技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種苗繁育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種山苦瓜的組培快繁方法。
背景技術(shù)：
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山苦瓜(momordicacharantiavar)又名土瓜、苦瓜蓮，葫蘆科山苦瓜屬多年生宿根草質(zhì)藤本，喜溫怕寒。山苦瓜的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子均可供藥用，性寒味苦，入心脾胃三經(jīng)，清暑解熱，明目解毒。研究證實(shí)其果實(shí)中富含豐富的苦瓜甙、苦瓜素，能夠明顯降低血糖濃度，對(duì)健康非常有益，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。
山苦瓜的繁殖方式常采用種子繁殖，繁育速度較慢，另外，其單果含種量?jī)H有10余粒，難以在短期內(nèi)獲得大量種苗，嚴(yán)重制約了優(yōu)良品種的推廣速度。因此研究山苦瓜的離體快繁方法，進(jìn)一步提高山苦瓜的開(kāi)發(fā)、利用價(jià)值，對(duì)其大規(guī)模生產(chǎn)和新優(yōu)品種的快速推廣，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種山苦瓜組培快繁的技術(shù)，它包括以下幾個(gè)步驟：
1)外植體處理
山苦瓜的外植體選取主要以帶腋芽的莖段為主，帶腋芽莖段可以由無(wú)菌幼苗途徑或大田實(shí)生苗途徑獲得。
①無(wú)菌幼苗途徑：選取成熟飽滿的種子，用50-55℃的溫水?dāng)嚢?0min后浸種6-8h對(duì)種子進(jìn)行消毒處理。使用0.1％hgcl2消毒10-15min,無(wú)菌水沖洗3-5次后，剝?nèi)シN皮，胚根端朝下接種于ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃；光照強(qiáng)度2000-3000lux；連續(xù)光照培養(yǎng)10-12小時(shí)/天，7-10d后長(zhǎng)出兩片真葉且展葉后備用。
其中，0.1％的hgcl2需提前4小時(shí)配制，保證充分溶解，配制時(shí)取1ghgcl2粉劑溶于1l無(wú)菌水中，避光保存；hgcl2粉劑采購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。
②大田實(shí)生苗途徑：當(dāng)年采收的種子播種后獲得大田實(shí)生苗，選取生長(zhǎng)25-45天的帶腋芽的莖段作為外植體，剪成5-8cm小段，每段含有1-2個(gè)芽點(diǎn)，流水下沖洗10min-20min，再用0.1％hgcl2處理7-8min，無(wú)菌水振蕩沖洗3-5次,每次2-3min,消毒完成后備用；
2)腋芽誘導(dǎo)
將步驟1)所得的外植體切取3-5cm大小的莖段，確保每段含有1-2個(gè)腋芽，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每30-50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種1-2個(gè)外植體，5-7天后即可誘導(dǎo)出腋芽。培養(yǎng)溫度28-30℃；光照強(qiáng)度2000-3000lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)10-12小時(shí)/天。
其中，改良基本培養(yǎng)基為：硝酸銨1650mg/l，硝酸鉀1900mg/l，七水硫酸鎂370mg/l，磷酸二氫鉀170mg/l，二水氯化鈣440mg/l，寶力健0.5-1.0g/l，蔗糖20-30g/l，瓊脂6.0-6.3g/l，用蒸餾水按常規(guī)方法配制培養(yǎng)基，用1mol/l的naoh或hcl調(diào)節(jié)ph到5.8-6.2。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基中加入0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成
“寶力健”為一種新型有機(jī)微量元素添加劑，可以代替ms配方中的微量、有機(jī)、鐵鹽等，使效果更加突出，采購(gòu)于北京康倍斯科技有限公司。
3)增殖培養(yǎng)
將步驟2)所誘導(dǎo)出的腋芽轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上，每50ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接5個(gè)腋芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度2000-3000lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)10-12小時(shí)/天。培養(yǎng)12-17天，待增殖系數(shù)達(dá)到4.0-5.0獲得分化苗叢生芽。
其中，增殖培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基添加0.2-0.5mg的6-ba和0.02-0.05mg的iba組成；
增殖系數(shù)為增殖后芽數(shù)與增殖前芽數(shù)的比值。
4)生根培養(yǎng)
將步驟3)所得的分化苗叢生芽分單株，每株切取大小3-5cm，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每50ml培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接5株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度2000-3000lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)10-12小時(shí)/天，7-10天后待生根苗株高至5-7cm，主根5條以上，健壯有活力，即可進(jìn)行馴化移栽；
其中，生根培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基添加0.1-0.2mg的naa組成。
