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      配體-受體示蹤測(cè)定法的制作方法

      文檔序號(hào):6102316閱讀:463來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):配體-受體示蹤測(cè)定法的制作方法
      高內(nèi)涵篩選最近作為一種與高通量篩選兼容的新方法出現(xiàn)在藥物研發(fā)中。高內(nèi)涵篩選是一種設(shè)計(jì)用于闡釋活細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白及其它細(xì)胞組分的時(shí)間和空間活性的技術(shù)平臺(tái)。
      用于高內(nèi)涵篩選的讀出裝置中一個(gè)重要組件是顯微鏡,該顯微鏡適于獲得微量滴定板中樣品的圖像。該讀出裝置裝備有提供自動(dòng)圖像獲取和分析的軟件。分析可以基于發(fā)光和/或視明場(chǎng)圖像。
      一種令人感興趣的用于藥物篩選的活性是激動(dòng)劑誘導(dǎo)的配體-受體復(fù)合物的內(nèi)化。通過(guò)融合至綠色熒光蛋白(GFP)的PTH(甲狀旁腺素)受體的成像,已經(jīng)顯示了PTH-受體的激動(dòng)劑誘導(dǎo)的內(nèi)化和循環(huán)(Conway等,2001年,J.Cell.Physiol.189期,341-355頁(yè))。Schlag等描述了5HT2c-GFP的內(nèi)化,其中用ArrayScan讀出裝置在一種細(xì)胞系中檢測(cè)了內(nèi)化作用。使用一種不同的檢測(cè)法即FLIPR(Schlag等,2004年,J.Pharmacol.Exp.Ther.310,865-870)單獨(dú)檢測(cè)了Ca2+流通量。Gao等描述了GFP標(biāo)記的MC4受體內(nèi)化的人工定量,但該方法不適于大規(guī)模篩選目的(Gao等,2003年,J.Pharmacol.Exp.Ther.307,870-877)。Giuliano等公開(kāi)了在同一單細(xì)胞群內(nèi)的多參數(shù)高內(nèi)涵篩選。該參考文獻(xiàn)沒(méi)有公開(kāi)配體示蹤或配體與多于一種細(xì)胞類(lèi)型復(fù)合時(shí)的情形(Giuliano等,2003年,Assay Drug Dev.Technol.1(4),565-577)。
      本發(fā)明提供了用于高內(nèi)涵篩選化合物的多位方法(multiplex method)。多位方法描述的是需要多于一個(gè)獨(dú)立的參數(shù)用于讀出信息的方法。通過(guò)高內(nèi)涵篩選,基于圖像的分析直接將某個(gè)測(cè)定的光學(xué)信號(hào)賦予單獨(dú)的被鑒定細(xì)胞。這使得多位方法可用于表達(dá)不同受體的單種細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)事件,以及可用于表達(dá)不同受體的多種細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)事件。在一個(gè)實(shí)施方案中,提供了用于異種細(xì)胞混合物中的多個(gè)事件的多位方法,其中亞群可以有不同反應(yīng)并能夠通過(guò)光學(xué)方法辨別。在另一實(shí)施方案中,提供了用于細(xì)胞亞群中多個(gè)事件的多位方法,這些細(xì)胞亞群可以有不同反應(yīng),由此能夠?qū)喨合嗷^(qū)分開(kāi)來(lái)。
      本發(fā)明方法因而使得可通過(guò)測(cè)量化合物對(duì)多細(xì)胞群中的多細(xì)胞參數(shù)的影響來(lái)篩選化合物。
      因此,在本發(fā)明的多位方法中,表達(dá)至少一種靶標(biāo)受體的至少一種單細(xì)胞或至少一種細(xì)胞亞群或異種細(xì)胞群的至少一種細(xì)胞參數(shù)在化合物存在或不存在時(shí)得以通過(guò)光學(xué)測(cè)量。在此方法中,可以使用細(xì)胞系、穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或原代細(xì)胞培養(yǎng)物,它們表達(dá)一種或多種靶標(biāo)受體。優(yōu)選地,至少兩種細(xì)胞參數(shù)得以測(cè)量。更優(yōu)選的,至少三種細(xì)胞參數(shù)得以測(cè)量。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,至少四種不同的參數(shù)得以測(cè)量。
      術(shù)語(yǔ)“光學(xué)測(cè)量的”和“測(cè)量的”可理解為光學(xué)信號(hào)的定量測(cè)定。
