岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因LrGLP1的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因LrGLP1的應(yīng)用，LrGLP1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所述，編碼類萌發(fā)素蛋白，本發(fā)明通過功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)研究證實(shí)LrGLP1基因具有提高植物抗真菌侵染的功能。將本發(fā)明抗真菌LrGLP1基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)入煙草中過量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草植株具有很強(qiáng)的體外抗真菌活性。LrGLP1超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鏈格孢、核盤菌以及串珠狀赤霉菌的生長具有明顯的抑制作用。
【專利說明】岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程相關(guān)技術(shù)研究領(lǐng)域，特別是具有抗真菌活性的岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]植物病害是指植物在生物因素的影響下發(fā)生的一系列生化、生理甚至形態(tài)上的病變，阻礙正常的生長、發(fā)育，進(jìn)而嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。病原真菌是引起植物病害的主要病原物。真菌病害發(fā)病率極高，且大規(guī)模發(fā)生時(shí)會(huì)致使農(nóng)作物減產(chǎn)甚至死亡。傳統(tǒng)對(duì)于真菌病害的預(yù)防和處理主要是篩選抗性強(qiáng)的品種、及時(shí)清理病害植株及果實(shí)、使用農(nóng)藥等，這些措施有的周期長，有的效果差，有的還會(huì)給環(huán)境和人畜的生命健康帶來危害，因此不能徹底防治真菌病害。隨著重組DNA技術(shù)的創(chuàng)立和快速發(fā)展，利用基因工程技術(shù)來培育新的對(duì)真菌病害有很強(qiáng)抗性的植物品種已經(jīng)成為解決植物真菌病害的新思路,有望從根本上解決真菌病害問題。
[0003]與萌發(fā)素(germin)—樣，類萌發(fā)素蛋白(Germin-like proteins, GLPs)最初是在小麥中發(fā)現(xiàn)(Dunwell J M, Gibbings J G, Mahmood T, et al.Germin andgermin-like proteins: evolut1n, structure, and funct1n.Critical Reviewsin Plant Sciences, 2008，27(5): 342-375)。在結(jié)構(gòu)上，兩者都是由兩個(gè)外顯子編碼形成的穩(wěn)定低聚物，都含有β_折疊桶狀結(jié)構(gòu)域，且都含有一個(gè)“cupin”蛋白結(jié)構(gòu)域，共同屬于一個(gè)功能多樣化的家族，即cupin超家族。在GLPs的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)特征結(jié)構(gòu)域稱為“germin box”，結(jié)構(gòu)域中包含兩個(gè)特定基序，分別為:germin motif1_G (X) 5HxH(x) 3，4E (X) 6G 和 germin motif 2-G (x) 5PxG (x) 2H (x) 3N (Breen J，BellgardM.Germin-like proteins (GLPs) in cereal genomes: gene clustering and dynamicroles in plant defence.Funct1nal & Integrative Genomics, 2010， 10(4):463-476)。GLPs為多功能蛋白，主要以酶、受體和結(jié)構(gòu)蛋白的形式參與多種生理生化過程。其中，酶主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、草酸鹽氧化酶(oxalateoxidase, 0X0)、ADP 葡萄糖焦憐酸酶 / 憐酸二酯酶(ADP glucose pyrophosphatase/phosphodiesterase，AGPPase)，受體如雄激素結(jié)合蛋白(androgen binding protein,ABP19/20)激素受體、Rhicadhesins 受體等。
[0004]目前根據(jù)功能的差異將植物的GLPs分為3個(gè)亞類:第I亞類為“true germin”，主要包括小麥、大麥的萌發(fā)素及一些其他谷類植物的GLPs，它們具有SOD和0X0的雙重活性；第2亞類的GLPs主要是來自于除小麥和大麥之外的其他禾谷類、裸子植物和茄科植物等，這一亞類主要與植物耐氧化脅迫有直接關(guān)系，并與錳超氧化物歧化酶(MnSOD)極其相似;第3亞類的GLPs主要包括與生長素代謝相關(guān)的一些調(diào)節(jié)蛋白，它們與植物的生理節(jié)律和花期誘導(dǎo)功能有關(guān)(Khuri S，Bakker F Tj Dunwell J M.Phylogenyjfunct1n, and evolut1n of the cupins， a structurally conserved, funct1nallydiverse superfamily of proteins.Molecular B1logy and Evolut1n, 2001，18(4): 593-605)。Woo等人(2000)研究一個(gè)大麥germin蛋白的空間結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，每個(gè)gemin蛋白以單體的形式相互結(jié)合形成二聚體，再進(jìn)一步以“二聚體的三聚體”的方式形成極為穩(wěn)定的六聚體(Woo EJ, Dunwell JM, Goodenough Pff, et al.Germin is amanganese containing homohexamer with oxalate oxidase and superoxide dismutaseactivities.Nature Structural B1logy, 2000, 7: 1036-1040)。與 MnSOD 類似，Gemin單體中存在相應(yīng)的配體并可以結(jié)合錳離子，這就從一方面解釋了 GLP蛋白具有SOD活性的原因。在GLPs中包含兩個(gè)半胱氨酸殘基，可以形成二硫鍵，維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
