一種北纈草組織培養(yǎng)繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明旨在提供一種北纈草(Valeriana fauriei Briq.)組織培養(yǎng)繁殖方法。具體如下：一、用北纈草幼嫩的莖段作外植體，進(jìn)行無菌處理；二、取無菌的北纈草的莖段置于固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出不定芽；三、誘導(dǎo)出的不定芽接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行生根和壯苗；四、組培苗移栽至培養(yǎng)基質(zhì)中煉苗培育。本發(fā)明不受自然條件的限制和影響，具有快速和易規(guī)?；奶攸c(diǎn)。本發(fā)明可以緩解野生北纈草資源緊缺和過度采挖破壞生態(tài)平衡的問題。
【專利說明】一種北織草組織培養(yǎng)繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及敗醬科纈草屬藥用植物北繳草(Valeriana fauriei Briq.)組織培養(yǎng)繁殖方法。

【背景技術(shù)】
[0002]北纟顏草(Valerianafauriei Briq.)為敗醬科 Valerianaceae 纟顏草屬(Valeriana)野生多年生草本植物。纈草性平味辛，具有鎮(zhèn)靜安神、解痙止痛的功效，根莖被作為鎮(zhèn)靜藥應(yīng)用已有上千年。北纈草為纈草屬植物中的代表，分布于東北地區(qū)(黑龍江、吉林、遼寧)和華東地區(qū)(江蘇、安徽、浙江、江西、臺(tái)灣)，并西向河南、陜西等地延伸。北纈草生于海拔2000m以下的山坡草甸、林間濕地、林緣路旁。目前，北纈草的藥理作用、化學(xué)成分已得到不同程度的研究。有關(guān)北纈草專利產(chǎn)品的報(bào)導(dǎo)日益增多，該植物的藥用價(jià)值已受到高度重視。我國大興安嶺地區(qū)野生北纈草資源較豐富，但過度開發(fā)利用對(duì)資源及環(huán)境造成破壞。而目前我國對(duì)于北纈草資源保護(hù)的研究尚處于起步階段，僅少量研究報(bào)道。
[0003]在我國，對(duì)于北纈草的獲取主要還是依賴于野生北纈草資源。然而，野生北纈草種子多數(shù)不育，自然發(fā)芽率較低，人工變溫處理催芽，發(fā)芽率最高僅為50%。此外北纈草種子細(xì)小，人工收集費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且大田栽培生產(chǎn)周期較長，占用耕地，易受氣候、病蟲害的影響。利用根莖移栽雖成活率高，但繁殖系數(shù)低，在大規(guī)模栽培種不適用。利用生物技術(shù)進(jìn)行中藥資源快速繁殖并實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)已成為一個(gè)新的發(fā)展方向。目前，對(duì)于纈草屬植物的組培研究還很少，有利用子葉無菌條件下誘導(dǎo)芽簇的報(bào)道，同時(shí)，僅從V.0fficinalis葉片中誘導(dǎo)獲得不定根，還未有對(duì)北纈草進(jìn)行快速繁殖的研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在緩解野生北纈草資源緊缺和過度采挖破壞生態(tài)平衡的問題，提供一種北纈草組織培養(yǎng)繁殖方法。該方法能加快北纈草的繁殖速度，有利于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)的:一種北繳草(Valeriana faurieiBriq.)組織培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟:
[0006](I)外植體誘導(dǎo):取北纈草幼嫩的莖段作為外植體，進(jìn)行無菌處理，接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基培養(yǎng)至獲得不定芽；
[0007](2)繼代增殖培養(yǎng):將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖；
[0008](3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所得不定芽在無菌條件下分離并接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)和壯苗，得到完整的組培苗；
[0009](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養(yǎng)5?10天，再全開蓋培養(yǎng)5?10天；將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，栽入由蛭石和營養(yǎng)土按1:1?1:3的比例混合成的培養(yǎng)基質(zhì)中煉苗培育成健壯的幼苗；
[0010]其中，步驟(I)中啟動(dòng)培養(yǎng)基為0.2?1.0mg/L 6_ΒΑ、0.01?0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基；
[0011]其中，步驟(2)中增殖培養(yǎng)基為0.2?1.0mg/L 6_BA、0.0l?0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基；
[0012]其中，步驟(3)中培養(yǎng)基為0.1?0.5mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的1/2MS
培養(yǎng)基。
[0013]優(yōu)選地，上述方法還包括步驟(I)中外植體除菌處理的方法為:用自來水沖洗15?25min，用60?80%乙醇消毒30?90s，用0.5?1.5%次氯酸鈉溶液消毒10?20min后取出，用無菌水沖洗3?5次，用滅菌后的濾紙吸干表面水分，得到無菌北纈草外植體。
[0014]優(yōu)選地，上述方法還包括步驟(I)、步驟(2)與步驟(3)中培養(yǎng)條件:2?5%蔗糖、0.5?2%瓊脂，pH5?6，培養(yǎng)溫度為20?30°C，光照時(shí)間12?20h.(Γ，光照2500?40001ux。
[0015]更優(yōu)選地，上述方法還包括步驟(I)、步驟(2)與步驟(3)中培養(yǎng)條件:3?4%蔗糖、0.5?1%瓊脂，ρΗ5.5?6，培養(yǎng)溫度為24?26 °C，光照時(shí)間15?18h.d—1，光照30001ux。