      對(duì)于上面描述的方法,優(yōu)選所述參數(shù)在至少兩種表達(dá)不同靶標(biāo)受體的單細(xì)胞中或在至少兩種表達(dá)不同靶標(biāo)受體的不同細(xì)胞亞群中測(cè)量。所述參數(shù)也可在至少三種表達(dá)不同靶標(biāo)受體的單細(xì)胞中或在至少三種表達(dá)不同靶標(biāo)受體的不同細(xì)胞亞群中測(cè)量。
      這里描述的方法中的任意一種靶標(biāo)受體可以是任意類(lèi)型的通過(guò)激動(dòng)劑刺激后發(fā)生內(nèi)化的受體。優(yōu)選地,所述靶標(biāo)受體是G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。更優(yōu)選地,所述受體選自生長(zhǎng)抑素受體5(SSTR-5)(Seq IDNo.1)、生長(zhǎng)激素促分泌素受體1a(GHSR-1a)(Seq ID No.2)、加壓素-1b受體(Seq ID No.3)或神經(jīng)激肽3受體(NK3R)(Seq ID No.4)。這里公開(kāi)的方法中所用的細(xì)胞可以是天然表達(dá)靶標(biāo)受體的細(xì)胞或是用靶標(biāo)受體穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
      在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,使用表達(dá)至少兩種靶標(biāo)受體之一的細(xì)胞的混合物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中,通過(guò)多位方法分析細(xì)胞亞群。細(xì)胞亞群可以由一種或多種細(xì)胞組成。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,細(xì)胞亞群可以例如通過(guò)它們?cè)趩慰字械奈恢没蛲ㄟ^(guò)表達(dá)不同染料或用不同染料染色來(lái)區(qū)分。在進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方案中,使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或最優(yōu)選地使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。細(xì)胞亞群由單種細(xì)胞或多于一種細(xì)胞組成。
      細(xì)胞參數(shù)可以是任意的能通過(guò)光學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞參數(shù)。作為非限定性實(shí)例,這些參數(shù)可以是細(xì)胞亞群或單種細(xì)胞的位置,為此細(xì)胞可以獨(dú)立地用熒光或非熒光染料標(biāo)記,包括用熒光蛋白(例如GFP或本領(lǐng)域已知的其它熒光蛋白)轉(zhuǎn)染;細(xì)胞中Ca2+流通量;受標(biāo)記蛋白從一個(gè)細(xì)胞區(qū)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一細(xì)胞區(qū)室,其中所述的標(biāo)記可以通過(guò)光學(xué)檢測(cè);蛋白的降解;使用報(bào)告基因檢測(cè)基因表達(dá);細(xì)胞凋亡的檢測(cè);受體或配體的內(nèi)化或誘導(dǎo)內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)的小分子激動(dòng)劑。
      本發(fā)明公開(kāi)了經(jīng)優(yōu)化用于在細(xì)胞水平上進(jìn)行藥物篩選的高內(nèi)涵配體-受體示蹤方法。本方法基于受標(biāo)記配體和/或受體的局部濃度及其亞細(xì)胞定位的基于圖像的示蹤。本發(fā)明使得受體-配體示蹤與其它細(xì)胞參數(shù)相關(guān)成為可能,這可通過(guò)多位方法達(dá)到。優(yōu)選地,配體-受體內(nèi)化通過(guò)本方法得以示蹤。
      受體脫敏作用是一種使得細(xì)胞能調(diào)控對(duì)細(xì)胞外激動(dòng)劑的刺激產(chǎn)生反應(yīng)的機(jī)制。脫敏作用對(duì)于調(diào)控細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外刺激的敏感性是重要的,因?yàn)槊撁糇饔檬沟谜T導(dǎo)的受體活性能快速衰減,從而使細(xì)胞準(zhǔn)備好接受隨后的相似或不同激動(dòng)劑的刺激,所述的這些刺激使用相同的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。脫敏的第二種重要功能是通過(guò)連續(xù)的暴露于激動(dòng)劑下來(lái)調(diào)節(jié)敏感性。對(duì)于GPCRs,信號(hào)的衰減涉及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化作用,然后是受體蛋白從細(xì)胞表面的物理性移除。受體的內(nèi)化發(fā)生時(shí)自細(xì)胞外膜形成小泡,小泡含有嵌入膜內(nèi)的磷酸化受體和位于小泡內(nèi)腔的配體。隨后,受體可以在溶酶體中降解或復(fù)敏并循環(huán)回細(xì)胞表面。
