本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種懷集報(bào)春苣苔組織培養(yǎng)和快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
懷集報(bào)春苣苔(Primulina huaijiensis Z.L.Ning&J.Wang)，是苦苣苔科報(bào)春苣苔屬多年生草本，于2010年發(fā)現(xiàn)于廣東省懷集縣一個(gè)孤立喀斯特小石灰山洞穴內(nèi)，2013年正式命名為懷集報(bào)春苣苔發(fā)表。懷集報(bào)春苣苔目前僅有一個(gè)野生分布居群，約200株，位于懷集縣一個(gè)村莊附近。因其數(shù)量稀少，生境極易受到人為干擾破壞，屬珍稀瀕危植物；另外，其花冠上唇裂片具有2膜狀附屬物結(jié)構(gòu)，是目前苦苣苔科植物中唯一具有這一形態(tài)特征的物種，該種對(duì)于開(kāi)展報(bào)春苣苔屬植物分類(lèi)學(xué)、喀斯特特殊生境植物的起源演化等方面的研究具有重要意義。同時(shí)，懷集報(bào)春苣苔株型緊湊，葉形優(yōu)美，葉片肉質(zhì)并有銀白色脈紋，具有較高的觀(guān)賞價(jià)值和獨(dú)特的耐蔭性，適合作室內(nèi)盆栽觀(guān)賞，極有開(kāi)發(fā)利用前景。
懷集報(bào)春苣苔自然條件下不結(jié)實(shí)，需昆蟲(chóng)或人工授粉，種子發(fā)芽率較低；而扦插繁殖速度慢，繁殖系數(shù)低，也會(huì)破壞極其珍貴的野生資源。
目前，國(guó)內(nèi)外尚未有懷集報(bào)春苣苔的組織培養(yǎng)和種苗繁殖的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種懷集報(bào)春苣苔組織培養(yǎng)和快速繁殖方法。
本發(fā)明的懷集報(bào)春苣苔組織培養(yǎng)和快速繁殖方法，包括以下步驟：
a.外植體的消毒和初代誘導(dǎo)培養(yǎng)：取懷集報(bào)春苣苔葉片為外植體，清洗消毒后，將葉片切成0.5～1.0cm×1.0～2.0cm小塊，接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的形成，得到萌發(fā)幼芽的愈傷組織；所述的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 0.5～1.5mg、NAA 0.05～0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5；
b.芽的誘導(dǎo)和繼代增殖：將萌發(fā)幼芽的愈傷組織切割成只帶3～4個(gè)芽的小塊，接種于增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽的形成，得到繼代培養(yǎng)苗；所述的增殖培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 0.1～0.5mg、NAA 0.05～0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5；
c.壯苗和生根培養(yǎng)：待繼代培養(yǎng)苗長(zhǎng)到3～4個(gè)葉片時(shí)，將繼代培養(yǎng)苗切分出來(lái)接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)壯苗，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到生根苗；所述的壯苗培養(yǎng)基為：每升含有活性炭0～2g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5；所述的生根培養(yǎng)基為：每升含有NAA 0.1～0.5mg、活性炭0～2g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH為6.5；
d.試管苗移栽：當(dāng)生根苗長(zhǎng)至7-8片葉子時(shí)，進(jìn)行煉苗，然后洗掉生根苗根部培養(yǎng)基，栽入移栽基質(zhì)中，置于遮陰、濕潤(rùn)的環(huán)境下培養(yǎng)；所述的移栽基質(zhì)是將泥炭土和珍珠巖按體積比2:1混合均勻得到的；
所述的步驟a、b和c的培養(yǎng)條件均為：溫度25±2℃、光照強(qiáng)度1500lx、光照時(shí)間12h/d。
所述的步驟a的清洗消毒，是將葉片用洗潔精漂洗20min，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇溶液浸泡30s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％HgCl2溶液消毒4～5min，用無(wú)菌水漂洗5～6次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。
所述的步驟d的煉苗，是把蓋有瓶塞的培養(yǎng)瓶中的生根苗放置于陰棚里培養(yǎng)2-3d，然后打開(kāi)瓶塞又繼續(xù)培養(yǎng)3-4d。
優(yōu)選，所述的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
優(yōu)選，所述的增殖培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
優(yōu)選，所述的生根培養(yǎng)基為：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
所述的MS培養(yǎng)基為國(guó)際通用的培養(yǎng)基，其成份和配置方法可參考書(shū)籍(譚文澄、戴策剛主編.觀(guān)賞植物組織培養(yǎng)技術(shù).北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1991.)，所述的1/2MS是將MS中的大量元素濃度減半，而其他成分濃度不變而形成的培養(yǎng)基。
