本發(fā)明涉及植物生物技術領域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種促進羅漢果cyp24基因表達的方法。
背景技術：
羅漢果是我國特有珍貴藥用和甜料植物，為葫蘆科(cucurbitaceae)羅漢果屬(siraitia)多年生藤本植物，具有止咳祛痰、涼血舒胃、潤腸通便等作用。其主要成分甜苷v是世界上最強的非糖甜味物質(zhì)之一，為蔗糖甜度的300-400倍，是一種低熱量、純天然的甜味劑及理想的保健品，此外還有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、降血糖等作用。
甜苷v目前還不能化學合成，主要依靠提取獲得。羅漢果對生境要求苛刻，只適宜在廣西生長，且栽培中不能連作，果實中甜苷v含量低，無法滿足市場需求，因此亟待探索提高甜苷v含量的新途徑、新方法。
羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環(huán)三萜類物質(zhì)，本課題組前期根據(jù)羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，已推導出甜苷v可能的生物合成途徑。羅漢果甜苷v生物合成的前體物質(zhì)是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內(nèi)基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發(fā)生在胞質(zhì)中，mep途徑發(fā)生在質(zhì)體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經(jīng)牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經(jīng)角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環(huán)氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(cs)進一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，形成羅漢果甜苷v。
異戊二烯類物質(zhì)的產(chǎn)生受到限速酶活性的嚴格調(diào)控，一直被認為在其生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，cyp450酶基因的表達對羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達cyp450酶基因，可以促進羅漢果甜苷v的積累；相反，如果抑制cyp450酶基因的表達，羅漢果甜苷v的產(chǎn)量將顯著降低。然而，cyp450酶基因是個超基因家族，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，cyp24與羅漢果甜苷v的合成途徑有一定關聯(lián)。現(xiàn)有技術中未見有促進羅漢果cyp24基因表達來提高羅漢果中甜苷v含量的報道。
技術實現(xiàn)要素：
作為各種廣泛且細致的研究和實驗的結果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在羅漢果種植過程中，噴灑含有茉莉酸甲酯的溶液可以刺激并誘導羅漢果中cyp24基因的表達，從而促進cyp450酶基因表達，促進羅漢果甜苷v的生物合成和累積?；谶@種發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種通過茉莉酸甲酯對羅漢果組培、育苗、果實發(fā)育進行干涉處理來促進cyp24基因表達基因表達的方法，可以有效促進羅漢果中甜苷v含量積累。
本發(fā)明還有一個目的是通過組織培養(yǎng)和人工授粉來促進優(yōu)良植株的選育和規(guī)?；N植，進一步促進羅漢果甜苷v的產(chǎn)量。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種促進羅漢果cyp24基因表達的方法，包括：將優(yōu)質(zhì)羅漢果植株的幼葉進行組織培養(yǎng)，獲得羅漢果組培苗，所述組織培養(yǎng)包括愈傷組織誘導增殖培養(yǎng)和不定芽分化、增殖與萌發(fā)培養(yǎng)，其中愈傷組織誘導增殖培養(yǎng)在誘導培養(yǎng)基1中完成，不定芽分化、增殖與萌發(fā)培養(yǎng)在誘導培養(yǎng)基2中完成，所述誘導培養(yǎng)基1中茉莉酸甲酯濃度為50～400μmol/l，所述誘導培養(yǎng)基2中茉莉酸甲酯濃度為100～500μmol/l；
在所述羅漢果組培苗移栽20～30日后的在葉面噴灑滴灌誘導液1，連續(xù)噴灑七日，其中所述誘導液1中茉莉酸甲酯為100～500μmol/l；
植株開花授粉20天后，每隔3日噴灑一次誘導液2，噴灑5次，其中所述誘導液2中茉莉酸甲酯為50～100μmol/l。
