，4°C、8000r/min離心20min取沉淀，待乙醇完全揮發(fā)后加入蒸餾水重溶，得到80%乙醇沉淀多糖；取80%乙醇沉淀多糖于3000r/min離心10min，取上清液，備上樣；待DEAE-52纖維素柱子下端流出液pH值為7.0開始上樣，共上樣4mL，依次用蒸餾水、0.lmol/L NaCl、0.5mol/L NaCl>lmol/L NaCl 溶液洗脫，自動收集，流速 lmL/min,每管6mL ;苯酚-硫酸法跟蹤檢測，以試管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到粗多糖的洗脫曲線，合并含糖單一峰位，蒸餾水透析2d，檢測其生物活性后，冷凍干燥；
[0019]取適量S^hadex G-100粉末，加入足夠的蒸餾水室溫下溶脹過夜，脫氣后濕法裝柱，0.01mol/L NaCl平衡過夜；將DEAE-52纖維素柱層析分級所得的活性組分溶于最小體積的0.01 mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱，以0.01mol/L NaCl溶液為洗脫液，流速為lmL/6min,每管3mL,用自動部分收集器收集,苯酹-硫酸法檢測多糖分布，以試管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制洗脫曲線，分別收集各主峰，蒸餾水透析2d，檢測其生物活性后，冷凍干燥，即得多糖激發(fā)子Gepl。
[0020]煙草疫霉的發(fā)酵方法如下:
[0021]將活化的煙草疫霉(P.parasitica)菌絲塊接種于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液中(馬鈴薯600g，20g葡萄糖，用水定容到100mL,卡那霉素終濃度為50 μ g/mL)，26°C、200r/min黑暗培養(yǎng)24d，得到發(fā)酵液。
[0022]一種疫霉多糖激發(fā)子Gepl在提高植物抗病性中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是:
[0023]將G印I溶液(2.0-5.0mg/mL)噴灑在植物葉面，可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性，對煙草花葉病毒病有較好防效。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0025]1.本發(fā)明制備的疫霉多糖激發(fā)子G印I誘導(dǎo)煙草抗病相關(guān)基因的表達(dá)及防衛(wèi)物質(zhì)的產(chǎn)生和積累，從而抑制病株體內(nèi)TMV的增殖，使顯癥推遲，癥狀減輕，葉綠素含量顯著高于未誘導(dǎo)病株。研究結(jié)果豐富了葡聚(寡)糖與病原菌互作的理論，同時也為日后開發(fā)應(yīng)用新的生防農(nóng)藥提供了一定的理論支撐。
[0026]2.Gepl對TMV有較好的防治效果。室內(nèi)盆栽實驗，每隔七天進(jìn)行采樣，4次的統(tǒng)計調(diào)查結(jié)果為:4mg/mL G印I處理組的防效依次為100.00%,93.00%,87.78%,67.39%0市售超敏蛋白處理組的防效依次為88.91%,84.46%, 77.63%, 50.86%。表明4mg/mL的G印I對TMV的防治效果優(yōu)于超敏蛋白，能有效地抑制TMV在煙草體內(nèi)的增殖，降低發(fā)病率，推遲發(fā)病時間。
[0027]3.G印I具熱穩(wěn)定性，可耐受酸堿，在100°C高溫處理60min后和pH 2_12條件下仍具有活性。這為多糖激發(fā)子的田間應(yīng)用奠定了很好的基礎(chǔ)，可保證其效果的穩(wěn)定性，且便于長期貯存。每升疫霉發(fā)酵液可分離獲得6g多糖激發(fā)子，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)激發(fā)子。此外，由多糖激發(fā)子開發(fā)的生防農(nóng)藥的發(fā)酵原料來源豐富、生產(chǎn)成本低、無毒安全、無公害。多糖激發(fā)子施用在田間后，在植物體內(nèi)、土壤和水體中易分解，無殘留，對環(huán)境無污染，對人畜等非靶標(biāo)生物相對安全，不易產(chǎn)生抗藥性。因此，該產(chǎn)品將具有十分廣闊的應(yīng)用與市場前景，無論是生產(chǎn)企業(yè)，還是農(nóng)作物種植者都將因此獲得巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為80%乙醇沉淀多糖DEAE-52纖維素柱層析洗脫曲線。
[0029]圖2為峰II的S印hadex G-100柱層析洗脫曲線示意圖。
[0030]圖3為Gepl引起過敏反應(yīng)產(chǎn)生壞死斑示意圖。
[0031]圖4為Gepl酸水解產(chǎn)物的薄層層析示意圖。
[0032]圖5為不同處理后的Gepl誘導(dǎo)的煙草過敏反應(yīng)示意圖。
[0033]圖6為Gepl誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生HR的最低濃度。
[0034]圖7為G印I處理煙草細(xì)胞不同時間的NO含量變化示意圖。
[0035]*表示顯著差異，Ρ〈0.05。