本發(fā)明采用組織培養(yǎng)的方法，通過(guò)不同外植體選取與處理、誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)，獲得優(yōu)質(zhì)的山苦瓜快繁苗。使用本發(fā)明方法快繁山苦瓜的有益效果為：第一，可以明顯促進(jìn)植株茁壯生長(zhǎng)、提高繼代次數(shù)，緩解普通組織培養(yǎng)過(guò)程中組培苗玻璃化、黃化等問(wèn)題；第二，避免普通山苦瓜繁殖過(guò)程中病毒侵害問(wèn)題，提高山苦瓜繁殖品質(zhì)；第三，本發(fā)明方法可以選擇性的快速大量繁殖優(yōu)質(zhì)山苦瓜品種，解決優(yōu)質(zhì)品種少，繁殖困難和繁殖周期長(zhǎng)的問(wèn)題，促進(jìn)山苦瓜的開(kāi)發(fā)、利用研究的進(jìn)展，以滿足其大規(guī)模生產(chǎn)和新優(yōu)品種快速推廣的需求。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍，除特殊說(shuō)明外，下述實(shí)施例中均采用常規(guī)現(xiàn)有技術(shù)完成。
實(shí)施例1
所述的山苦瓜組培快繁技術(shù)，具體步驟如下：
首先，選取成熟飽滿的種子，用50℃的溫水?dāng)嚢?0min后浸種6h后對(duì)種子進(jìn)行消毒處理。使用0.1％hgcl2消毒10min,無(wú)菌水沖洗5次后，剝?nèi)シN皮，胚根端朝下接種于ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃；光照強(qiáng)度2000lux；連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)10小時(shí)/天，7天后長(zhǎng)出兩片真葉且展葉后備用。
第二：將已經(jīng)展葉的無(wú)菌播種獲得的外植體切取3cm大小的莖段，每段含有1個(gè)腋芽，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每30ml培養(yǎng)基接種1個(gè)外植體，7天后誘導(dǎo)出腋芽。
其中，改良基本培養(yǎng)基為：硝酸銨1650mg/l，硝酸鉀1900mg/l，七水硫酸鎂370mg/l，磷酸二氫鉀170mg/l，二水氯化鈣440mg/l，寶力健0.5g/l，蔗糖20g/l，瓊脂6.0g/l，用蒸餾水按常規(guī)方法配制培養(yǎng)基，用1mol/l的naoh或hcl調(diào)節(jié)ph到5.8。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基中加入0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成。
第三：將誘導(dǎo)出的腋芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上，每50ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接5個(gè)腋芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度2000lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)10小時(shí)/天，17天增殖系數(shù)即可達(dá)到4.1，獲得分化苗叢生芽。
其中，增殖培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基添加0.2mg的6-ba和0.02mg的iba組成；
增殖系數(shù)為增殖后芽數(shù)與增殖前芽數(shù)的比值。
第四：將分化苗叢生芽分單株，每株切取3cm大小轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基，每50ml培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接5株進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度2000lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)10小時(shí)/天，10天后平均株高5.4cm，生根8條并且健壯有活力，此時(shí)可進(jìn)行馴化移栽；
其中，生根培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基添加0.1mg的naa組成；
實(shí)施例1中，在對(duì)山苦瓜組培過(guò)程中，無(wú)菌播種出芽率100％，腋芽誘導(dǎo)率達(dá)97％，增殖系數(shù)為3.7，生根率100％，馴化成活率90％。
實(shí)施例1中的改良基本培養(yǎng)基，與ms作為基本培養(yǎng)基組培快繁過(guò)程中生長(zhǎng)指標(biāo)差異如表1。
表1、以ms、改良基本培養(yǎng)基培養(yǎng)差異情況表
注：生長(zhǎng)勢(shì)分三個(gè)等級(jí)，a：葉色濃綠，葉片厚實(shí)，根莖粗壯；b：葉色翠綠，葉片較厚實(shí)，根莖較粗壯；c：葉色黃綠，葉片薄，根莖細(xì)弱
實(shí)施例2
所述的山苦瓜組培快繁技術(shù)，具體步驟如下：
首先，選取成熟飽滿的種子，用55℃的溫水?dāng)嚢?0min后浸種8h后對(duì)種子進(jìn)行消毒處理。使用0.1％hgcl2消毒15,無(wú)菌水沖洗5次后，剝?nèi)シN皮，胚根端朝下接種于ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃；光照強(qiáng)度2500lux，連續(xù)光照培養(yǎng)11小時(shí)/天，8天后展出兩片真葉。
第二：將已經(jīng)展葉的無(wú)菌播種獲得的外植體切取4cm大小的莖段，每段含有2個(gè)腋芽，接入改良基本培養(yǎng)基，每40ml培養(yǎng)基接種2個(gè)外植體，6天后誘導(dǎo)出腋芽。
其中，改良基本培養(yǎng)基為：硝酸銨1650mg/l，硝酸鉀1900mg/l，七水硫酸鎂370mg/l，磷酸二氫鉀170mg/l，二水氯化鈣440mg/l，寶力健0.8g/l，蔗糖25g/l，瓊脂6.2g/l，用蒸餾水按常規(guī)方法配制培養(yǎng)基，用1mol/l的naoh或hcl調(diào)節(jié)ph到6.0。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基中加入0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成。