優(yōu)選的是，其中，所述誘導培養(yǎng)基1和誘導培養(yǎng)基2中還包括基礎培養(yǎng)基，其配方為ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。
優(yōu)選的是，其中，所述誘導培養(yǎng)基1或誘導培養(yǎng)基2的制備方法如下：將茉莉酸甲酯通過2％的乙醇水溶液(v/v)溶解配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，通過無菌的孔徑0.20-0.45μm的硝酸纖維素膜進行過濾殺菌，將殺菌后的母液添加到所述基礎培養(yǎng)基中，使得茉莉酸甲酯達到所需的濃度，其中所述基礎培養(yǎng)基是高溫蒸汽消毒滅菌且經(jīng)過降溫的仍是液態(tài)的基礎培養(yǎng)基。
優(yōu)選的是，其中，所述組織培養(yǎng)包括：將所述幼葉切成直徑約1cm的葉圓片，在洗衣粉的水溶液中浸泡數(shù)分鐘，后用蒸餾水沖洗干凈，再在超凈工作臺土，用70％酒精浸30～40秒取出，隨后用hgcl2水溶液消毒8分鐘，用無菌水沖洗3～5次；將所述葉圓片接種在誘導培養(yǎng)基1上誘導愈傷組織，愈傷組織繼代增殖數(shù)次后，取生長旺盛、生活力強的愈傷組織，切成直徑lcm的小塊；將所述小塊接種在誘導培養(yǎng)基2上進行分化不定芽，繼續(xù)進行繼代增殖獲得組培苗。
優(yōu)選的是，其中，所述組織培養(yǎng)的條件為：25℃恒溫，相對濕度70％～80％，采用人工光照，每天12小時光照，12小時黑暗培養(yǎng)，光照強度1000～1500lux。
優(yōu)選的是，其中，將組培苗進行根部處理后用0.1％的高錳酸鉀或10～50mg/l的新潔爾滅溶液浸泡5min滅菌，將滅菌的組培苗移栽到滅菌的介質(zhì)中，其中所述介質(zhì)由20～30重量份蛭石、15～20重量份珍珠巖、10～15重量份粘沙、15～20重量份谷殼、10～15重量份鋸木屑、以及10～15重量份磨菇渣組成，隨后根部噴灑10毫克/千克的abt生根粉溶液一次，然后進行遮光5日。
優(yōu)選的是，其中，所述根部處理具體包括：
將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2～3條粗壯根用無菌針分別刺穿2-3個傷口，傷口深度小于0.1mm，再將所有根部浸泡在浸泡液中，連續(xù)變溫處理3次，然后瀝干備用，
其中所述變溫處理均為將根系先置于4℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min，
所述浸泡液含有0.1μg/l的納米銀、3mg/l的abt生根粉、0.15g/l葡甘露聚糖，50～200μmol/l茉莉酸甲酯，以磁化水為溶劑。
優(yōu)選的是，其中，所述誘導液1還包括100mg/l甘草次酸，誘導液1噴灑量為每株200g/d，所述誘導液2還包括300mg/l的蘆丁素，誘導液2噴灑量為每株500g/d。
優(yōu)選的是，其中，還包括人工噴霧授粉，其方法為：在授粉日當天，采摘剛剛開放的雄花，將蕊柱連同花粉剪下倒入噴霧液內(nèi)，充分搖晃，讓花粉脫離柱頭溶入噴霧液內(nèi)，最終使得噴霧液呈明顯的黃色，過濾，倒入農(nóng)用噴霧器內(nèi)，對著雌花柱頭進行噴灑，噴灑量為每株開花的雌花植株2～5l噴霧液，
其中所述噴霧液的配方為：0.1～0.3g/l硼酸+0.2％氨基酸水肥+0.02～0.062,4–d+0.01～0.03g/l甘草次酸+水。
優(yōu)選的是，其中，所述誘導培養(yǎng)基中還包括有50μmol/l2,4-表油菜素內(nèi)酯。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
由于組織培養(yǎng)過程中加入了茉莉酸甲酯的溶液，長期內(nèi)以刺激并誘導羅漢果中cyp24基因的表達，從而促進cyp450酶基因表達，促進羅漢果甜苷v的生物合成，提高其產(chǎn)量；
由于組織培養(yǎng)開始刺激羅漢果cyp24基因表達的方法，因此植株對于該成分敏感，在授粉掛果后噴灑繼續(xù)茉莉酸甲酯的溶液，對于促進基因表達的反饋更加敏感，可以增加羅漢果中甜苷v的累積；
由于誘導液中增加甘草次酸和蘆丁素，因此輔助茉莉酸甲酯對于cyp24基因表達的協(xié)同刺激，從而對羅漢果中甜苷v的累積有促進作用。
由于植株移植過程中進行根部處理，也增加了茉莉酸甲酯，因此植株定植生長過程中cyp24基因有刺激作用，可以促進羅漢果甜苷v的生物合成。
由于統(tǒng)一人工授粉，使得果實可以在后期誘導液噴灑時，同時接受刺激，有效的促進cyp24基因的集中表達，從而進一步提高羅漢果甜苷v的含量，并且有利于統(tǒng)一采摘管理等；
本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
<實例1>