[0036]圖8為DAB染色檢測煙草體內(nèi)H2O2的積累(200X)示意圖。
[0037]圖9為Gepl誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞外質(zhì)堿化示意圖。
[0038]*表示顯著差異，Ρ<0.05 ;**表示極顯著差異，Ρ<0.01。
[0039]圖10為苯胺藍(lán)染色檢測G印I誘導(dǎo)的煙草葉片胼胝質(zhì)的積累示意圖。
[0040]圖11為熒光檢測Gepl誘導(dǎo)煙草葉片酚類物質(zhì)的積累(200Χ)示意圖。
[0041]圖12為Gepl誘導(dǎo)煙草葉片防御相關(guān)酶的活性提高示意圖。
[0042]圖13為G印I對TMV的體外鈍化作用示意圖。
[0043]圖14為熒光定量PCR檢測Gepl誘導(dǎo)煙草對TMV的抑制作用示意圖。
[0044]*表示顯著差異，Ρ〈0.05 ;**表示極顯著差異，Ρ〈0.01。
[0045]圖15為Gepl對感染TMV煙草葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響示意圖。
[0046]圖16為Gepl誘導(dǎo)煙草過敏性反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平增加示意圖。
[0047]圖17為Gepl誘導(dǎo)煙草葉片多個抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平增加示意圖。
[0048]圖18為多糖激發(fā)子Gepl對TMV防治的病情指數(shù)統(tǒng)計示意圖。
[0049]圖19為多糖激發(fā)子Gepl對TMV的防治效果統(tǒng)計示意圖。
[0050]圖20為G印I的注射和采樣部位示意圖。

【具體實施方式】
[0051]本發(fā)明實施例所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為常規(guī)技術(shù)，所用試劑如未特別說明，均來源于商業(yè)化渠道。
[0052]實施例1:
[0053]一種疫霉多糖激發(fā)子Gepl，通過以下步驟制備得到:
[0054]1.煙草疫霉(P.parasitica)發(fā)酵液的培養(yǎng)和粗多糖的提取:
[0055]將活化的煙草疫霉(P.parasitica)(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心,菌株保藏號ACCC36285)菌絲塊接種于(挑取菌落邊緣處的直徑為Icm的菌絲塊)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液250mL中(馬鈴薯600g，20g葡萄糖，用水定容到lOOOmL，卡那霉素終濃度為50 μ g/mL)，26°C、200r/min黑暗培養(yǎng)24d，，得到發(fā)酵液(菌體濃度為lxl07CFU/mL)。
[0056]將發(fā)酵液先用4層紗布過濾，濾液于3000r/min離心1min后，收集上清液。用冷凍干燥法將得到的上清液濃縮成約原體積的1/10。向濃縮液中加入1/5體積的氯仿振蕩20min,8000r/min離心1min,除去氯仿和部分蛋白，重復(fù)3次。繼續(xù)向濃縮液中加入胰蛋白酶和蛋白酶K (終濃度均為20 μ g/mL)于37°C溫育30min后，沸水煮沸5min，4°C、8000r/min離心取上清。向除去蛋白的濃縮液中加入4X體積的無水乙醇放置于_20°C沉淀過夜，4°C、8000r/min離心5min,棄上清,沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得到的粉末即為粗多糖。
[0057]2.多糖激發(fā)子G印I的分離純化:
[0058]DEAE-52纖維素預(yù)處理。取50g DEAE-52加入500ml蒸餾水浸泡24h，去除懸浮細(xì)顆粒；加入0.5mol/L NaOH溶液浸泡2h，抽濾，蒸餾水洗至中性；再加入0.5mol/L HCl浸泡2h,抽濾,蒸懼水洗至中性；最后用0.5mol/L NaOH浸泡0.5h,抽濾,蒸懼水洗至中性,此時DEAE-纖維素已轉(zhuǎn)化成OH-型,脫氣后濕法裝柱(2.0 X 50cm),蒸懼水平衡。
[0059]粗多糖溶于蒸餾水后，加入無水乙醇，終濃度為60%，置于_20°C冰箱過夜，4°C、8000r/min離心20min取上清，向上清液中加入無水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到80 %后，置于_20°C冰箱過夜，4°C,8000r/min離心20min取沉淀，待乙醇完全揮發(fā)后加入蒸餾水重溶，得到80%乙醇沉淀多糖(多糖濃度為10mg/mL)。取80%乙醇沉淀多糖于3000r/min離心lOmin，取上清液，備上樣。待柱子下端流出液pH值為7.0開始上樣，共上樣4mL，依次用蒸懼水、0.lmol/L NaCl、0.5mol/L NaCl、lmol/L NaCl 溶液洗脫，自動收集(流速 lmL/min,每管6mL)。苯酚-硫酸法跟蹤檢測，以試管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到粗多糖的洗脫曲線，合并含糖單一峰位，蒸餾水透析2d，檢測其生物活性后，冷凍干燥。