      篩選影響受體內(nèi)化的化合物的檢測(cè)法可以鑒別具有不同藥學(xué)性質(zhì)的受體配體,該檢測(cè)法成為經(jīng)典的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)法的競(jìng)爭(zhēng)者。此外,靶向內(nèi)化機(jī)制其它步驟的化合物也能在配體-受體示蹤檢測(cè)法中得以檢測(cè)。
      配體或受體的內(nèi)化通過(guò)內(nèi)化的定量成像和累加由可在細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中通過(guò)光學(xué)測(cè)量的標(biāo)記提供的信號(hào)而示蹤,并且這種內(nèi)化能與在相同細(xì)胞中平行測(cè)量的其它細(xì)胞參數(shù)相關(guān)聯(lián)。該方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的配體示蹤方法如由Nouel等,1997年,Endocrinology 138期,296-306頁(yè);或Rocheville等,2000年,J.Bio.Chem.275期,7862-7869所描述的方法。特別地,使用基于圖像的檢測(cè)才能獲得足夠強(qiáng)以進(jìn)行多位方法的藥物篩選包括配體受體示蹤的信號(hào)。即使,在受標(biāo)記的激動(dòng)劑的情況下,當(dāng)誘導(dǎo)內(nèi)化時(shí)內(nèi)化的激動(dòng)劑最終被降解或從受體上解離,該激動(dòng)劑也將在細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中保持聚集足夠長(zhǎng)的時(shí)間而得以直接測(cè)量,所測(cè)得的激動(dòng)劑的數(shù)量與細(xì)胞表面存在的受體數(shù)量成比例。
      因而,在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,至少兩個(gè)所測(cè)細(xì)胞參數(shù)中的至少一個(gè)是受體-配體內(nèi)化,其中所述受體-配體內(nèi)化可以通過(guò)光學(xué)檢測(cè)受標(biāo)記的配體或受標(biāo)記的受體得以示蹤。
      在本發(fā)明的該實(shí)施方案中,提供了誘導(dǎo)靶標(biāo)受體內(nèi)化的靶標(biāo)受體的激動(dòng)劑。受體-配體內(nèi)化可以通過(guò)示蹤受標(biāo)記配體(激動(dòng)劑)或通過(guò)示蹤受標(biāo)記的靶標(biāo)受體得以檢測(cè),其中所述的標(biāo)記可以通過(guò)光學(xué)檢測(cè)。標(biāo)記可以共價(jià)地或非共價(jià)地連接至配體或靶標(biāo)受體上,并且光學(xué)檢測(cè)可以是直接的或間接的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,標(biāo)記物是發(fā)光團(tuán)。所述受標(biāo)記的受體不是熒光蛋白如GFP與之融合的受體也是優(yōu)選的。
      標(biāo)記物可以包括發(fā)光團(tuán),優(yōu)選融合至配體上的熒光蛋白如GFP的熒光團(tuán),所述標(biāo)記物共價(jià)地結(jié)合至靶標(biāo)受體或配體上。備選地,標(biāo)記物也可以是結(jié)合至所述靶標(biāo)受體上而不誘導(dǎo)活化的抗體。所述抗體因而可以通過(guò)與它們連接的標(biāo)記物得以示蹤。這類(lèi)標(biāo)記物可以是任何能在活的或經(jīng)固定細(xì)胞中能直接或間接通過(guò)光學(xué)檢測(cè)的標(biāo)記物。Adie等公開(kāi)了內(nèi)化的GPCRs的示蹤,其能與融合有標(biāo)記物的特定抗體結(jié)合,在所述抗體上連接有pH敏感的能用光學(xué)檢測(cè)的標(biāo)記物(Adie等,2003年,Assay Drug Dev.Technol.第1期,251-259頁(yè))。其它的標(biāo)記包括生物素-鏈霉抗生物素體系或任意其它體系,在所述其它體系中,發(fā)光團(tuán)或更優(yōu)選地?zé)晒鈭F(tuán)結(jié)合在一種這樣的試劑上,所述試劑能以非共價(jià)的方式結(jié)合至配體或激動(dòng)劑或受體上或結(jié)合至融合或連接在它們上的標(biāo)記物上。