配置誘導培養(yǎng)基：根據(jù)配方：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭配置基礎培養(yǎng)基，將茉莉酸甲酯通過2％的乙醇水溶液(v/v)溶解配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，通過無菌的孔徑0.20μm的硝酸纖維素膜進行過濾殺菌，將殺菌后的母液添加到所述基礎培養(yǎng)基中，使得茉莉酸甲酯達到所需的濃度，其中所述誘導培養(yǎng)基1中茉莉酸甲酯濃度為50μmol/l，所述誘導培養(yǎng)基2中茉莉酸甲酯濃度為100μmol/l；
組織培養(yǎng)：將優(yōu)質(zhì)羅漢果植株的幼葉進行組織培養(yǎng)，將所述幼葉切成直徑1cm的葉圓片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分鐘，后用蒸餾水沖洗干凈，再在超凈工作臺上，用70％酒精浸30秒取出，隨后用hgcl2水溶液消毒8分鐘，用無菌水沖洗3次；將所述葉圓片接種在誘導培養(yǎng)基1上誘導愈傷組織，愈傷組織繼代增殖數(shù)次后，取生長旺盛、生活力強的愈傷組織，切成直徑lcm的小塊；將所述小塊接種在誘導培養(yǎng)基2上進行分化不定芽，繼續(xù)進行繼代增殖獲得組培苗。
移植種植：將組培苗用0.1％的高錳酸鉀溶液浸泡滅菌；將滅菌的組培苗移栽到滅菌的介質(zhì)中，其中所述介質(zhì)由20重量份蛭石、15重量份珍珠巖、10重量份粘沙、15重量份谷殼、10重量份鋸木屑、以及10重量份磨菇渣組成；移栽后在葉面噴灑10毫克/千克的abt生根粉溶液一次，然后進行遮光5日；在所述羅漢果組培苗移栽20～30日后的在葉面噴灑滴灌誘導液1，連續(xù)噴灑7日，其中所述誘導液1中茉莉酸甲酯為100μmol/l
授粉后噴灑：植株開花授粉后20天，連續(xù)噴灑7天的誘導液2，其中所述誘導液2中茉莉酸甲酯為50μmol/l。
<實例2>
配置誘導培養(yǎng)基：根據(jù)配方：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭配置基礎培養(yǎng)基，將茉莉酸甲酯通過2％的乙醇水溶液(v/v)溶解配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，通過無菌的孔徑0.20μm的硝酸纖維素膜進行過濾殺菌，將殺菌后的母液添加到所述基礎培養(yǎng)基中，使得茉莉酸甲酯達到所需的濃度，其中所述誘導培養(yǎng)基1中茉莉酸甲酯濃度為400μmol/l，所述誘導培養(yǎng)基2中茉莉酸甲酯濃度為500μmol/l；
組織培養(yǎng)：將優(yōu)質(zhì)羅漢果植株的幼葉進行組織培養(yǎng)，將所述幼葉切成直徑1cm的葉圓片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分鐘，后用蒸餾水沖洗干凈，再在超凈工作臺上，用70％酒精浸30秒取出，隨后用hgcl2水溶液消毒8分鐘，用無菌水沖洗3次；將所述葉圓片接種在誘導培養(yǎng)基1上誘導愈傷組織，愈傷組織繼代增殖數(shù)次后，取生長旺盛、生活力強的愈傷組織，切成直徑lcm的小塊；將所述小塊接種在誘導培養(yǎng)基2上進行分化不定芽，繼續(xù)進行繼代增殖獲得組培苗。
移植種植：將組培苗用0.1％的高錳酸鉀溶液浸泡滅菌；將滅菌的組培苗移栽到滅菌的介質(zhì)中，其中所述介質(zhì)由20重量份蛭石、15重量份珍珠巖、10重量份粘沙、15重量份谷殼、10重量份鋸木屑、以及10重量份磨菇渣組成；移栽后在葉面噴灑10毫克/千克的abt生根粉溶液一次，然后進行遮光5日；在所述羅漢果組培苗移栽20～30日后的在葉面噴灑滴灌誘導液1，連續(xù)噴灑7日，其中所述誘導液1中茉莉酸甲酯為500μmol/l
授粉后噴灑：植株開花授粉后20天，連續(xù)噴灑7天的誘導液2，其中所述誘導液2中茉莉酸甲酯為100μmol/l。
<實例3>
配置誘導培養(yǎng)基：根據(jù)配方：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭配置基礎培養(yǎng)基，將茉莉酸甲酯通過2％的乙醇水溶液(v/v)溶解配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，通過無菌的孔徑0.20μm的硝酸纖維素膜進行過濾殺菌，將殺菌后的母液添加到所述基礎培養(yǎng)基中，使得茉莉酸甲酯達到所需的濃度，其中所述誘導培養(yǎng)基1中茉莉酸甲酯濃度為200μmol/l，所述誘導培養(yǎng)基2中茉莉酸甲酯濃度為300μmol/l；
組織培養(yǎng)：將優(yōu)質(zhì)羅漢果植株的幼葉進行組織培養(yǎng)，將所述幼葉切成直徑1cm的葉圓片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分鐘，后用蒸餾水沖洗干凈，再在超凈工作臺上，用70％酒精浸30秒取出，隨后用hgcl2水溶液消毒8分鐘，用無菌水沖洗3次；將所述葉圓片接種在誘導培養(yǎng)基1上誘導愈傷組織，愈傷組織繼代增殖數(shù)次后，取生長旺盛、生活力強的愈傷組織，切成直徑lcm的小塊；將所述小塊接種在誘導培養(yǎng)基2上進行分化不定芽，繼續(xù)進行繼代增殖獲得組培苗。