[0060]多糖激發(fā)子生物活性檢測:以具有5-7片真葉的煙草為材料，用ImL不帶針頭的注射器，取20 μ I (lmg/mL)多糖溶液從葉子背面注入葉片，以注射相同體積的蒸餾水作對照，每個處理重復(fù)3次。2d后觀察是否有過敏反應(yīng)的壞死斑形成，若出現(xiàn)了壞死斑，則說明該多糖溶液具備活性(以下同)。
[0061]結(jié)果如圖1所示，圖中:峰1、I1、II1、IV依次為蒸餾水、0.lmol/L NaCl、0.5mol/LNaCl和lmol/L NaCl溶液的洗脫峰?；钚詸z測結(jié)果表明，峰II具有生物活性，收集該峰活性物質(zhì)，進(jìn)一步采用Sephadex G-100柱層析分離純化。
[0062]取適量Sephadex G-100粉末,加入足夠的蒸懼水室溫下溶脹過夜(lg SephadexG-100加1ml蒸餾水)，脫氣后濕法裝柱(2.0X50cm)，0.01mOl/L NaCl平衡過夜。將DEAE-52纖維素柱層析分級所得的峰II組分溶于最小體積的0.01mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱(2.0 X 50cm)，以0.01mol/L NaCl溶液為洗脫液，流速為lmL/6min,每管3mL,用自動部分收集器收集,苯酹-硫酸法檢測多糖分布，以試管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制洗脫曲線，分別收集各主峰，蒸餾水透析2d，檢測其生物活性后，冷凍干燥，得到均一多糖。此時的均一多糖即為本發(fā)明所述的疫霉多糖激發(fā)子Gepl。該多糖激發(fā)子Gepl能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生HR，形成明顯的壞死斑(圖3)。
[0063]以上所述的過夜時長為12_24h。
[0064]每升疫霉發(fā)酵液可分離獲得6g多糖激發(fā)子。
[0065]實施例2:
[0066]多糖激發(fā)子Gepl的單糖組成分析:
[0067]稱取多糖樣品1mg放入安醅瓶，加入2mL 2M的三氟乙酸溶液，酒精噴燈封口，120°C水解3.5h。冷卻后濾膜過濾除去不溶物，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸，再加少量甲醇洗滌，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，重復(fù)3次，除去殘留的三氟乙酸，加0.5mL蒸餾水溶解。用20X20cm的硅膠板分離，展開劑為乙酸乙酯-吡啶-無水乙醇-水(體積比=8:1:1:2)，顯色劑為苯胺-二苯胺-磷酸(2%二苯胺丙酮溶液、2%苯胺丙酮溶液、85%磷酸按5:5:1的比例混合)。以溶于水的各單糖(葡萄糖、果糖、核糖、甘露糖、半乳糖、木糖、L-阿拉伯糖)標(biāo)準(zhǔn)液(10mg/mL)為參照。
[0068]結(jié)果如圖4所示，其中I為Gepl的酸水解產(chǎn)物；2、3、4、5、6和7分別為葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖、L-阿拉伯糖和木糖。Gepl的酸水解產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離后發(fā)現(xiàn)只有一個深藍(lán)色的斑點，通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖的Rf值比對后，確定其組成成分中只含有葡萄糖，無其他單糖成分。因此，確定Gepl為由葡萄糖組成的多糖。
[0069]實施例3:
[0070]檢測多糖激發(fā)子G印I的理化性質(zhì):
[0071]多糖激發(fā)子Gepl的熱穩(wěn)定性檢測:取多糖激發(fā)子Gepl (lmg/mL) 100 μ L,分別于40，60，70，80，90和100°C水浴中溫育5min，然后將它們迅速置于冰上，冷卻后4°C、12000r/min離心5min，取上清。待溶液回復(fù)至室溫后，按實施例2所述生物活性鑒定方法檢測其生物活性。以蒸餾水作對照，每個處理重復(fù)3次。此外，取多糖激發(fā)子(lmg/mL) 100 μ L，分別沸水浴20，30，40，50和60min，以及121°C高壓濕熱滅菌20min，用同上方法檢測其生物活性。
[0072]結(jié)果如圖5中 A所示，圖中al_a6是分別經(jīng)沸水浴20，30，40，50，60min，以及121°C高壓濕熱滅菌20min后的G印I，a8-al3是分別經(jīng)40，60，70，80，90和100°C處理后的G印1，a7是蒸餾水對照。G印I具有熱穩(wěn)定性,沸水浴處理60min后仍具有生物活性。
[0073]分析多糖激發(fā)子Gepl的耐酸堿性:取300 μ L多糖激發(fā)子(lmg/mL)分別加入pH2,5,8,10,12的PBS中，室溫靜置lh，再用pH 7.5的Tris-HCl調(diào)pH至7.5后，按實施例2所述生物活性鑒定方法檢測其活性。PH 7.5的PBS作對照，每個處理重復(fù)3次。