[0005]Godfrey等人在葡萄{Vitis vin if era)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個(gè)(?/?基因，這些(?/?的ORF所編碼蛋白長度從207-205個(gè)氨基酸殘基不等，并且包含不同的GLP特征結(jié)構(gòu)域(Godfrey D, Able A J, Dry I B.1nduct1n of a grapevine germin-like protein{VvGLP3) gene is closely linked to the site of Erysiphe necator infect1n: apossible role in defense.Molecular Plant-Microbe Interact1ns, 2007, 20(9):1112-1125)。的表達(dá)在不同組織和不同發(fā)育階段差異較大。KWZ/C和KWZ/形在葡萄葉和漿果(包括果皮和果肉)中有表達(dá)'VvGLPl和KWZ/石分別只在根和成熟之前的漿果中表達(dá)；V VGLP3, V VGLP4, VvGLP7則在所有的組織中都表達(dá)。白粉病菌(Brysiphenecator)侵染迅速誘導(dǎo)漿果和葉片中和VvGLP4的表達(dá)，相對(duì)而言，白粉病菌侵染的漿果中KWZ/石和發(fā)病葉中汁似/形的表達(dá)量都顯著減少，KWZ/C的表達(dá)卻基本不受白粉病菌侵染的影響。KWZ/y的表達(dá)受疋侵染的誘導(dǎo)，并具有SOD活性。從甜菜(Beta vulgaris)克隆的 GLP 基因,在線蟲 Qleterodera schachtii)入侵后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，將轉(zhuǎn)入擬南芥中過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株系抑制真菌菌絲在體內(nèi)外的生長擴(kuò)散，進(jìn)而增強(qiáng)植株對(duì)病原真菌Ver ticiIlium longisporum和Rhizoc tonia solani的抗性，但是不會(huì)影響有益真菌在其體內(nèi)的生長(Knecht K, Seyffarth M, Desel C，et al.Express1n of BvGLP-1 encoding a germin-like protein from sugar beetin AraMdopsis thaliana leads to resistance against phytopathogenic fung1.Molecular Plant-Microbe Interact1ns, 2010, 23(4): 446-457)。
[0006]GLPs在植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)中有著極為重要的作用。通過RNA干擾使水稻{Oryza sativa)類萌發(fā)素蛋白基因OsGLPl沉默，OsGLPl功能缺失植株的高度只有大約正常植株的一半，谷粒也不飽滿，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)真菌病害的敏感度增加，如紋枯病和稻痕病(Banerjee J, Maiti M K.Funct1nal role of rice germin-like proteinl inregulat1n of plant height and disease resistance.B1chemical and B1physicalResearch Communicat1ns, 2010, 394(1): 178-183)。BnGLP3 同時(shí)具有 0X0 和 SOD 活性，還可以在氧爆發(fā)時(shí)水解活性氧生成H2O2,降低植株對(duì)病原菌的敏感性，且在油菜iBrassicanapus)受核盤菌{Sclerotinia scIerot1rum)侵染6h后表達(dá)量迅速增加(Rietz S，Bernsdorff FEM, Cai D.Members of the germin-like protein family in Brassicanapus are candidates for the initiat1n of an oxidative burst that impedespathogenesis of Sclerotinia scIerot1rum.Journal of experimental botany,2012， 63(15): 5507-5519)。
[0007]本發(fā)明中類萌發(fā)素蛋白基因ZrCLcV來自ill民江百合(Zi7iw? regaJe Wilson)。山民江百合又名王百合，多年生草本植物，我國的百合特有種。僅分布于四川西岷江流域海拔800~2700m的河谷到山腰的巖石縫中，對(duì)尖孢鐮刀菌等真菌具有很強(qiáng)的抗性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種從岷江百合中克隆獲得具有抗真菌活性的類萌發(fā)素蛋白的全長基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該基因全長為908bp，包含一個(gè) 654bp 的開放閱讀框、59bp 的 5’非翻譯區(qū)(untranslated reg1ns, UTR)及 195bp的3’ UTR，編碼如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0009]本發(fā)明所述類萌發(fā)素蛋白基因的編碼區(qū)是序列表SEQ ID NO:1中第60-713位所示的核苷酸序列。