本發(fā)明以懷集報(bào)春苣苔肥嫩葉片為外植體，在不定芽的誘導(dǎo)、叢生芽繁殖、壯苗生根和移栽等各階段，選擇適合懷集報(bào)春苣苔叢生芽誘導(dǎo)、繁殖、生根、移栽等各培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)懷集報(bào)春苣苔種苗的組織培養(yǎng)和快速繁殖，可在較短時(shí)間內(nèi)繁育出大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，為滿(mǎn)足該物種的遷地保育與引種回歸研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供優(yōu)質(zhì)種苗，實(shí)現(xiàn)懷集報(bào)春苣苔的資源保護(hù)和可持續(xù)利用。
本發(fā)明能成功地進(jìn)行懷集報(bào)春苣苔組織培養(yǎng)和快速繁殖，此發(fā)明生產(chǎn)出的懷集報(bào)春苣苔種苗具有遺傳穩(wěn)定性高，出苗快，苗壯，種苗品質(zhì)好、抗性強(qiáng)、生長(zhǎng)良好等特點(diǎn)。本發(fā)明方法投入少，產(chǎn)出高等優(yōu)勢(shì)，是利用植物組織細(xì)胞的全能性和植物組織培養(yǎng)等生物技術(shù)進(jìn)行喀斯特特殊生境植物優(yōu)質(zhì)種苗的快速繁殖，具有操作簡(jiǎn)單實(shí)惠，切實(shí)可行，應(yīng)用價(jià)值高等特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1：
1.外植體的消毒和初代誘導(dǎo)培養(yǎng)：在生長(zhǎng)季節(jié)剪取懷集報(bào)春苣苔肥厚的嫩葉片為外植體，用洗潔精漂洗20min，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇溶液浸泡30s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％HgCl2溶液消毒4min，用無(wú)菌水漂洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，將葉片切成1.0cm×2.0cm小塊，接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。培養(yǎng)30d左右切塊周?chē)_(kāi)始長(zhǎng)愈傷組織并有少許芽萌發(fā)。繼續(xù)培養(yǎng)38d左右愈傷組織上萌發(fā)很多幼芽。消毒成功率85％。所述的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 0.5mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
2.芽的誘導(dǎo)和繼代增殖：將大量萌發(fā)幼芽的愈傷組織切割成只帶3～4個(gè)芽的小塊，接種于增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能促使叢生芽的形成，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。繼代周期為35d，增殖系數(shù)為3.8，由此得到繼代培養(yǎng)苗。所述的增殖培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 0.1mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
3.壯苗和生根培養(yǎng)：待繼代培養(yǎng)苗長(zhǎng)到3～4個(gè)葉片時(shí)，將幼苗切分出來(lái)接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)40d，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d；培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。幼苗生長(zhǎng)健壯，產(chǎn)生大量根，生根率高達(dá)97％，由此得到生根苗。所述的壯苗培養(yǎng)基為：每升含有活性炭2.0g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。所述的生根培養(yǎng)基為：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2.0g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
4.試管苗移栽：當(dāng)生根苗長(zhǎng)至7-8片葉子時(shí)，把蓋有瓶塞的培養(yǎng)瓶中的生根苗放置于陰棚里2-3d，然后打開(kāi)瓶塞又繼續(xù)放3-4d后，用鑷子把生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入泥炭土:珍珠巖＝2：1(v/v)的基質(zhì)中，注意澆水、遮蔭、保溫和保濕，成活率可達(dá)92％。
實(shí)施例2：
1.外植體的消毒和初代誘導(dǎo)培養(yǎng)：在生長(zhǎng)季節(jié)剪取懷集報(bào)春苣苔肥厚的嫩葉片為外植體，用洗潔精漂洗20min，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇溶液浸泡30s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％HgCl2溶液消毒5min，用無(wú)菌水漂洗6次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，將葉片切成0.5cm×1.0cm小塊，接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。培養(yǎng)19d左右切塊周?chē)_(kāi)始長(zhǎng)愈傷組織并有少許芽萌發(fā)。繼續(xù)培養(yǎng)27d左右愈傷組織上萌發(fā)大量幼芽。消毒成功率85％。所述的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