[0016]更優(yōu)選地，一種北纈草的組織培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟:
[0017](I)外植體誘導(dǎo):將幼嫩的莖段用自來水沖洗20min,用70%乙醇消毒Imin,用I %次氯酸鈉溶液消毒15min后取出，用無菌水沖洗3?5次，接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于光照30001ux，光照時(shí)間16h.cf1，溫度為25±1°C下培養(yǎng)；
[0018](2)繼代增殖培養(yǎng):將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種在增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖，得到繼代增殖的叢生芽；
[0019](3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離并接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)和壯苗，得到完整的組培苗；
[0020](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養(yǎng)I周，再全開蓋培養(yǎng)I周；將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，栽入由蛭石和營養(yǎng)土按1:1的比例混合成的培養(yǎng)基質(zhì)中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養(yǎng)期間注意保持生長環(huán)境濕度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ;
[0021]其中，步驟(I)中啟動(dòng)培養(yǎng)基為1.0mg/L 6_BA、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基或0.5mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基或 0.2mg/L 6-ΒΑ、0.0lmg/L IBA 和 8g/L 瓊脂的 pH 為 5.8 的 MS 培養(yǎng)基；
[0022]其中，步驟(2)中增殖培養(yǎng)基為1.0mg/L 6_BA、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基；
[0023]其中，步驟(3)中培養(yǎng)基為0.lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的1/2MS培養(yǎng)基;
[0024]其中，步驟(I)、步驟⑵與步驟(3)中培養(yǎng)基均加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH5.8，培養(yǎng)溫度為(25±1)°C，光照時(shí)間16h.cf1，光照30001ux。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明利用組織培養(yǎng)方法得到完整的北纈草組培苗，其具有成本低、繁殖速度快的特點(diǎn)。發(fā)明中所用培養(yǎng)器皿均為塑料或玻璃制品，可重復(fù)回收利用，衛(wèi)生環(huán)保；發(fā)明成本低，僅用MS培養(yǎng)基及植物激素即可；北纈草不定芽誘導(dǎo)僅用2周，繼代增殖速度快，4周即可獲得叢生芽，增殖3倍，生根培養(yǎng)容易，僅用2周即可得到粗壯的根系；發(fā)明體系穩(wěn)定，不定芽誘導(dǎo)率高，苗成活率高。同時(shí)本發(fā)明的方法不占用耕地，不受自然條件的限制和約束，易規(guī)?；?。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1所示為北纈草外植體照片。
[0027]圖2所示為北纈草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后照片。
[0028]圖3所示為北纈草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后照片。
[0029]圖4所示為北纈草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后照片。
[0030]圖5所示為北纈草不定芽繼代增殖培養(yǎng)4周后照片。
[0031]圖6所示為北纈草芽生根培養(yǎng)2周后照片。
[0032]圖7所示為北纈草組培苗半開蓋培養(yǎng)照片。
[0033]圖8所示為北纈草組培苗全開蓋培養(yǎng)照片。
[0034]圖9所示為北纈草組培苗移栽培養(yǎng)4周后照片。
[0035]圖10所示為北纈草組織培養(yǎng)情況。

【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而并非對(duì)發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所做出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037]實(shí)施例1
[0038]1.材料:
[0039]試驗(yàn)材料即組織培養(yǎng)外植體為北纈草植株幼嫩的莖段。
[0040]2.實(shí)驗(yàn)步驟:
[0041](I)外植體誘導(dǎo):將幼嫩的莖段用自來水沖洗20min,用70%乙醇消毒Imin,用
I%次氯酸鈉溶液消毒15min后取出，用無菌水沖洗4次，接種于1.0mg/L 6_BA、0.02mg/LIBA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基均加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH 5.8，培養(yǎng)溫度為25°C，光照時(shí)間 16h.(Γ1,光照 30001ux ；
[0042](2)繼代增殖培養(yǎng):將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種于1.0mg/L6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，得到繼代增殖的叢生芽，培養(yǎng)基加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH 5.8，培養(yǎng)溫度為25°C，光照時(shí)間16h.d \ 光照 30001ux ；