[0074]結(jié)果如圖5中B所示，圖中b2_b6是Gepl在pH 2，5，8，10，12的溶液里分別處理60min，bl是蒸餾水對照。不同pH下孵育的G印I經(jīng)生物活性檢測，結(jié)果顯示即使當(dāng)pH = 2和pH = 12時,激發(fā)子Gepl仍具有活性。表明Gepl能耐受酸堿。
[0075]檢測多糖激發(fā)子Gepl引起煙葉產(chǎn)生過敏反應(yīng)的最低濃度:分別取0.001mg/mL,0.01mg/mL,0.lmg/mL,0.5mg/mL, lmg/mL, 1.5mg/mL的多糖激發(fā)子水溶液，按照實施例2所述生物活性鑒定方法檢測能夠引起煙草葉片產(chǎn)生過敏反應(yīng)的最低濃度。以蒸餾水為對照，每個處理重復(fù)3次。
[0076]結(jié)果如圖6 所不，圖中 C2-C7 分別是 0.001mg/mL, 0.01mg/mL, 0.lmg/mL, 0.5mg/mL,lmg/mL和1.5mg/mL的Gepl。Cl是蒸懼水對照。激發(fā)子Gepl可引起煙草過敏反應(yīng)(HR)的最低濃度是0.5mg/mL。低于這一濃度則不能引起煙草產(chǎn)生HR ;高于這一濃度則顯示出隨濃度增加，HR越加強烈的現(xiàn)象。1.5mg/mL Gepl能夠引起煙草產(chǎn)生典型的HR。
[0077]實施例4:
[0078]Gepl誘導(dǎo)的煙草系統(tǒng)抗性反應(yīng):
[0079](I)G印I誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生
[0080]取50mL煙草懸浮細(xì)胞，加入終濃度為0.4mg/mL的G印I處理。每隔1min取樣I次，每次取500 μ L。將取出的樣品迅速放入液氮凍存，待用。樣品沸水浴融化后，加入預(yù)熱到 95。。的 1.5 X CTAB 50μ L，65°C溫育 30min，每 5min 上下顛倒 I 次。于 12000r/min 離心lOmin，取上清。用NO檢測試劑盒測定NO含量，蒸餾水作對照。用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋標(biāo)品NaNO2后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0081]結(jié)果顯示:G印I誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞后，NO的生成量開始逐漸增加，且明顯高于對照細(xì)胞，在激發(fā)子處理SOmin后，NO的生成量達(dá)到最大值，隨后開始降低。對照細(xì)胞NO的量隨時間緩慢升高一段時間趨于平穩(wěn)后開始下降。(圖7)
[0082]⑵G印I激活過氧化氫的沉積
[0083]用0.4mg/mL的G印I注射煙草葉片，處理24h后，將葉片置于玻璃平皿中，加入適量DAB染液，室溫避光保存6h。取出葉片，放入盛有95%乙醇的燒杯中，至葉片綠色完全脫去，除去燒杯中液體。用50%甘油將葉片浸泡，用鑷子小心趕出細(xì)胞間氣泡，顯微鏡觀察。蒸餾水作對照,每個處理重復(fù)3次。
[0084]結(jié)果如圖8所示，其中圖A是對照葉片，B是G印I處理葉片。DAB可以與煙草葉片中產(chǎn)生的H2O2反應(yīng)，形成紅褐色斑點。通過觀察紅褐色斑點的產(chǎn)生,可對H2O2的產(chǎn)生位點和產(chǎn)生量進(jìn)行觀測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gepl激發(fā)子處理后的煙草葉片產(chǎn)生的H2O2主要在葉脈組織和處理部位累積。
[0085](3)G印I誘導(dǎo)細(xì)胞外質(zhì)的堿化
[0086]取新轉(zhuǎn)接的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)3d(25°C，150r/min)后，加入終濃度為0.4mg/mL的Gepl繼續(xù)在搖床上培養(yǎng)，并每隔1min用pH測定儀測定細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值。以蒸餾水作對照，每個處理重復(fù)3次。
[0087]結(jié)果如圖9所示，Gepl誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞后，使細(xì)胞外質(zhì)的pH發(fā)生了明顯變化。隨著處理時間的增加，Gepl誘導(dǎo)胞外pH值不斷升高，明顯高于對照組；而對照細(xì)胞在整個檢測過程中PH雖有所上升，但上升幅度較小。
[0088](4)G印I誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的產(chǎn)生
[0089]用20yL 0.4mg/mL的G印I注射煙草葉片，24h后，將葉片放入緩沖液(1%戊二醒，5mmol/L檸檬酸，90mmol/L磷酸氫二鈉，pH 7.4)中過夜。小心取出預(yù)處理的葉片，放入無水乙醇中沸水浴脫去葉綠素。用50%的乙醇清洗葉片2-3次后，轉(zhuǎn)入漂洗緩沖液(67mmol/L磷酸氫二鉀，pH 12)中，用染色緩沖液(0.1 %苯胺藍(lán)，67mmol/L磷酸氫二鉀，pH12)染色lh。取出染色的葉片用漂洗緩沖液沖洗1-2次，放入50%甘油中，用熒光顯微鏡進(jìn)行固定觀察。