[0010]本發(fā)明分離克隆岷江百合的一個(gè)抗真菌相關(guān)基因的完整cDNA片段，通過根癌農(nóng)桿菌iAgrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)將目的基因轉(zhuǎn)入受體植物中過量表達(dá),并通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因是否具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基礎(chǔ)。發(fā)明人將這個(gè)基因命名為LrGLPl。
[0011]GLP是PR家族中的一類胞外糖蛋白，在植物的生長發(fā)育以及對(duì)生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)中有重要的作用。GLPs具有0X0、SOD、AGPPase中的至少一種活性。在真菌病害入侵時(shí)，SOD將氧爆發(fā)時(shí)形成的活性氧轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧分子，降低過多活性氧對(duì)植株形成的傷害；0X0可以催化草酸產(chǎn)生二氧化碳和過氧化氫；兩種反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化氫可以通過纖維素交聯(lián)作用增強(qiáng)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，并催化細(xì)胞壁的氧化交聯(lián)形成乳突，延緩和阻止病原菌的侵入和擴(kuò)散，以保護(hù)細(xì)胞免受再次感染。此外過氧化氫還是植物體內(nèi)重要的抗病防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)分子，可以激活并誘導(dǎo)體內(nèi)大量抗病基因的表達(dá)，激活體內(nèi)的抗病防衛(wèi)反應(yīng)。
[0012]本發(fā)明涉及分離包含的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌入侵的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID所示，對(duì)該基因進(jìn)行分析，表明LrGLPl全長cDNA為908bp，包含一個(gè)654bp的開放閱讀框、59bp的5’ UTR及195bp的3’ UTR，其中ORF編碼一個(gè)具有217氨基酸的蛋白質(zhì)。LrGLPl的核苷酸序列與岷江百合有97%的相似性。編碼蛋白具有類萌發(fā)素蛋白的特征結(jié)構(gòu)域，germin motif I和germin motif 2。BLASTp檢索結(jié)果表明編碼的蛋白質(zhì)與ill民江百合LrGLP2的相似性最高，與山羊草(Aegilops tauschii)小麥{Triticum uratu)中幾個(gè)GLPs的相似性約為64%~65%,這表明其屬于ill民江百合中的類萌發(fā)素蛋白。超表達(dá)序列表SEQ ID: I所示序列可以增強(qiáng)煙草對(duì)鏈格孢(Alterimriei alternata )、核盤菌iSclerotiniasclerot1rum)以及串珠狀赤霉菌moniliformis.、的抗性。
[0013]淺LrGLPl基因可以應(yīng)用于提高煙草的抗真菌特性，具體操作如下:
(I)采用擴(kuò)增的特異引物 ，從接種尖孢鐮刀菌后的岷江百合根中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcript1n-polymerase chain react1n,RT-PCR)擴(kuò)增出的全長編碼區(qū)，然后將其連接到pMD-18T載體上，經(jīng)測(cè)序獲得具有目的基因的克隆。
[0014](2)用限制性內(nèi)切酶和&oRI酶切pMDlS-T-Zrffi/^載體和植物表達(dá)載體PCAMBIA2300S,通過膠回收得到目的基因片段和載體大片段。再將所獲得基因片段與pCAMBIA2300S載體片段連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體。之后將所構(gòu)建的重組載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)。
[0015](3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，并通過PCR以及RT-PCR檢測(cè)得到真正的轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)基因植株對(duì)于病原真菌的抗性，最后篩選出對(duì)真菌抗性明顯增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
[0016]本發(fā)明為提高植物對(duì)真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病植物可以克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發(fā)明中來自岷江百合的基因能增強(qiáng)植物對(duì)幾種病原真菌的抗性，將該基因?qū)霟煵葜?，可以產(chǎn)生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術(shù)培育抗性植物品種和材料具有明顯的優(yōu)勢(shì)和不可取代的重要性。它不僅可以為大規(guī)模生產(chǎn)作物、花卉等提供方便，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，還可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本、減少環(huán)境污染，因此本發(fā)明具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明中部分轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果，其中Marker:DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，OOObpU, 000bp、750bp、500bp、250bp 以及 10bp六條DNA片段組成；正對(duì)照:質(zhì)粒pMD18-T-Zrffi/^為模板的PCR反應(yīng)；WT:非轉(zhuǎn)基因煙草(野生型)總DNA為模板進(jìn)行的PCR。