移植種植：將組培苗用0.1％的高錳酸鉀溶液浸泡滅菌；將滅菌的組培苗移栽到滅菌的介質(zhì)中，其中所述介質(zhì)由20重量份蛭石、15重量份珍珠巖、10重量份粘沙、15重量份谷殼、10重量份鋸木屑、以及10重量份磨菇渣組成；移栽后在葉面噴灑10mg/l的abt生根粉溶液一次，然后進行遮光5日；在所述羅漢果組培苗移栽20～30日后的在葉面噴灑滴灌誘導液1，連續(xù)噴灑7日，其中所述誘導液1中茉莉酸甲酯為250μmol/l
授粉后噴灑：植株開花授粉后20天，連續(xù)噴灑7天的誘導液2，其中所述誘導液2中茉莉酸甲酯為75μmol/l。
<實例4>
在實施例3的基礎上，對移栽進行根部處理將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2～3條粗壯根用無菌針分別刺穿2-3個傷口，傷口深度小于0.1mm，再將所有根部浸泡在浸泡液中，連續(xù)變溫處理3次，然后瀝干備用，
其中所述變溫處理均為將根系先置于4℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min，
所述浸泡液含有1μg/l的納米銀、3mg/l的abt生根粉、0.15g/l葡甘露聚糖，50μmol/l茉莉酸甲酯，以磁化水為溶劑。
<實例5>
在實施例3的基礎上，對移栽進行根部處理將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2～3條粗壯根用無菌針分別刺穿2-3個傷口，傷口深度小于0.1mm，再將所有根部浸泡在浸泡液中，連續(xù)變溫處理3次，然后瀝干備用，
其中所述變溫處理均為將根系先置于4℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min，
所述浸泡液含有1μg/l的納米銀、3mg/l的abt生根粉、0.15g/l葡甘露聚糖，200μmol/l茉莉酸甲酯，以磁化水為溶劑。
<實例6>
在實施例3的基礎上，對移栽進行根部處理將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2～3條粗壯根用無菌針分別刺穿2-3個傷口，傷口深度小于0.1mm，再將所有根部浸泡在浸泡液中，連續(xù)變溫處理3次，然后瀝干備用，
其中所述變溫處理均為將根系先置于4℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min，
所述浸泡液含有1μg/l的納米銀、3mg/l的abt生根粉、0.15g/l葡甘露聚糖，100μmol/l茉莉酸甲酯，以磁化水為溶劑。
<實例7>
在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp24基因表達的方法，所述誘導液1中還包括100mg/l甘草次酸。
<實例8>
在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp24基因表達的方法，所述誘導液1中還包括有300mg/l的蘆丁素。
<實例9>
在實施例3的基礎上，增加人工授粉，在授粉日當天，采摘剛剛開放的雄花，將蕊柱連同花粉剪下倒入噴霧液內(nèi)，充分搖晃，讓花粉脫離柱頭溶入噴霧液內(nèi)，最終使得噴霧液呈明顯的黃色，過濾，倒入農(nóng)用噴霧器內(nèi)，對著雌花柱頭進行噴灑，噴灑量為每株開花的雌花植株2～5l噴霧液，其中，所述噴霧液的配方為：0.1/l硼酸+0.2％氨基酸水肥+0.022,4–d+0.01g/l甘草次酸+水。
<實例10>
在實施例3的基礎上，所述誘導培養(yǎng)基中還包括有50μmol/l2,4-表油菜素內(nèi)酯。
為了說明本發(fā)明的效果，發(fā)明人提供比較實驗如下：
<比較例1>
在調(diào)配物質(zhì)誘導培養(yǎng)基時，誘導培養(yǎng)基1中茉莉酸甲酯的含量為0，其余參數(shù)與實例3中的完全相同，工藝過程也完全相同。
<比較例2>
在調(diào)配物質(zhì)誘導培養(yǎng)基時，誘導培養(yǎng)基2中茉莉酸甲酯的含量為0μmol/l，其余參數(shù)與實例3中的完全相同，工藝過程也完全相同。
<比較例3>
在移植種植時，誘導液1的中茉莉酸甲酯的含量為0，其余參數(shù)與實例3中的完全相同，工藝過程也完全相同。
<比較例4>
在授粉后噴灑，誘導液2的中茉莉酸甲酯的含量為0，其余參數(shù)與實例2中的完全相同，工藝過程也完全相同。
<空白組>
參照實施例1，其中各個步驟中均不添加茉莉酸甲酯其余參數(shù)與實例1中的完全相同，工藝過程也完全相同。
測量方法：
1、cyp24基因表達量測定方法：利用abi7500實時熒光定量pcr儀，采用qrt-pcr檢測cyp24基因的表達。
步驟一：樣品前處理：采集羅漢果果實，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
步驟二：先采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna；
步驟三：將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃；