[0090]結(jié)果圖10所示，圖10中A和a是對照；B和b為G印I處理葉片。A，B在可見光下觀察(10X)，a和b在紫外熒光顯微鏡下觀察(10X)。胼胝質(zhì)有利于加強細(xì)胞壁成分，是植物物理防御的物質(zhì)之一。Gepl處理煙草葉片24h后，用苯胺藍(lán)染色，在紫外熒光顯微鏡下可觀測到綠色熒光物質(zhì)(如箭頭所示)，而蒸餾水處理的葉片則沒有出現(xiàn)這種熒光物質(zhì)的積累。
[0091](5)G印I誘導(dǎo)酚類的產(chǎn)生和積累
[0092]取300 μ L煙草懸浮細(xì)胞，加入G印I，使其終濃度為0.4mg/mL,于25°C，150r/min處理108h后，3000r/min離心10min，棄上清，加入適量PBS重懸細(xì)胞。取適量細(xì)胞放在載玻片上用蓋玻片封住后，在紫外熒光顯微鏡(激發(fā)波長為395nm)下觀察酚類物質(zhì)的積累。
[0093]結(jié)果如圖11所示，圖11中A和a是對照，B和b為G印I處理葉片。A，B在可見光下觀察，a和b在紫外熒光顯微鏡下觀察。酚類化合物具有抗氧化活性，是植物的次級代謝產(chǎn)物之一，它的積累有利于提高植物的抗病、抗逆性。G印I處理煙草懸浮細(xì)胞108h后，用熒光顯微鏡可以明顯地觀察到酚類物質(zhì)的產(chǎn)生和積累。
[0094](6)過氧化物酶(POD)活性測定
[0095]選取長勢相當(dāng)?shù)?葉期煙草，用4mg/mL的多糖激發(fā)子均勻噴霧整個植株的葉片正反面，連續(xù)噴霧3d，以蒸餾水處理為對照。處理前采樣I次，噴霧后第4d開始每天采樣I次，共8次。
[0096]準(zhǔn)確稱取煙草葉片0.25g放入預(yù)冷的研缽中，加入3mL 0.05M預(yù)冷的PBS緩沖液(pH7.0)和0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及少量石英砂，冰浴研磨成勻漿。4°C，12000r/min離心20min，取上清液即粗酶液，置-20°C冰箱中備用。
[0097]在比色管中，依次加入(λ 05M PBS (pH 7.0) lmL、l%愈創(chuàng)木酚ImL和粗酶液lmL，搖勻后于30°C恒溫水浴5min。向管中加入0.3% H2O2ImL,搖勻后迅速將反應(yīng)液倒入Icm光徑比色杯中，于470nm下測定OD值增加速度。用加ImL蒸餾水的標(biāo)準(zhǔn)管校零，并計算POD活性。用蒸餾水校零。
[0098]POD 活性(Δ OD.g_1.min-1) = ( Δ OD470 XVT)/(FffXtXV1)
[0099]式中t:反應(yīng)時間(min) ；VT:樣液總體積(mL) -,Y1:測定時樣品用量(mL) ；Fff:樣品鮮重(g)。
[0100]結(jié)果如圖12中A所示，Gepl可誘導(dǎo)煙草葉片一系列防御相關(guān)酶的活性提高。Gepl誘導(dǎo)4d后POD活性明顯高于對照組(P <0.05)，在誘導(dǎo)7d后POD活性達(dá)到最大值，約是對照組的3倍(P <0.01)，與對照組極顯著性差異，此后活性急劇下降，9d后趨于平衡，但仍較對照組高。
[0101](7)多酚氧化酶(PPO)活性測定
[0102]PPO粗酶液提取與POD相同，不需稀釋。測定時向比色管中加入0.05M PBS (pH
7.0)1.5mL和粗酶液0.1mL0 30°C水浴2min后，加入0.02M鄰苯二酚1.5mL，搖勻后迅速于420nm下測定OD值增加速度，并計算PPO活性。用蒸餾水校零。
[0103]PPO 活性(Δ OD.g_1.min-1) = ( Δ OD420 XVT)/(FffXtXV1)
[0104]式中t:反應(yīng)時間(min) ；VT:樣液總體積(mL) -,Y1:測定時樣品用量(mL) ；Fff:樣品鮮重(g)。
[0105]結(jié)果如圖12中B所示，多糖激發(fā)子G印I處理后煙草葉片PPO活性高于對照組。Gepl處理煙草后，PPO活性開始升高，7d時達(dá)到最大值，顯著高于對照組(P < 0.05)，隨后開始下降，其變化趨勢與POD相似。
[0106](8)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定
[0107]準(zhǔn)確稱取煙草葉片0.25g放入預(yù)冷的研缽中，加入3mL 0.05M硼酸緩沖液(pH
8.4)和少量石英砂，冰浴研磨成勻漿。4°C，12000r/min離心20min，取上清夜即粗酶液，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0108]測定PAL活性時，分別向比色管中加入3.8mL 0.1M硼酸緩沖液、ImL 0.02ML-苯丙氨酸和0.2mL粗酶液。40°C水浴60min后加入ImL鹽酸終止反應(yīng)，測定OD29tl值，并計算PAL活性。對照管用硼酸緩沖液代替粗酶液。
[0109]PAL 活性(0.01 AOD.g_1.mirT1) = (100X Δ OD290 X VT) / (Fff X t X V1)
[0110]式中t:反應(yīng)時間(min) ；VT:樣液總體積(mL) -,Y1:測定時樣品用量(mL) ；Fff:樣品鮮重(g)。