[0018]圖2是本發(fā)明中部分陽性轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析結(jié)果圖，其中Marker:DL2000 DNA Marker (大連寶生物);WT:非轉(zhuǎn)基因煙草總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板的PCR產(chǎn)物；正對(duì)照:質(zhì)粒pMD18-T- LrGLPl為模板的PCR產(chǎn)物。
[0019]圖3是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因煙草體外抗真菌活性的抑菌效果圖；其中a、b、c圖示中的真菌分別是鏈格孢、核盤菌、串珠狀赤霉菌;WT為野生型煙草的總蛋白；CK為空白對(duì)照，即無蛋白對(duì)照(用于提取蛋白的緩沖液)。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面通過附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，本實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0021 ] 實(shí)施例1..LrGLPl全長cDNA克隆以及序列分析
用尖孢鐮刀菌接種岷江百合，用接種后12 h的根提取總RNA，用液氮將處理過的岷江百合的根研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和操作過程為:取5 μ gtotal RNA，依次加入 50 ng oligo (dT)，2 μ L dNTP Mix (2.5mM each)，用 DEPC 水將反應(yīng)體積補(bǔ)齊至14.5 μ L ;混勻后，70°C加熱變性5 min后迅速在冰上冷卻5 min，然后依次加入 4 yL 5XFirst-stand buffer,0.5 μ L RNasin (200U)、1 μ L M-MLV (200U)，混勻并簡短離心，42°C溫浴1.5 h，取出后70°C加熱10 min，終止反應(yīng)。cDNA第一鏈合成后置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022] 以合成的第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因，所用上下游引物序列分別為5，ACGCACATATGGCTACCCACTACT3，及 5，CGACTAGAACTGAGCCTGGAGCC3，。采用 Advantage?2PCR Enzyme (Clontech)擴(kuò)增出目的基因。PCR 反應(yīng)條件:95°C I min ；94°C 30 s,61°C 30 s，72°C I min，28 個(gè)循環(huán)；72°C 5 min。反應(yīng)體系(20 μ L)為 I μ L cDNA、2 μ L1XAdvantage 2 PCR BufferU.8 μ L dNTP Mix (1mM each) ,0.2 μ L 正向引物(10μΜ)、0.2 μ L 反向引物(10 μΜ)、0.2 μ L Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μ LPCR-Grade water 0 PCR結(jié)束后，取8 μ L進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性以及大小。
[0023]所得到PCR產(chǎn)物只有一條DNA帶，故直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，使用的試劑盒為PMD18-T vector kit (大連寶生物)，反應(yīng)體系和操作過程為:取1.5 μ L PCR產(chǎn)物，依次加入 I U L pMD18_T vector (50 ng/μ L)和 2.5 μ L 2XLigat1n solut1n I,混勻后置于16°C過夜反應(yīng)。通過熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci感受態(tài)中。用含有氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選若干個(gè)單菌落，搖菌后用擴(kuò)增的特異引物檢測(cè)多克隆位點(diǎn)插入的克隆。將得到的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，最終獲得的ZrffiZV全長cDNA為908 bp,通過NCBI ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析發(fā)現(xiàn)其包含一個(gè)654bp的開放讀碼框(見序列表)。LrGLPl編碼一個(gè)含217個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)LrGLPl，其分子量約為23.36 KDa，等電點(diǎn)為5.60。借助生物信息學(xué)軟件SignalP 4.1撕LrGLPl編碼的蛋白序列，檢測(cè)其是否具有N端信號(hào)肽。結(jié)果顯示在LrGLPl中存在信號(hào)肽，這就表明LrGLPl為一種分泌蛋白。
[0024]實(shí)施例2:植物超表達(dá)載體構(gòu)建
采用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)提取插入的大腸桿菌質(zhì)粒pMD18-T-Zrffi/^以及植物表達(dá)載體pCAMBIA2300S質(zhì)粒，取I μ L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)所提取質(zhì)粒的完整性及濃度高低。用限制性內(nèi)切酶&0RI (TaKaRa)和(TaKaRa)分別對(duì)質(zhì)粒pMDlS-T-Zrffi/^和pCAMBIA2300S進(jìn)行雙酶切(100 μ L體系)，反應(yīng)體系和操作過程為:分別取20 μ L pMD18-T~lr(7lP7和pCAMBIA2300S質(zhì)粒、依次加入10μ L 10ΧΚ buffer,5 μ L EcoRI'b μ L Barnm.m μ L ddH20，混勻后短時(shí)離心，置于 37°C過夜反應(yīng)。