[0043](3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離并接種至0.0lmg/L IBA的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)和壯苗，培養(yǎng)基加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH 5.8，培養(yǎng)溫度為25°C，光照時(shí)間16h.cf1，光照30001ux，得到完整的組培苗；
[0044](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養(yǎng)I周，再全開蓋培養(yǎng)I周；將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，栽入由蛭石和營養(yǎng)土按1:1的比例混合成的培養(yǎng)基質(zhì)中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養(yǎng)期間注意保持生長環(huán)境濕度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ;
[0045]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0046](I)外植體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0047]以莖段為外植體(圖1)，在1.0mg/L 6_ΒΑ、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周后，組織開始膨脹，狀態(tài)良好，出現(xiàn)芽分化跡象；培養(yǎng)2周后(圖2)，就有小芽從生長點(diǎn)長出，生長狀態(tài)良好，生長旺盛，每段外植體可以長2個(gè)不定芽；培養(yǎng)3周后，芽可生長至lcm(圖3);培養(yǎng)4周后,芽已生長至3-4cm(圖4)。
[0048]上述結(jié)果表明利用北纈草外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率高，培養(yǎng)時(shí)間短，不定芽生長狀態(tài)良好，具有很好的可行性。
[0049](2)繼代增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0050]在1.0mg/L 6-ΒΑ,Ο.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基中，不定芽生長狀況良好，培養(yǎng)I周后，小芽明顯增大；培養(yǎng)2周后，就有小芽從生長點(diǎn)長出；培養(yǎng)4周后即可得到生長旺盛的叢生芽(圖5)，增殖倍數(shù)為3倍。
[0051 ] 上述結(jié)果表明，利用北纈草不定芽進(jìn)行繼代增殖，增殖速度快，僅4周可增殖3倍，不定芽狀態(tài)保持良好，體系穩(wěn)定，具有良好的可行性。
[0052](3)生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0053]在0.0lmg/L IBA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周后就有根長出，培養(yǎng)2周后(圖7)根長度可達(dá)3cm，且生長旺盛。
[0054]上述結(jié)果表明，利用北纈草不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)，生根速度快，僅2周即可獲得粗壯的根系，體系穩(wěn)定，具有良好的可行性。
[0055]實(shí)施例2
[0056]1.材料:
[0057]試驗(yàn)材料即組織培養(yǎng)外植體為北纈草植株幼嫩的莖段。
[0058]2.實(shí)驗(yàn)步驟:
[0059](I)外植體誘導(dǎo):將幼嫩的莖段用自來水沖洗15min，用60%乙醇消毒30s，用
0.5%次氯酸鈉溶液消毒1min后取出，用無菌水沖洗3次，接種于0.5mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基均加入2%蔗糖、0.5%瓊脂，pH 5.0，培養(yǎng)溫度為20°C，光照時(shí)間12h.cf1，光照25001ux ；
[0060](2)繼代增殖培養(yǎng):將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種于0.5mg/L6-BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，得到繼代增殖的叢生芽，培養(yǎng)基均加入2%蔗糖、0.5%瓊脂，pH 5.0，培養(yǎng)溫度為20°C，光照時(shí)間12h.cf1，光照 2500Iux ；
[0061](3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離并接種至0.0lmg/L IBA的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)和壯苗，培養(yǎng)基均加入2%蔗糖、0.5%瓊脂，pH 5.0，培養(yǎng)溫度為20°C，光照時(shí)間12h.cf1，光照25001ux，得到完整的組培苗；
[0062](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養(yǎng)5天，再全開蓋培養(yǎng)5天；將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，栽入由蛭石和營養(yǎng)土按1:1的比例混合成的培養(yǎng)基質(zhì)中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養(yǎng)期間注意保持生長環(huán)境濕度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ;
[0063]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0064](I)外植體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0065]以莖段為外植體，在0.5mg/L6-BA、0.0lmg/LIBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周后，組織開始膨脹，狀態(tài)良好，出現(xiàn)芽分化跡象；培養(yǎng)2周后，就有小芽從生長點(diǎn)長出，生長狀態(tài)良好，生長旺盛，每段外植體可以長2個(gè)不定芽；培養(yǎng)3周后，芽可生長至Icm ;培養(yǎng)4周后,芽已生長至3_4cm。