[0111]結(jié)果如圖12中C所示，在Gepl處理后的全部檢測時間內(nèi)，PAL活性浮動較小。激發(fā)子處理6d后,PAL活性開始增加，9d時達(dá)到最大值,是對照組的1.6倍(p < 0.05)，隨后隨著時間的延長酶活性逐漸下降。
[0112]實施例5:
[0113]Gepl誘導(dǎo)煙草獲得系統(tǒng)抗性
[0114]檢測激發(fā)子Gepl誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)獲得系統(tǒng)抗性的濃度均采用4mg/mL。
[0115]TMV病毒汁液的制備:稱取Ig新鮮的已具有明顯病毒癥狀的煙草葉片，放入研缽中，加入0.05M的PBS (pH 7.0) 40mL和2g石英砂，研磨成勻漿后，2層紗布過濾，得到的病毒濾液(30個病毒粒子/ml)即可用來摩擦接種煙草，用于以下實驗或?qū)嵤├?br> [0116]實驗對象為長勢健康、6-7葉期的心葉煙。選取植株上部的2片葉片，注射G印I共15 μ L。7d后，用脫脂棉蘸取病毒汁液及石英砂(0.5mL病毒濾液/葉片，0.1g石英砂/葉片)，沿著葉脈小心且均勻地涂抹在其余葉片上。以蒸餾水作對照。分別于接種病毒后48h和72h觀察枯斑的形態(tài)與數(shù)量。按照下列公式計算枯斑抑制率:
[0117]枯斑面積抑制率=[(對照組枯斑面積占葉片總面積百分比一實驗組枯斑面積占葉片總面積百分比)/對照組枯斑面積占葉片總面積百分比]X100%
[0118]枯斑數(shù)量抑制率=[(對照組枯斑數(shù)量一實驗組枯斑數(shù)量)/對照組枯斑數(shù)量]X100%
[0119]結(jié)果顯示:G印I處理后的煙草對TMV的侵染有一定的抗性，表現(xiàn)在枯斑數(shù)量的減少和枯班面積的減小。G印I誘導(dǎo)煙草葉片7d后接種TMV，分別在接種TMV 2d和3d后調(diào)查枯斑數(shù)和枯斑面積，結(jié)果顯示，Gepl誘導(dǎo)組的枯斑數(shù)量和枯斑面積都明顯低于對照組。A和a為對照組煙草在接種TMV后2d和3d時的照片；B和b為G印I處理過的煙草在接種TMV后2d和3d時的照片。在接種TMV 2d和3d后，枯斑數(shù)量的抑制率分別達(dá)到了 60.04%和60.57%;同時枯斑面積的抑制率也分別達(dá)到了 76.66%和69.32%。表明G印I處理后的煙草對TMV的侵染有一定的抗性和抑制作用。
[0120](2) GepI誘導(dǎo)煙草對TMV復(fù)制的抑制作用
[0121]選取長勢相同的6-8葉期云煙87煙草苗，每組3棵。實驗組用Gepl對整個植株葉片均勻噴霧，連續(xù)施用3d,每天I次,一次共噴淋150ml Gepl。分別用已市場化的超敏蛋白(Messenger，美國伊甸生物技術(shù)公司)和蒸餾水作對照。超敏蛋白按其產(chǎn)品說明書使用(50mg/L)。間隔7d后摩擦接種TMV(5ml病毒汁液/棵苗)。21d后采取各煙草的同一部位葉片，用熒光定量PCR檢測煙草葉片的TMV含量。每組重復(fù)3次。具體操作步驟如下:
[0122]a.植物組織總RNA的提取及檢測
[0123]利用Trizol試劑提取植物材料總RNA，具體方法如下:
[0124]液氮研磨煙草葉片，每1.5mL離心管分裝0.1g樣品；加入ImL Trizol試劑,迅速震蕩混勻，室溫靜置1min ;加200 μ L氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min ；4°C，12000rpm離心15min ;取水相(約400 μ L)，加400 μ L異丙醇顛倒混勻室溫下靜置lOmin，4°C，12000rpm離心15min，棄上清；加ImL 75%乙醇清洗RNA，離心棄上清；室溫靜置約15min，使RNA沉淀干燥；加20 μ L DEPC水溶解，取2 μ L進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，并用分光光度計(Α260/Α280)測定RNA濃度。
[0125]b.除去 RNA 中的 DNA
[0126]用DNA I處理以除去RNA中的DNA。
[0127]反應(yīng)體系為:10Xreact1n buffer with Mg2+IuL
[0128]RNase-free DNase IIuL
[0129]RNase-free waterUp to 1uL
[0130]反應(yīng)條件為:37°C下孵育60min。
[0131]加入I μ L 的 50mM 的 EDTA，65°C孵育 lOmin，以除去 DNA I。
[0132]c.反轉(zhuǎn)錄
[0133]參照Reverse Transcriptase M-ML (RNase H-) (TaKaRa)說明書進(jìn)行。
[0134]首先是cDNA第一條鏈的合成。
[0135]合成體系為 :
[0136]

Total RNA ( DNase I treated)I μg

Reverse Primer (OligodT)I μ!>

SxRetict1n butter4 μΕ

Ribolockl Μ RNcise inhibitorI μL.1raM dNTP mix2 μL
RevertAcidl χ? M-MuLV Reverse TninseriptaseI pL
[0137]輕輕混勻，短暫離心后于42°C孵育60min。70°C反應(yīng)1min終止反應(yīng)。