合適的檢測(cè)體系也包括鑭系螯合物檢測(cè)體系。在優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案中,示蹤用熒光團(tuán)標(biāo)記的配體。然后將這種熒光團(tuán)標(biāo)記的配體在存在或不存在所述化合物時(shí)與表達(dá)靶標(biāo)受體的細(xì)胞孵育。如上文描述,所述細(xì)胞可以是表達(dá)一種或多種靶標(biāo)受體的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,使用表達(dá)至少兩種靶標(biāo)受體任意之一的細(xì)胞混合物。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,通過(guò)多位方法分析表達(dá)至少一種靶標(biāo)受體的細(xì)胞亞群。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述的細(xì)胞亞群可以例如通過(guò)它們?cè)趩蝹€(gè)板孔中的位置區(qū)分。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中,通過(guò)本發(fā)明的多位方法分析單種細(xì)胞。
      受體激動(dòng)劑可以是先前被鑒定作為給定靶標(biāo)受體的激動(dòng)劑并誘導(dǎo)受體內(nèi)化的小分子,或是天然配體,優(yōu)選肽或蛋白,或是它們的能作為激動(dòng)劑并介導(dǎo)受體內(nèi)化的片段。術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”和“配體”可相互交換使用并且兩者都包括天然配體、這類(lèi)配體的片段、抗體以及能刺激受體和配體/激動(dòng)劑內(nèi)化的小分子。本發(fā)明的激動(dòng)劑也包括對(duì)抗靶標(biāo)受體的經(jīng)標(biāo)記抗體,該抗體誘導(dǎo)受體-激動(dòng)劑復(fù)合物的內(nèi)化。優(yōu)選的實(shí)施方案是生長(zhǎng)抑素,更優(yōu)選地是生長(zhǎng)抑素-14(Seq ID No.5);生長(zhǎng)激素釋放激素(ghrelin)(Seq IDNo.6),更優(yōu)選地是截短形式的生長(zhǎng)激素釋放激素(Seq ID No.10);加壓素(Seq ID No.7);或神經(jīng)激肽3(Seq ID No.8);將用熒光團(tuán)標(biāo)記的激動(dòng)劑與表達(dá)靶標(biāo)受體的細(xì)胞孵育,該激動(dòng)劑誘導(dǎo)激動(dòng)劑-受體復(fù)合物的內(nèi)化。然后將細(xì)胞固定并通過(guò)使用合適的具有受體內(nèi)化算法(Receptor Internalization algorithm)的熒光成像硬件和軟件如ArrayScan 4.0(Cellomics公司)定量熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)量?jī)?nèi)化的激動(dòng)劑。在下面描述的實(shí)施例中,所用的軟件能確定較亮目標(biāo)例如細(xì)胞核(如用特異性熒光染料如Hoechst 33258染色的細(xì)胞核)或斑點(diǎn)(如代表包含熒光激動(dòng)劑的小泡的斑點(diǎn)的位置、大小、形狀以及強(qiáng)度)。因而,可將熒光激動(dòng)劑的強(qiáng)度與通過(guò)被染色的細(xì)胞核測(cè)定的細(xì)胞數(shù)目相互關(guān)聯(lián)。這使得能測(cè)定抑制熒光標(biāo)記的激動(dòng)劑內(nèi)化的化合物的劑量反應(yīng)曲線并因而計(jì)算出IC50值。
      在存在或不存在所述化合物時(shí)孵育的所述細(xì)胞中,所述激動(dòng)劑或配體的內(nèi)化以及第二個(gè)參數(shù)(作為非限制性實(shí)例,它可以是一種細(xì)胞或細(xì)胞亞群或多種細(xì)胞的位置、Ca2+流通量、報(bào)告基因的表達(dá)或第二種激動(dòng)劑的內(nèi)化等)得以測(cè)量。
      這種方法也可用于進(jìn)行反向篩選以確定化合物的選擇性,優(yōu)選地在單孔中進(jìn)行,其中至少兩種不同的細(xì)胞亞群獨(dú)立地表達(dá)至少兩種能結(jié)合相同配體的受體。這種檢測(cè)法的一個(gè)可能的非限制性實(shí)施方案是表達(dá)一種針對(duì)特定配體的靶標(biāo)受體的一種細(xì)胞和表達(dá)針對(duì)相同配體的第二種受體的第二種細(xì)胞的使用,其中至少一種所述細(xì)胞能通過(guò)光學(xué)識(shí)別如用熒光或非熒光染料(如共表達(dá)的GFP)標(biāo)記,或其中這兩種細(xì)胞能基于它們的位置得以檢測(cè)。這使得能區(qū)分這兩種細(xì)胞。用發(fā)光團(tuán)優(yōu)選地用熒光團(tuán)標(biāo)記的配體或受體的內(nèi)化然后能在兩種細(xì)胞中通過(guò)光學(xué)獨(dú)立地得以檢測(cè)。拮抗劑對(duì)于兩種受體的選擇性然后可以得以測(cè)量并定量,其中所述拮抗劑阻止至少一種受體的內(nèi)化。其它細(xì)胞參數(shù),像例如Ca2+流通量,可以通過(guò)在本發(fā)明的多位方法中平行測(cè)量而與內(nèi)化相互關(guān)聯(lián)。