[0066]上述結(jié)果表明利用北纈草外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率高，培養(yǎng)時(shí)間短，不定芽生長狀態(tài)良好，具有很好的可行性。
[0067](2)繼代增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0068]在0.5mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基中，不定芽生長狀況良好，培養(yǎng)I周后，小芽明顯增大；培養(yǎng)2周后，就有小芽從生長點(diǎn)長出；培養(yǎng)4周后即可得到生長旺盛的叢生芽，增殖倍數(shù)為3倍。
[0069]上述結(jié)果表明，利用北纈草不定芽進(jìn)行繼代增殖，增殖速度快，僅4周可增殖3倍，不定芽狀態(tài)保持良好，體系穩(wěn)定，具有良好的可行性。
[0070](3)生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0071]在0.0lmg/L IBA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周后就有根長出，培養(yǎng)2周后根長度可達(dá)3cm,且生長旺盛。
[0072]上述結(jié)果表明，利用北纈草不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)，生根速度快，僅2周即可獲得粗壯的根系，體系穩(wěn)定，具有良好的可行性。
[0073]實(shí)施例3
[0074]1.材料:
[0075]試驗(yàn)材料即組織培養(yǎng)外植體為北纈草植株幼嫩的莖段。
[0076]2.實(shí)驗(yàn)步驟:
[0077](I)外植體誘導(dǎo):將幼嫩的莖段用自來水沖洗25min，用80%乙醇消毒90s，用
1.5%次氯酸鈉溶液消毒20min后取出，用無菌水沖洗5次，接種于0.2mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基均加入5%蔗糖、2%瓊脂，pH 6，培養(yǎng)溫度為30°C，光照時(shí)間 20h.cf1，光照 4000Iux ；
[0078](2)繼代增殖培養(yǎng):將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種于0.2mg/L6-BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，得到繼代增殖的叢生芽，培養(yǎng)基均加入5 %蔗糖、2 %瓊脂，pH 6，培養(yǎng)溫度為300C，光照時(shí)間20h.cf1，光照 4000Iux ；
[0079](3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離并接種至0.5mg/L IBA的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)和壯苗，培養(yǎng)基均加入5%蔗糖、2%瓊脂，pH 6，培養(yǎng)溫度為30°C，光照時(shí)間20h.cf1，光照40001ux，得到完整的組培苗；
[0080](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養(yǎng)10天，再全開蓋培養(yǎng)10天；將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，栽入由蛭石和營養(yǎng)土按1: 3的比例混合成的培養(yǎng)基質(zhì)中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養(yǎng)期間注意保持生長環(huán)境濕度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ;
[0081]3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0082](I)外植體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0083]以莖段為外植體，在0.2mg/L 6-ΒΑ,Ο.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為8的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)I周后，組織開始膨脹，狀態(tài)良好，出現(xiàn)芽分化跡象；培養(yǎng)2周后，就有小芽從生長點(diǎn)長出，生長狀態(tài)良好，生長旺盛，每段外植體可以長2個(gè)不定芽；培養(yǎng)3周后，芽可生長至Icm ;培養(yǎng)4周后,芽已生長至3_4cm。
[0084]上述結(jié)果表明利用北纈草外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率高，培養(yǎng)時(shí)間短，不定芽生長狀態(tài)良好，具有很好的可行性。
[0085](2)繼代增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0086]在0.2mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基中，不定芽生長狀況良好，培養(yǎng)I周后，小芽明顯增大；培養(yǎng)2周后，就有小芽從生長點(diǎn)長出；培養(yǎng)4周后即可得到生長旺盛的叢生芽，增殖倍數(shù)為3倍。
[0087]上述結(jié)果表明，利用北纈草不定芽進(jìn)行繼代增殖，增殖速度快，僅4周可增殖3倍，不定芽狀態(tài)保持良好，體系穩(wěn)定，具有良好的可行性。
[0088](3)生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0089]在0.5mg/L IBA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后就有根長出，培養(yǎng)4周后根長度可達(dá)4cm,且生長旺盛。
[0090]上述結(jié)果表明，利用北纈草不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)，生根速度快，僅4周即可獲得粗壯的根系，體系穩(wěn)定，具有良好的可行性。