[0138]d.熒光定量PCR檢測煙草葉片中TMV含量
[0139]根據(jù)SYBR Premix Ex Taq? II (Perfect Real Time)的說明書，進(jìn)行Real-time PCR,反應(yīng)體系為:SYBR Premix EX Taq?II (2 X) 12.5 μ L, ROX ReferenceDyeII(50X)0.5μ L, qTMVF/qActinF (10 μ M) 0.5 μ L, qTMVR/qActinR(10 μ Μ) 0.5 μ L, cDNAIyL, ddH2010 μ L, Total 25 μ L。
[0140]引物為:qTMVF:5'-TGCCGAAACGTTAGATGCTACTC-3'，
[0141]qTMVR:5/ -AAGGAGCGCGATAAATAATTTAATAGTAGA-3,；
[0142]qActinF:5/ -GGTAGCTCCACCTGAGAGGAAGT-3'，
[0143]qActinR:5/ -GCCTTTGCAATCCACATCTGT-3;。
[0144]其中引物qTMVF和qTMVR擴(kuò)增TMV的外殼蛋白(CP)的部分序列，qActinF和qActinR擴(kuò)增煙草持家基因Actin。
[0145]反應(yīng)條件:預(yù)變性階段:95°C 1s ;PCR反應(yīng)階段:95°C 6s，62°C 35s，重復(fù)35個循環(huán)；熔解階段:95°C 15s，62°C 60s,95°C 15s，62°C 15s。
[0146]求出Δ ACT值，進(jìn)行定量分析。
[0147]結(jié)果如圖14所示:經(jīng)Gepl處理的煙草,體內(nèi)TMV CP基因的表達(dá)量是對照組的9%,而超敏蛋白(Messenger)處理組是對照組的60%。說明Gepl誘導(dǎo)的煙草可顯著抑制TMV在煙草體內(nèi)的增殖。
[0148](3)觀察G印I對感染TMV煙草葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響
[0149]對煙草的預(yù)處理方法同步驟(1)。分別于接種TMV 7d、14d和21d采取煙草同一葉位的病毒感染部位，進(jìn)行固定、脫水、包埋和切片，然后置于透射電鏡下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。以蒸餾水作為對照。
[0150]結(jié)果如圖15所示:圖15中Al，al:對照組感染TMV 7d后；BI，bl:G印I處理組感染TMV 7d后；A2，a2:對照組感染TMV 14d后；B2，b2:Gepl處理組感染TMV 14d后；A3，a3:對照組感染TMV 21d后；B3，b3:G印I處理組感染TMV 21d后。Ch.葉綠體；CW.細(xì)胞壁；M.線粒體；N.細(xì)胞核；0s.嗜鋨顆粒；P.TMV病毒粒子；S.淀粉粒；PC.病毒包含體。健康的煙草植株細(xì)胞中含有大量的葉綠體，且在細(xì)胞邊緣緊密排列。發(fā)育完全的葉綠體呈扁橢球狀，具有清晰的雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含大的淀粉粒和嗜鋨顆粒，基粒片層致密(BI)。受TMV侵染的煙草細(xì)胞中，葉綠體內(nèi)的淀粉粒和嗜鋨顆粒數(shù)量減少，葉綠體嚴(yán)重腫脹，基粒分散，基質(zhì)不均一，部分葉綠體解體(a3);細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)晶體狀內(nèi)含體，先是分布在葉綠體周圍(a2和a3)，之后充滿整個細(xì)胞質(zhì)(A3)。G印I處理過的煙草葉肉細(xì)胞中存在極少量病毒粒子，且病毒粒子斷裂，長短不一(b2);細(xì)胞器的完整度較好；葉綠體具完整的膜結(jié)構(gòu)，基粒片層排列整齊，內(nèi)含少量小的淀粉粒(B3);細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)菱形包含體，存在于葉綠體周圍，放大觀察可以看到縱橫排列的條紋，外被膜狀物(b3)。說明Gepl不僅可以抑制TMV對細(xì)胞的侵染，還可以抑制TMV在煙草細(xì)胞內(nèi)的增殖。
[0151 ] (4)多糖激發(fā)子誘導(dǎo)煙草過敏性反應(yīng)基因和抗性相關(guān)基因的表達(dá)
[0152]A.總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成
[0153]選取長勢相同的8葉期三生煙，每組3棵苗。檢測激發(fā)子誘導(dǎo)HR基因(hypersensitive response)表達(dá)時,用4mg/mL多糖激發(fā)子注射煙草第6、7和8位葉片的A部位(圖20)(共注射60 μ L)，采取B部位葉片，采樣時間為G印I處理后0h，3h，6h，12h，ld，3d，5d，7d，9d。對誘導(dǎo)抗性基因表達(dá)檢測的煙草用4mg/mL多糖激發(fā)子噴霧煙草的第6、7和8位葉片(共噴霧20mL)，采取第4和5位葉，采樣時間同HR基因表達(dá)檢測。對植物組織總RNA進(jìn)行提取和檢測，除去RNA中的DNA，反轉(zhuǎn)錄均同上。
[0154]b.特異引物的設(shè)計