      也可用于進(jìn)行反向篩選的可能的另一方法是測(cè)定化合物的選擇性,優(yōu)選在單孔中進(jìn)行,其中至少兩種不同的細(xì)胞亞群獨(dú)立地表達(dá)至少兩種能結(jié)合不同配體的受體。這種檢測(cè)法的一個(gè)可能的非限制性實(shí)施方案是使用表達(dá)針對(duì)特異性配體的一種靶標(biāo)受體的一種細(xì)胞和表達(dá)針對(duì)第二種配體的第二種受體的第二種細(xì)胞,其中所述細(xì)胞能通過(guò)光學(xué)區(qū)分,例如通過(guò)不同的細(xì)胞大小或細(xì)胞亞群之間的其它光學(xué)差異,或通過(guò)用發(fā)光或非發(fā)光染料(如共表達(dá)的GFP)標(biāo)記,或其中兩種細(xì)胞可以基于它們的位置得以鑒別。這使得能區(qū)分兩種細(xì)胞。用發(fā)光團(tuán)優(yōu)選地用熒光團(tuán)標(biāo)記的配體或受體的內(nèi)化然后能在兩種細(xì)胞中通過(guò)光學(xué)獨(dú)立地檢測(cè)。
      在另一本發(fā)明的實(shí)施方案中,用可獨(dú)立地檢測(cè)的兩種不同標(biāo)記物標(biāo)記的至少兩種不同配體的內(nèi)化在至少兩種不同細(xì)胞亞群中于存在或不存在化合物時(shí)得以測(cè)量,其中所述的這兩種不同細(xì)胞亞群獨(dú)立地表達(dá)至少兩種不同的靶標(biāo)受體。
      上文描述的方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中,靶標(biāo)受體是GPCR。
      上文描述的多位方法的優(yōu)選實(shí)施方案中,至少三個(gè)細(xì)胞參數(shù)得以測(cè)量。
      本發(fā)明提供了發(fā)光團(tuán)標(biāo)記的誘導(dǎo)受體內(nèi)化的激動(dòng)劑、發(fā)光團(tuán)標(biāo)記的受體或發(fā)光團(tuán)標(biāo)記的針對(duì)GPCR的抗體的用途,用于在化合物的多位高內(nèi)涵篩選中的受體-配體示蹤。優(yōu)選地,所述發(fā)光團(tuán)是熒光團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中,發(fā)光團(tuán)標(biāo)記的受體不是熒光蛋白如GFP融合的受體。
      附圖描述

      圖1用Cellomics ArrayScan 4.0高內(nèi)涵篩選讀出裝置獲得的制備在96孔板中的固定的細(xì)胞樣品圖像。物鏡10x。濾光片設(shè)置(filter setting)1XF53-TxR,2秒曝光時(shí)間(圖片A和C)。濾光片設(shè)置2XF53-hoechst,0.1秒曝光時(shí)間(圖片B和D)。
      A與100nM Atto590-SST14在37℃下孵育30分鐘的SSTR-5表達(dá)細(xì)胞,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置1獲得。圖像B與A中相同的樣品,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置2獲得。C與1μM SST14和100nM Atto590-SST14孵育的SSTR-5表達(dá)細(xì)胞,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置1獲得。D與C相同的樣品,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置2獲得。
      圖2劑量反應(yīng)曲線每個(gè)細(xì)胞的ERC(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)循環(huán)區(qū)室)強(qiáng)度,檢測(cè)自與100nM Atto590-SST14及不同量的SST14孵育的SSTR-5細(xì)胞樣品(對(duì)于樣品制備,見(jiàn)方法)。分析的圖像用如圖1說(shuō)明中描述的相同的光學(xué)設(shè)置獲得。細(xì)胞核的數(shù)量和ERCs中的強(qiáng)度通過(guò)使用受體內(nèi)化算法(Cellomics公司),從每孔4張圖像得以測(cè)定。