【權(quán)利要求】
1.一種北繳草(Valeriana fauriei Briq.)組織培養(yǎng)繁殖方法,其特征在于,包括以下步驟: (1)外植體誘導(dǎo):取北纈草幼嫩的莖段作為外植體，進(jìn)行無菌處理，接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基培養(yǎng)至獲得不定芽； (2)繼代增殖培養(yǎng):將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖； (3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所得不定芽在無菌條件下分離并接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)和壯苗，得到完整的組培苗； (4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養(yǎng)5?10天，再全開蓋培養(yǎng)5?10天；將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，栽入由蛭石和營養(yǎng)土按1:1?1:3的比例混合成的培養(yǎng)基質(zhì)中煉苗培育成健壯的幼苗； 其中，步驟(I)中啟動(dòng)培養(yǎng)基為0.2?1.0mg/L 6-ΒΑ、0.01?0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基； 其中，步驟(2)中增殖培養(yǎng)基為0.2?1.0mg/L 6_ΒΑ、0.01?0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基； 其中，步驟⑶中培養(yǎng)基為0.1?0.5mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的1/2MS培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述北纈草組織培養(yǎng)繁殖的方法，其特征在于步驟(I)所述對(duì)外植體進(jìn)行除菌處理的方法為:用自來水沖洗15?25min,用60?80%乙醇消毒30?90s,用.0.5?1.5%次氯酸鈉溶液消毒10?20min后取出，用無菌水沖洗3?5次,用滅菌后的濾紙吸干表面水分，得到無菌北纈草外植體。
3.如權(quán)利要求1所述北纈草的組織培養(yǎng)繁殖的方法，其特征在于步驟(I)、步驟(2)與步驟⑶中培養(yǎng)條件'2?5%蔗糖、0.5?2%瓊脂，pH5?6，培養(yǎng)溫度為20?30°C，光照時(shí)間 12 ?20h.cf1，光照 2500 ?40001ux。
4.如權(quán)利要求1所述培養(yǎng)條件，其特征在于:3?4%蔗糖、0.5?1%瓊脂，pH5.5?.6，培養(yǎng)溫度為24?26°C，光照時(shí)間15?18h.cf1，光照30001ux。
5.如權(quán)利要求1所述北纈草組織培養(yǎng)繁殖的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體誘導(dǎo):將幼嫩的莖段用自來水沖洗20min，用70%乙醇消毒lmin，用1%次氯酸鈉溶液消毒15min后取出，用無菌水沖洗4次，接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于光照.30001ux，光照時(shí)間16h.d-1，溫度為25±1°C下培養(yǎng)； (2)繼代增殖培養(yǎng):將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種在增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，得到繼代增殖的叢生芽； (3)生根培養(yǎng):將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離并接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)和壯苗，得到完整的組培苗； (4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養(yǎng)I周，再全開蓋培養(yǎng)I周；將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，栽入由蛭石和營養(yǎng)土按I: I的比例混合成的培養(yǎng)基質(zhì)中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養(yǎng)期間注意保持生長環(huán)境濕度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ; 其中，步驟(I)中啟動(dòng)培養(yǎng)基為1.0mg/L 6-ΒΑ,Ο.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為.5.8的MS培養(yǎng)基或0.5mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基或.0.2mg/L 6-ΒΑ、0.0lmg/L IBA 和 8g/L 瓊脂的 pH 為 5.8 的 MS 培養(yǎng)基； 其中，步驟(2)中增殖培養(yǎng)基為1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養(yǎng)基； 其中，步驟⑶中培養(yǎng)基為0.lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的1/2MS培養(yǎng)基；其中，步驟(I)、步驟(2)與步驟(3)中培養(yǎng)基均加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH 5.8，培養(yǎng)溫度為(25±1)°C，光照時(shí)間16h.cf1，光照30001uX。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104304004SQ201410482874
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】張鑫, 宋經(jīng)元, 辛天怡, 陳士林 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所