[0155]抗性基因表達(dá)分析采用半定量RT-PCR的方法，以在煙草中高度保守的基因qActin作內(nèi)參。在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄前需保證每個樣品的RNA量相同。引物序列如表1所示。
[0156]c.HR和抗性基因的RT-PCR擴(kuò)增
[0157]取上述反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增抗性基因。反應(yīng)體系為:
[0158]

【權(quán)利要求】
1.一種疫霉多糖激發(fā)子Gepl，通過以下步驟制備得到: 1)將煙草疫霉0°.parasitical的發(fā)酵液先用紗布過濾，再離心后收集上清液；氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K除去蛋白，再加入4 X體積的無水乙醇放置于-20 °〇沉淀過夜，離心棄上清，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得到的粉末即為粗多糖； 2)將上述獲得的粗多糖溶于少量的蒸餾水中，依次通過DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-100柱層析進(jìn)一步分離純化，硫酸-苯酚法檢測糖含量繪制洗脫曲線；利用洗脫曲線各峰值的組分進(jìn)行活性檢測； 在活性分析后，對有活性的物質(zhì)進(jìn)行真空冷凍干燥進(jìn)行濃縮，即得疫霉多糖激發(fā)子Gepl ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 1)將發(fā)酵液先用4層紗布過濾,濾液于3000r/min離心10 min后，收集上清液； 用冷凍干燥法將得到的上清液濃縮成約原體積的I / 10;向濃縮液中加入I / 5體積的氯仿振蕩20 min,8000 r/min離心10 min,除去氯仿和部分蛋白，重復(fù)3次；繼續(xù)向濃縮液中加入終濃度均為20 μ g/mL胰蛋白酶和蛋白酶K于37 °C溫育30 min后，沸水煮沸5min, 4 0C >8000 r/min離心取上清；向除去蛋白的濃縮液中加入4 X體積的無水乙醇放置于-20。(!'沉淀過夜,4 0C >8000 r/min離心5 min,棄上清,沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得到的粉末即為粗多糖； 2).粗多糖溶于蒸餾水后，加入無水乙醇，終濃度為60%，置于-20°C冰箱過夜，4°C、8000 r/min離心20 min取上清，向上清液中加入無水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到80%后，置于-20°C冰箱過夜，4°C、8000 r/min離心20 min取沉淀，待乙醇完全揮發(fā)后加入蒸餾水重溶，得到80%乙醇沉淀多糖；取80%乙醇沉淀多糖于3000 r/min離心10 min，取上清液，備上樣；待DEAE-52纖維素柱子下端流出液pH值為7.0開始上樣，共上樣4 mL，依次用蒸餾水、0.1 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl>I mol/L NaCl 溶液洗脫，自動收集,流速 I mL/min,每管6 mL ;苯酚-硫酸法跟蹤檢測，以試管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到粗多糖的洗脫曲線，合并含糖單一峰位，蒸餾水透析2 d，檢測其生物活性后，冷凍干燥； 取適量Sephadex G-100粉末，加入足夠的蒸餾水室溫下溶脹過夜，脫氣后濕法裝柱，0.01 mol/L NaCl平衡過夜；將DEAE-52纖維素柱層析分級所得的活性組分溶于最小體積的0.01 mol/L NaCl溶液中，加到已平衡好的Sephadex G-100柱，以0.01 mol/L NaCl溶液為洗脫液，流速為I mL / 6 min,每管3 mL,用自動部分收集器收集,苯酹-硫酸法檢測多糖分布，以試管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制洗脫曲線，分別收集各主峰，蒸餾水透析2 d，檢測其生物活性后，冷凍干燥，即得多糖激發(fā)子Gepl。
3.權(quán)利要求1所述的疫霉多糖激發(fā)子Gepl在提高植物抗病性中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:疫霉多糖激發(fā)子Gepl在提高煙草對煙草花葉病毒抗性中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的疫霉多糖激發(fā)子Gepl在制備煙草抗煙草花葉病毒制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01N43/16GK104131049SQ201410382515
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】趙秀云, 祁高富, 霍瑞, 李錫宏, 許汝冰, 王瑞, 譚軍, 郭利 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)