本發(fā)明涉及基因技術(shù),尤其涉及一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù):
羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環(huán)三萜類物質(zhì),羅漢果甜苷v生物合成的前體物質(zhì)是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內(nèi)基焦磷酸(dmapp),二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成,mva途徑發(fā)生在胞質(zhì)中,mep途徑發(fā)生在質(zhì)體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經(jīng)牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp),ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進(jìn)而形成法呢基焦磷酸(fpp),然后經(jīng)角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環(huán)氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯,葫蘆二烯醇合酶(cs)進(jìn)一步催化形成葫蘆二烯醇,最后在cyp450酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)的作用下,形成羅漢果甜苷v。
異戊二烯類物質(zhì)的產(chǎn)生受到限速酶活性的嚴(yán)格調(diào)控,一直被認(rèn)為在其生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶,ugt基因的表達(dá)對羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達(dá)ugt基因,可以促進(jìn)羅漢果甜苷v的積累;相反,如果抑制ugt基因的表達(dá),羅漢果甜苷v的產(chǎn)量將顯著降低。現(xiàn)有技術(shù)中未見有促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
針對上述技術(shù)問題,本發(fā)明設(shè)計(jì)開發(fā)了一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法,包括:
步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng),其中,茉莉酸甲酯在固體培養(yǎng)基中的濃度為50-400μmol/l;
步驟二、栽培所述步驟一培養(yǎng)得到的羅漢果植株,在栽培期間,將濃度為50-400μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后20-30d的羅漢果表面,至表面滴水為止,早、中、晚各噴灑一次,連續(xù)噴施5d;并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時(shí),預(yù)先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃;每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前,先向羅漢果表面噴水霧,水霧溫度為10℃,每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后,再向羅漢果表面噴水霧,水霧溫度為15℃,之后通風(fēng)。
優(yōu)選的是,所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法中,所述步驟一中,所述培養(yǎng)條件為:相對濕度60-66%、光照強(qiáng)度1400lux,光照時(shí)間8h/d,溫度21-25℃條件下培養(yǎng)30d。
優(yōu)選的是,所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法中,所述的固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l,iba0.3mg/l,瓊脂3.5g/l,蔗糖30g/l,活性炭1.0g/l。
優(yōu)選的是,所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法中,所述步驟一中,所述含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基通過以下方式制備得到:用體積百分比濃度為2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯,配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液,并用0.22μm的微孔濾膜滅菌,將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中,至茉莉酸甲酯的最終濃度為50-400μmol/l,將固體培養(yǎng)基滅菌并冷卻至24-26℃。
優(yōu)選的是,所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法,還包括:
步驟三、利用qrt-pcr檢測所述步驟二栽培得到的羅漢果果實(shí)中的ugt84a21基因表達(dá)。
優(yōu)選的是,所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法中,所述步驟三中,采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna。
本發(fā)明通過在羅漢果組培苗和栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯,短期內(nèi)快速誘導(dǎo)羅漢果甜苷v生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因ugt84a21的高表達(dá),從而促進(jìn)羅漢果甜苷v含量的顯著提高。本發(fā)明操作簡便,成本低,對環(huán)境友好,適于規(guī)模化生產(chǎn),具有較強(qiáng)的實(shí)用性和推廣價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明,以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
實(shí)施例一
一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法,包括:
步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng),其中,茉莉酸甲酯在固體培養(yǎng)基中的濃度為50μmol/l。所述培養(yǎng)條件為:相對濕度60-66%、光照強(qiáng)度1400lux,光照時(shí)間8h/d,溫度21℃條件下培養(yǎng)30d。所述的固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l,iba0.3mg/l,瓊脂3.5g/l,蔗糖30g/l,活性炭1.0g/l。
所述含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基通過以下方式制備得到:用體積百分比濃度為2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯,配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液,并用0.22μm的微孔濾膜滅菌,將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中,至茉莉酸甲酯的最終濃度為50μmol/l,將固體培養(yǎng)基滅菌并冷卻至24-26℃。
步驟二、栽培所述步驟一培養(yǎng)得到的羅漢果植株,在栽培期間,將濃度為50μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后22d的羅漢果表面,至表面滴水為止,早、中、晚各噴灑一次,連續(xù)噴施5d;并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時(shí),預(yù)先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃;每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前,先向羅漢果表面噴水霧,水霧溫度為10℃,每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后,再向羅漢果表面噴水霧,水霧溫度為15℃,之后通風(fēng)。
步驟三、利用qrt-pcr檢測所述步驟二栽培得到的羅漢果果實(shí)中的ugt84a21基因表達(dá)。
先將羅漢果果實(shí)進(jìn)行處理,挑取果肉,切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好,立即置于液氮中速凍,保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna。
采用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。
將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應(yīng)體系為rna10.0μl,primescriptrtenzymemixi1.0μl,rtprimermix1.0μl,5×primescriptbuffer24.0μl,rnasefreedh2o4.0μl;反應(yīng)條件為37℃(15min)到85℃(5s),再到4℃。