將所有酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)%LrGLPl片段和pCAMBIA2300s載體大片段分別進(jìn)行膠回收，取I μ L回收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收片段的大小以及濃度，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025]利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，將回收的 ZrffiWDNA 片段和 pCAMBIA2300S 載體片段連接起來，反應(yīng)體系(20 μ L)和操作過程為:取10 UL LrGLPimk片段依次加入2μ L pCAMBIA2300S 載體 DNA、2 μ L 10ΧΤ4 DNA Ligase BufferU μ L Τ4 DNA Ligase、5μ L ddH20，混勻后短時(shí)離心，然后16°C水浴過夜反應(yīng)。接著采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin, Km)的固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴(kuò)增LrGLPl的特異引物進(jìn)行PCR，挑選出LrGLPl與PCAMBIA2300S成功連接的克隆，并向檢測(cè)得到的陽性菌株中加入甘油并置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0026]采用SanPr印柱式質(zhì)粒抽提試劑盒(上海生工)提取并純化上述大腸桿菌DH5a中的pCAMBIA2300S-Zrffi/^質(zhì)粒。隨后用液氮凍融法將上述構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300S-Zrffi/?7轉(zhuǎn)入所制備的根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。操作步驟為:取
2yg pCAMBD^SOOS-Zrffi/^質(zhì)粒加入含有200 μ L感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5 min,隨后轉(zhuǎn)入液氮中冷凍I min,然后迅速置于37°C水浴5 min,再冰浴2 min,之后加入500 μ L LB液體培養(yǎng)基于28°C振蕩培養(yǎng)4 h。將活化后的農(nóng)桿菌涂于含有50 mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)。挑選單菌落搖菌，再用擴(kuò)增的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)pCAMBIAZSOOS-Zrffi/^是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。對(duì)于陽性克隆，加入甘油后置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]實(shí)施例3:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因植物篩選
本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因受體是煙草tabacum L.)。將煙草種子用75%的酒精浸泡30 s,用無菌水洗漆后用0.1%的HgCl2浸泡8 min,然后再用無菌水洗漆若干次,播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，2 8°C暗培養(yǎng)5-8 d，發(fā)芽后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱(25°C，16h/d光照)，以后每月用MS培養(yǎng)基繼代一次。
[0028]從_80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIAZSOOS-Zrffi/^質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌種，取20 μ L接種于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁。吸取I mL渾濁的菌液至含有50 mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48 h。隨后將LB固體培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌刮下適量接種于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)5-8 h以活化農(nóng)桿菌。
[0029]取無菌煙草苗葉子切成約I cm2的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農(nóng)桿菌的MGL液體培養(yǎng)基中，25°C浸染15 min。用無菌濾紙吸干葉盤表面的菌液，將葉盤置于共培養(yǎng)基上，22°C無光條件下共培養(yǎng)2天。煙草轉(zhuǎn)化的共培養(yǎng)基為MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30g/L蔗糖+6 g/L瓊脂。
[0030]將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)到加有抗生素的MS篩選培養(yǎng)基中分化成苗，同時(shí)篩選轉(zhuǎn)基因植株。煙草篩選培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+50 mg/L Km+200 mg/L 頭抱霉素(cefotaxime sodium salt, Cef);篩選培養(yǎng)時(shí)將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(25°C，16h/d光照，8h/d黑暗)。待煙草長出芽后用含有50 mg/LKm和200 mg/L Cef的MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。因煙草愈傷分化率較高，故需要對(duì)再生植株進(jìn)行進(jìn)一步篩選。將煙草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培養(yǎng)基上使其生根，最后選用生根較好的再生苗做進(jìn)一步的檢測(cè)。