      圖3用Cellomics ArrayScan 4.0高內(nèi)涵篩選讀出裝置獲得的制備在96孔板中的固定的細(xì)胞樣品圖像。物鏡20x。濾光片設(shè)置1XF110-Cy5,10秒曝光時(shí)間(圖片A和C)。濾光片設(shè)置2XF53-hoechst,0.1秒曝光時(shí)間(圖片B和D)。
      圖片A與1nM Atto655-NKB在37℃下孵育30分鐘的NK3R表達(dá)細(xì)胞,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置1獲得。B與A相同樣品,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置2獲得。C與1μM SB222200及1nM Atto655-NKB孵育的NK3R表達(dá)細(xì)胞,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置1獲得。D與C相同的樣品,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置2獲得。
      圖4劑量反應(yīng)曲線每個(gè)細(xì)胞的ERC強(qiáng)度,作為不同量的SB222200的函數(shù)測(cè)定自與1nMAtto655-NKB孵育的NK3R細(xì)胞樣品(對(duì)于樣品制備,見(jiàn)方法)。分析的圖像用如圖3說(shuō)明中描述的相同的光學(xué)設(shè)置獲得,并通過(guò)使用受體內(nèi)化算法(Cellomics公司),從每孔4張圖像分析。
      圖5混合的NK3R表達(dá)細(xì)胞群和SSTR5表達(dá)細(xì)胞群,它們與1nMAtto655-NKB和100nM Atto590-SST14以及非熒光配體的不同組合在37℃下孵育30分鐘。A、B、C無(wú)非熒光配體;D、E、F1μM SST14;G、H、I1μM SB222200;J、K、L1μM SST14和1μM SB222200。
      于96孔板制備固定細(xì)胞樣品,將用不同濾光片設(shè)置在CellomicsArrayScan 4.0高內(nèi)涵篩選讀出裝置中獲得的三張圖片重疊。物鏡10x。濾光片設(shè)置XF53-TxR,0.8秒曝光時(shí)間(A、D、G、J)、XF93-Cy5,10秒曝光時(shí)間(B、E、H、K)和XF53-hoechst,0.1秒曝光時(shí)間(C、F、I、L)。
      圖6劑量反應(yīng)曲線每個(gè)細(xì)胞的ERC強(qiáng)度,該強(qiáng)度測(cè)定自與1nM Atto655-NKB及100nMAtto590-SST14孵育的混合的NK3R細(xì)胞和SSTR5細(xì)胞樣品的圖像。左邊的Y軸,實(shí)心圓用XF53-hoechst/XF53-TxR濾光片設(shè)置獲得的圖片對(duì)的ERC強(qiáng)度/細(xì)胞。右邊的Y軸,空心圓用XF93-hoechst/XF93-Cy5濾光片設(shè)置獲得的同一樣品圖片對(duì)的ERC強(qiáng)度/細(xì)胞。上面的圖片作為不同量SB222200的函數(shù)的ERC強(qiáng)度,下面的圖片作為不同量SST14函數(shù)的ERC強(qiáng)度。圖像組通過(guò)用受體內(nèi)化算法(Cellomics公司),從每孔4張圖像分析。
      圖6顯示了該方法如何使得能在同一樣品中同時(shí)定量用于GPCR內(nèi)化的兩個(gè)獨(dú)立讀出信息。
      圖7用Cellomics ArrayScan 4.0高內(nèi)涵篩選讀出裝置獲得的制備在96孔板中的固定細(xì)胞樣品圖像。物鏡20x。濾光片設(shè)置1XF53-TxR,2秒曝光時(shí)間(圖片A和C)。濾光片設(shè)置2XF53-hoechst,0.1秒曝光時(shí)間(圖片B和D)。
      圖片A與10nM生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅37℃下孵育30分鐘的GHSR-1a表達(dá)細(xì)胞。圖像通過(guò)濾光片設(shè)置1獲得。B與A相同的樣品,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置2獲得。C與1μM MK0677和10nM生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅孵育的GHSR-1a表達(dá)細(xì)胞,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置1獲得。D與C相同的樣品,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置2獲得。