采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中,ugt84a21引物序列為(fp:cgccatatgcaccaccaccaccaccacatggtaaaggaagttgcagatg(seqidno:1),rp:ccgagctctcaagaagtcgccgaacaatgg(seqidno:2)),內(nèi)參基因用ubq5,序列為(fp:ataaaagacccagcaccacattc(seqidno:3),rp:cccttgccgactacaacatcc(seqidno:4))。
qrt-pcr反應(yīng)體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl,pcrforwardprimer(10μm)0.8μl,pcrreverseprimer(10μm)0.8μl,roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl,template2.0μl,dh2o6.0μl。反應(yīng)條件為95℃(30s),接著進(jìn)行40個(gè)cycles[95℃(5s),95℃(34s)]。采用hplc法測定羅漢果甜苷v的含量。色譜條件為:色譜柱:dikmadiamomsil(tm)c18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-水(梯度0-40min;10%線性升至40%;40.01-45mm;回至10%);流速:1.0ml/min,檢測波長:203nm。供試品樣液的配制為:取羅漢果粉末2g,精密稱定,置于100ml具磨口塞錐形瓶中,精密加入甲醇25ml,搖勻,稱定重量。超聲處理1h,放冷,再稱定重量,并用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,以0.45μm的濾液微孔濾膜過濾即可。
對比例一
步驟一、將羅漢果組培苗接種不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng);步驟二、不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯;其他條件與實(shí)施例一一致。
qrt-pcr檢測結(jié)果顯示,在對比例一中,羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量為1,而在實(shí)施例一中,羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量高達(dá)10.8,較對比例一提高了980%,可見,實(shí)施例一可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt73af1基因的高表達(dá)。hplc檢測結(jié)果顯示,在對比例一中,羅漢果甜苷v含量為0.79%,而在實(shí)施例一中,羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.13%,較對比例一提高了169.62%,可見,實(shí)施例一還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。
實(shí)施例二
一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法,包括:
步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng),其中,茉莉酸甲酯在固體培養(yǎng)基中的濃度為200μmol/l。所述培養(yǎng)條件為:相對濕度60-66%、光照強(qiáng)度1400lux,光照時(shí)間8h/d,溫度25℃條件下培養(yǎng)30d。所述的固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l,iba0.3mg/l,瓊脂3.5g/l,蔗糖30g/l,活性炭1.0g/l。
步驟二、栽培所述步驟一培養(yǎng)得到的羅漢果植株,在栽培期間,將濃度為200μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后24d的羅漢果表面,至表面滴水為止,早、中、晚各噴灑一次,連續(xù)噴施5d;并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時(shí),預(yù)先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃;每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前,先向羅漢果表面噴水霧,水霧溫度為10℃,每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后,再向羅漢果表面噴水霧,水霧溫度為15℃,之后通風(fēng)。
其他條件均與實(shí)施例一一致。
對比例二
步驟一、將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng);步驟二、不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯;其他條件與實(shí)施例二一致。
qrt-pcr檢測結(jié)果顯示,在對比例二中,羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量為1,而在實(shí)施例二中,羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量高達(dá)17.9,較對比例二提高了1690%,可見,實(shí)施例二可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt73af1基因的高表達(dá)。hplc檢測結(jié)果顯示,在對比例二中,羅漢果甜苷v含量為0.78%,而在實(shí)施例二中,羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.24%,較對比例二提高了187.18%,可見,實(shí)施例二還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。
實(shí)施例三
一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法,包括:
步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng),其中,茉莉酸甲酯在固體培養(yǎng)基中的濃度為300μmol/l。所述培養(yǎng)條件為:相對濕度60-66%、光照強(qiáng)度1400lux,光照時(shí)間8h/d,溫度25℃條件下培養(yǎng)30d。所述的固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l,iba0.3mg/l,瓊脂3.5g/l,蔗糖30g/l,活性炭1.0g/l。
步驟二、栽培所述步驟一培養(yǎng)得到的羅漢果植株,在栽培期間,將濃度為300μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后28d的羅漢果表面,至表面滴水為止,早、中、晚各噴灑一次,連續(xù)噴施5d;并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時(shí),預(yù)先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃;每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前,先向羅漢果表面噴水霧,水霧溫度為10℃,每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后,再向羅漢果表面噴水霧,水霧溫度為15℃,之后通風(fēng)。
其他條件均與實(shí)施例一一致。
對比例三
步驟一、將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng);步驟二、不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯;其他條件與實(shí)施例三一致。
qrt-pcr檢測結(jié)果顯示,在對比例三中,羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量為1,而在實(shí)施例三中,羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量高達(dá)15.3,較對比例三提高了1430%,可見,實(shí)施例三可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt73af1基因的高表達(dá)。hplc檢測結(jié)果顯示,在對比例三中,羅漢果甜苷v含量為0.71%,而在實(shí)施例三中,羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.11%,較對比例三提高了197.18%,可見,實(shí)施例三還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。
盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上,但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用,它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域,對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言,可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改,因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下,本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)。
sequencelisting
<110>李華政
<120>促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法
<130>2016
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<170>patentinversion3.5
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