步驟四：采用primerpremier5.0軟件設計引物，其中，cyp24引物序列為：
fp：gattctacggcgatattcctt，
rp：aatggatgaagtatgacctgaa；
內(nèi)參基因用ubq5，
序列為fp：ataaaagacccagcaccacattc，
rp：cccttgccgactacaacatcc；
步驟五：qrt-pcr反應體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl；反應條件為95℃(30s)，接著進行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
2、羅漢果甜苷v含量：采用高效液相色譜法，具體方法參考《廣西中醫(yī)學院學報》第2007年04期上發(fā)表的“hplc測定羅漢果中羅漢果甜苷v的含量”一文。
采集羅漢果果實，烘干備用。將樣品經(jīng)70％甲醇溶液提取溶解，采用c18反相色譜柱分離，用乙腈-0.1％磷酸溶液(22∶78)為流動相進行洗脫，檢測波長為203nm，流速為lml/min，以色譜峰保留時間和紫外可見光譜進行定性，外標法進行定量。
表1不同實施例和比較例方法對羅漢果cyp24基因表達量和甜苷v含量的影響
注：誘導培養(yǎng)基中不同茉莉酸甲酯濃度處理的羅漢果果實cyp24基因表達量以未經(jīng)茉莉酸甲酯濃度處理方法得到的羅漢果果實cyp24基因表達量是1為參照；上述實驗數(shù)據(jù)均為上述每一個實施方案得到的20棵羅漢果果樹上任選其中5棵中得到的羅漢果果實進行平行試驗得到的。
從上表1能夠看出，實例中由于在誘導培養(yǎng)基、誘導液中添加了茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量顯著高于未添加的情況。并且實例中茉莉酸甲酯成分的比例控制在一定范圍之間之間，如果超過，其促進作用不明顯。
比較例1與實例3相比，誘導培養(yǎng)基1中未添加茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量明顯下降，但是對比空白依舊有明顯的增加。
比較例2與實例3相比，誘導培養(yǎng)基2中未添加茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量明顯下降，但是對比空白依舊有增加，且增加的幅度略大于比較例1。
可見，本發(fā)明的在愈傷組織培養(yǎng)階段進行刺激的效果更加明顯；
比較例3與實例2相比，誘導液1中未添加茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量下降，但是對比空白有明顯的增加。
比較例4與實例2相比，誘導液2中未添加茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量下降，但是對比空白有明顯的增加，且增加的幅度略小于比較例1。
可見，本發(fā)明的在坐果后對果實的培養(yǎng)階段進行刺激的效果相較于育苗階段更加明顯；
實施例4與實例3相比，根部處理中茉莉酸甲酯濃度50μmol/l，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
實施例5與實例3相比，根部處理中茉莉酸甲酯濃度200μmol/l，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
實施例6與實例3相比，根部處理中茉莉酸甲酯濃度100μmol/l，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
可見，本發(fā)明在移栽錢進行根部處理，添加茉莉酸甲酯可以促進cyp24基因表達量和甜苷v含量增加，并且其濃度范圍為50～200μmol/l均有良好的促進效果。
實施例7與實例3相比，誘導液1中含有甘草次酸，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
實施例8與實例3相比，誘導液2中含有蘆丁素，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
可見，在誘導液中增加甘草次酸和蘆丁素可以促進cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
實施例6與實例3相比，進行人工授粉，并且在噴霧液中增加甘草次酸，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
可見，人工授粉中額外增加甘草次酸可以促進cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用。它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域。對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改。因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實例。