      圖8劑量反應(yīng)曲線測(cè)定自與10nM生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅孵育的GHSR-1a細(xì)胞樣品的每個(gè)細(xì)胞的ERC強(qiáng)度,其作為不同量的MK0677的函數(shù)(對(duì)于樣品制備,見(jiàn)方法)。用如圖7說(shuō)明中描述的相同的光學(xué)設(shè)置獲得分析的圖像,并通過(guò)使用受體內(nèi)化算法(Cellomics公司),從每孔4張圖像分析。
      圖9用Cellomics ArrayScan 4.0高內(nèi)涵篩選讀出裝置獲得的制備在96孔板中的固定細(xì)胞樣品圖像。物鏡20x。濾光片設(shè)置1XF93-TRITC,2秒曝光時(shí)間(圖片A和C)。濾光片設(shè)置2XF93-hoechst,0.1秒曝光時(shí)間(圖片B和D)。
      圖片A與5nM BO-TMR-加壓素37℃下孵育30分鐘的V1bR表達(dá)細(xì)胞,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置1獲得。B與A相同的樣品,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置2獲得。C與100nM Arg-8-加壓素及BO-TMR-加壓素孵育的V1bR表達(dá)細(xì)胞,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置1獲得。D與C相同的樣品,圖像通過(guò)濾光片設(shè)置2獲得。
      圖10劑量反應(yīng)曲線測(cè)定自與5nM BO-TMR-加壓素孵育的V1bR細(xì)胞樣品的每個(gè)細(xì)胞的ERC強(qiáng)度,其作為不同量的Arg-8-加壓素的函數(shù)(對(duì)于樣品制備,見(jiàn)方法)。分析的圖像用如圖8說(shuō)明中描述的相同的光學(xué)設(shè)置獲得,并通過(guò)使用受體內(nèi)化算法(Cellomics公司),從每孔4張圖像分析。
      實(shí)施例實(shí)施例1激動(dòng)劑內(nèi)化檢測(cè)法的一般性例子使用至少一種與熒光團(tuán)偶聯(lián)的激動(dòng)劑??梢灶~外使用用于細(xì)胞核的染料如Hoechst 33258來(lái)方便單個(gè)細(xì)胞的鑒別。下面的方法包括使用Hoechst33258,但它可以用任何其它細(xì)胞染料、熒光或非熒光染料來(lái)代替。
      用于檢測(cè)法的細(xì)胞可以是天然表達(dá)靶標(biāo)受體的細(xì)胞,或是用靶標(biāo)受體瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
      塑料器皿及溶液檢測(cè)板View plateTM96孔,黑色;Packard目錄編號(hào)1104-02C,任選地經(jīng)多聚-D賴氨酸處理10xHBSS GIBCO目錄號(hào)14065-049Hepes 1M溶液,GIBCO目錄號(hào)15630-056BSA 牛血清白蛋白級(jí)分V,Sigma,目錄號(hào)A-3059Hoechst 33258 Sigma,目錄號(hào)B-2261(bisbenzimide),在DMSO中溶解至10mM。
      甲醛 4%,稀釋自PBS中的36.5%的貯液。
      樣品制備第一天在實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)接種細(xì)胞用胰蛋白酶/EDTA分離細(xì)胞。加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基并通過(guò)用10ml吸管吸移10-20次使細(xì)胞懸浮。測(cè)量細(xì)胞濃度并將細(xì)胞懸液稀釋至合適的濃度。對(duì)于在96孔板中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn),在200μl培養(yǎng)基中以15.000個(gè)細(xì)胞/每孔接種細(xì)胞。將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃下孵育以使細(xì)胞貼在孔上。
      第二天制備I-緩沖液(1xHBSS,20mM Hepes,0.1%BSA,用蒸餾三次的水制備,不調(diào)整PH)。制備Hoechst 33258溶液并在37℃下平衡。制備競(jìng)爭(zhēng)劑溶液及熒光配體溶液并在37℃下平衡5分鐘。在下面的刺激期間,孔內(nèi)溫度保持37℃。
      將細(xì)胞培養(yǎng)基小心吸出。在每個(gè)孔中,加入70μl 1.8x Hoechst溶液、用于競(jìng)爭(zhēng)的具有1%DMSO的10μl熒光團(tuán)-激動(dòng)劑/緩沖液及10μl漸增濃度的熒光團(tuán)-激動(dòng)劑/緩沖液,或在對(duì)照孔中僅加入緩沖液。將混合物在增濕的培養(yǎng)箱中37℃下孵育20-40分鐘。