[0031]采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的基因組DNA，取I μ L所得基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性和濃度。以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板用LrGLPl的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR結(jié)束后，取8 μ L產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)基因植株。部分煙草轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。LrGLPl轉(zhuǎn)基因煙草共篩選到29株陽性轉(zhuǎn)基因植株。
[0032]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因煙草中LrGLPl的表達(dá)分析以及轉(zhuǎn)基因植株抗真菌活性分析分別取陽性轉(zhuǎn)基因植株以及非轉(zhuǎn)基因煙草(野生型)的嫩葉提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成
cDNA第一鏈，并以此為模板用擴(kuò)增LrGLPl的特異引物進(jìn)行PCR，根據(jù)PCR結(jié)果分析各轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)?？俁NA提取以及RT-PCR的方法與實(shí)施例1中相同。PCR結(jié)束之后，取8 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。共檢測(cè)到18個(gè)轉(zhuǎn)基因單株中在轉(zhuǎn)錄水平大量表達(dá)，這些單株的編號(hào)為I~18。
[0033]將實(shí)驗(yàn)室保存的幾種真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基(200 g/L馬鈴薯，15 g/L瓊脂，20 g/L葡萄糖)上，28°C暗培養(yǎng)，待菌落生長至直徑約為2~3cm時(shí)添加蛋白，分析轉(zhuǎn)基因植株體外抗真菌活性。供試真菌共有6種:葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)、銀熱?包(Alternaria alternata)iBotrytis cinerea){ColIetorichum
gloeospor1ides) > Φ3?^^lif {Gibberella moniliformis)矛口核盤菌{Sclerotiniascleroterum)。為了防止其它雜菌污染所提取的蛋白，整個(gè)植物蛋白提取過程均是無菌操作。首先取I g轉(zhuǎn)基因煙草單株(編號(hào)分別為2、5、6、10)及野生型葉片放入研缽中，加入I mL蛋白提取液(1M NaCl, 0.1M乙酸鈉，1% PVP，pH6)，充分研磨。轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，混勻后4°C靜置過夜。4°C離心30 min (12,000 g)，取上清于新的1.5 mL離心管中，并取適量用紫外分光光度儀測(cè)定總蛋白濃度。將轉(zhuǎn)基因和野生型植株的總蛋白濃度調(diào)整至0.2μ g/μ L，然后分別取20 μ L滴于各真菌培養(yǎng)基的無菌濾紙上。在每個(gè)真菌的平板上除了添加不同轉(zhuǎn)基因煙草植株的總蛋白，同時(shí)平行添加野生型煙草的總蛋白和空白對(duì)照(蛋白提取液)。28°C培養(yǎng)幾天后觀察各處理真菌生長的情況，并據(jù)此來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草的體外抗真菌活性。結(jié)果如圖3所示，LrGLPl轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對(duì)核盤菌、鏈格孢以及串珠狀赤霉菌的生長具有明顯的抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.一種岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因在提高煙草對(duì)鏈格孢、核盤菌、串珠狀赤霉菌抗性中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因的應(yīng)用，其特征在于提高煙草的真菌抗性的具體操作如下: (1)將岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因與植物超表達(dá)載體pCAMBIA2300S連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體； (2)將上述構(gòu)建的重組載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中； (3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標(biāo)記來篩選轉(zhuǎn)化子，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)篩選獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，接種特定病原真菌，分析轉(zhuǎn)基因煙草蛋白對(duì)真菌生長的抑制活性，最后篩選出對(duì)真菌抗性明顯 增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104131014SQ201410382388
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】劉迪秋, 張南南, 季博, 韓青, 葛鋒, 陳朝銀 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)