第三：將誘導(dǎo)出的腋芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上，每50ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接5個(gè)腋芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度2500lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)11小時(shí)/天，15天增殖系數(shù)即可達(dá)到4.4；
其中，增殖培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基添加0.4mg的6-ba和0.04mg的iba組成；
增殖系數(shù)為增殖后芽數(shù)與增殖前芽數(shù)的比值。
第四：將將分化苗叢生芽分單株，每株切取4cm大小轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基，每50ml培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接5株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度2500lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)11小時(shí)/天，8天后生根苗平均株高至6.5cm，主根7條，并且健壯有活力，可進(jìn)行馴化移栽；
其中，生根培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基添加0.15mg的naa組成；
實(shí)施例2中，在對(duì)山苦瓜組培過(guò)程中，無(wú)菌播種出芽率99％，腋芽誘導(dǎo)率達(dá)95％，增殖系數(shù)為4.4，生根率100％，馴化成活率90％。
實(shí)施例2中采用改良基本培養(yǎng)基，與ms作為基本培養(yǎng)基組培快繁過(guò)程中生長(zhǎng)指標(biāo)差異如表2。
表2、以ms、改良基本培養(yǎng)基培養(yǎng)差異情況表
注：生長(zhǎng)勢(shì)分三個(gè)等級(jí)，a：葉色濃綠，葉片厚實(shí)，根莖粗壯；b：葉色翠綠，葉片較厚實(shí)，根莖較粗壯；c：葉色黃綠，葉片薄，根莖細(xì)弱
實(shí)施例3
所述的山苦瓜組培快繁技術(shù)，具體步驟如下：
首先，選取溫室生長(zhǎng)35天的帶腋芽的莖段為外植體，剪成5-8cm小段，每段含有2個(gè)芽點(diǎn)，流水下沖洗20min，用0.1％hgcl2處理8min，無(wú)菌水振蕩沖洗5次，每次3min，空水后備用；
第二：將消毒好的莖段外植體切取5cm大小，每段含有2個(gè)腋芽，接入改良基本培養(yǎng)基，每50ml培養(yǎng)基接種2個(gè)外植體，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度3000lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)12小時(shí)/天，5天后誘導(dǎo)出腋芽。
其中，改良基本培養(yǎng)基為：硝酸銨1650mg/l，硝酸鉀1900mg/l，七水硫酸鎂370mg/l，磷酸二氫鉀170mg/l，二水氯化鈣440mg/l，寶力健1.0g/l，蔗糖30g/l，瓊脂6.3g/l，用蒸餾水按常規(guī)方法配制培養(yǎng)基，用1mol/l的naoh或hcl調(diào)節(jié)ph到6.2。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基中加入0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成。
第三：將誘導(dǎo)出的腋芽切下轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上，每50ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接5個(gè)腋芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度3000lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)11小時(shí)/天，14天增值系數(shù)達(dá)到4.7；
其中，增殖培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基添加0.5mg的6-ba和0.05mg的iba組成；
增殖系數(shù)為增殖后芽數(shù)與增殖前芽數(shù)的比值。
第四：將將分化苗叢生芽分單株，每株切取5cm大小，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基，每50ml培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接5株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-30℃，光照強(qiáng)度3000lux，連續(xù)光照時(shí)長(zhǎng)12小時(shí)/天，7天后生根苗平均株高至7cm，主根10條并且健壯有活力，可進(jìn)行馴化移栽；
其中，生根培養(yǎng)基為每升改良基本培養(yǎng)基添加0.2mg的naa組成；
實(shí)施例3中，在對(duì)山苦瓜組培過(guò)程中，莖段外植體消毒萌芽率40％，腋芽誘導(dǎo)率達(dá)99％，增殖系數(shù)為4.7，生根率100％，馴化成活率90％。
實(shí)施例3中采用改良基本培養(yǎng)基與ms作為基本培養(yǎng)基組培快繁過(guò)程中生長(zhǎng)指標(biāo)差異如表3。
表3、以ms、改良基本培養(yǎng)基培養(yǎng)差異情況表
注：生長(zhǎng)勢(shì)分三個(gè)等級(jí)，a：葉色濃綠，葉片厚實(shí)，根莖粗壯；b：葉色翠綠，葉片較厚實(shí)，根莖較粗壯；c：葉色黃綠，葉片薄，根莖細(xì)弱
通過(guò)實(shí)施例的具體數(shù)據(jù)對(duì)比得到結(jié)論為:本發(fā)明通過(guò)對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化，使得山苦瓜組培苗的黃化率、玻璃化比例顯著下降，生長(zhǎng)周期明顯縮短，生長(zhǎng)勢(shì)顯著提高，這對(duì)于山苦瓜優(yōu)良品種的開(kāi)發(fā)、利用與推廣提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。