2.芽的誘導(dǎo)和繼代增殖：將大量萌發(fā)幼芽的愈傷組織切割成只帶3～4個(gè)芽的小塊，接種于增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能促使叢生芽的形成，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。繼代周期為35d，增殖系數(shù)為6，由此得到繼代培養(yǎng)苗。所述的增殖培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
3.壯苗和生根培養(yǎng)：待繼代培養(yǎng)苗長(zhǎng)到3～4個(gè)葉片時(shí)，將幼苗切分出來(lái)接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)40d，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d；培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。幼苗生長(zhǎng)健壯，產(chǎn)生大量根，生根率達(dá)94％，由此得到生根苗。所述的壯苗培養(yǎng)基為：每升含有活性炭2.0g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。所述的生根培養(yǎng)基為：每升含有NAA 0.5mg、活性炭2.0g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
4.試管苗移栽：當(dāng)生根苗長(zhǎng)至7-8片葉子時(shí)，把蓋有瓶塞的培養(yǎng)瓶中的生根苗放置于陰棚里2-3d，然后打開(kāi)瓶塞又繼續(xù)放3-4d后，用鑷子把生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入泥炭土:珍珠巖＝2：1(v/v)的基質(zhì)中，注意澆水、遮蔭、保溫和保濕，成活率可達(dá)92％。
實(shí)施例3：
1.外植體的消毒和初代誘導(dǎo)培養(yǎng)：在生長(zhǎng)季節(jié)剪取懷集報(bào)春苣苔肥厚的嫩葉片為外植體，用洗潔精漂洗20min，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇溶液浸泡30s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％HgCl2溶液消毒4min，用無(wú)菌水漂洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，將葉片切成1.0cm×2.0cm小塊，接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。培養(yǎng)22d左右切塊周?chē)_(kāi)始長(zhǎng)愈傷組織并有少許芽萌發(fā)。繼續(xù)培養(yǎng)30d左右愈傷組織上萌發(fā)很多細(xì)小幼芽。消毒成功率85％。所述的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基：每升含有6-BA 1.5mg、NAA 0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
2.芽的誘導(dǎo)和繼代增殖：將大量萌發(fā)幼芽的愈傷組織切割成只帶3～4個(gè)芽的小塊，接種于增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能促使叢生芽的形成，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。繼代周期為35d,增殖系數(shù)為3.1，由此得到繼代培養(yǎng)苗。所述的增殖培養(yǎng)基：每升含有6-BA 0.5mg、NAA 0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
3.壯苗和生根培養(yǎng)：待繼代培養(yǎng)苗長(zhǎng)到3～4個(gè)葉片時(shí)，將幼苗切分出來(lái)接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)40d，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d；培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500lx，光照時(shí)間12h/d。幼苗生長(zhǎng)弱小，產(chǎn)生大量根，生根率達(dá)91％，由此得到生根苗。所述的壯苗培養(yǎng)基為：每升含有蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5。所述的生根培養(yǎng)基為：每升含有NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH為6.5。
4.試管苗移栽：當(dāng)生根苗長(zhǎng)至7-8片葉子時(shí)，把蓋有瓶塞的培養(yǎng)瓶中的生根苗放置于陰棚里2-3d，然后打開(kāi)瓶塞又繼續(xù)放3-4d后，用鑷子把生根苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入泥炭土:珍珠巖＝2：1(v/v)的基質(zhì)中，注意澆水、遮蔭、保溫和保濕，成活率可達(dá)92％。
以上的三個(gè)實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)較好的懷集報(bào)春苣苔組織培養(yǎng)和快速繁殖效果。通過(guò)以上三個(gè)實(shí)施例可以得出，懷集報(bào)春苣苔外植體最適的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5；最適的增殖培養(yǎng)基為：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養(yǎng)基，pH為6.5；最適的生根培養(yǎng)基為：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養(yǎng)基，pH為6.5；其中活性炭對(duì)于壯苗和生根起到很大作用。