      以100μl/每孔37℃下預(yù)平衡的I-緩沖液小心而快速地洗滌細(xì)胞一次。然后加入100μl/每孔4%甲醛(室溫),并在室溫下將板孔孵育15分鐘。用150μl PBS/孔替代溶液。
      激動(dòng)劑內(nèi)化的定量使用購(gòu)自Cellomics公司的裝備有購(gòu)自美國(guó)佛蒙特州Omega Optical公司的濾光片的ArrayScan 4.0定量激動(dòng)劑內(nèi)化。該機(jī)器裝備有倒置熒光顯微鏡并使得能自動(dòng)聚焦到樣品上并能從制備于透明底部的96孔板中的樣品獲得圖像。在該讀出裝置中,整合了用于圖像分析的軟件,該軟件鑒定預(yù)先確定的目標(biāo)類(lèi)型的定位。
      此處用于實(shí)施例1到4的分析方法(算法)稱(chēng)為“受體內(nèi)化(ReceptorInternalization)”。分析基于兩個(gè)圖像,所述圖像獲取自不同的濾光片設(shè)置并用DNA特異性熒光團(tuán)和受體特異性熒光團(tuán)染色的樣品。從兩個(gè)圖像可確定目標(biāo)。從第一圖像即DNA特異性染色,細(xì)胞核的數(shù)量、位置、大小及形狀得以測(cè)定。從第二個(gè)圖像,由集中的受體特異性熒光團(tuán)(即所謂的ERCs)組成的目標(biāo)的位置、大小、形狀和強(qiáng)度得以測(cè)定。為了分析兩個(gè)圖像,目標(biāo)的強(qiáng)度、大小和形狀的某些限度可以由使用者調(diào)整。這使得對(duì)于目的目標(biāo)能選擇性地鑒別并定量不同的參數(shù)。
      關(guān)于用于當(dāng)前實(shí)施例的濾光片設(shè)置的更多細(xì)節(jié),見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法的末尾列表。
      數(shù)據(jù)分析通過(guò)使用購(gòu)自GraphPad Software公司的GraphPad Prism 3.02軟件,測(cè)定非熒光配體對(duì)受體介導(dǎo)的熒光配體的內(nèi)化的抑制作用的IC50值。
      實(shí)施例2使用Atto590-SST14的hSSTR5內(nèi)化用于制備96孔板中固定的、雙染色的SSTR-5細(xì)胞群,及隨后用高內(nèi)涵篩選定量?jī)?nèi)化的方法。細(xì)胞染料Hoechst 33258(用于細(xì)胞核染色)和Atto590-SST14。
      用于該檢測(cè)法的細(xì)胞系包括CHO細(xì)胞,該細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)重組的人生長(zhǎng)抑素5(根據(jù)Rocheville等,2000年,J.Biol.Chem.第275期,7862-7869頁(yè)產(chǎn)生)。
      作為熒光激動(dòng)劑,使用熒光團(tuán)Atto590連接至其N(xiāo)端的生長(zhǎng)抑素Atto590-AGC*KNFF-D-Trp-KTFTSC*-COOH(Seq ID No.9)*表示半胱氨酸橋的形成具有連接在N端上的熒光團(tuán)Atto590(Atto-tec)的生長(zhǎng)抑素-14類(lèi)似物(Atto590-SS14)通過(guò)柏林Biosynthan公司定制合成。
      儲(chǔ)備溶液1.8x Hoechst溶液9μM Hoechst33258I-緩沖液9x競(jìng)爭(zhēng)劑溶液9x SST14(Bachem目錄號(hào)H-1490)稀釋系列,制備于I-緩沖液中。
      通過(guò)在I-緩沖液中稀釋新鮮制備
      9x熒光配體溶液900nm Atto590-SST14通過(guò)在I-緩沖液中稀釋新鮮制備PBS如上面和實(shí)施例1中描述制備樣品,Atto590-SST14用作熒光團(tuán)激動(dòng)劑。如實(shí)施例1中描述定量配體內(nèi)化。
      圖1顯示SSTR-5表達(dá)細(xì)胞的圖像,該細(xì)胞已經(jīng)與Atto590-SST14孵育并額外用結(jié)合DNA的熒光團(tuán)Hoechst染料染色。圖像用CellomicsArrayScan Reader 4.0獲得。
      圖A表示與Atto590-SST14孵育的細(xì)胞,該圖用Atto590熒光選擇性濾光片設(shè)置獲得。圖B中是同一樣品的圖像,該圖像通過(guò)Hoechst選擇性濾光片獲得,表明細(xì)胞核的位置。在兩個(gè)圖像的重疊圖中,可看見(jiàn)熒光配體作為點(diǎn)很近地定位于細(xì)胞核周?chē)?。明顯地集中在內(nèi)質(zhì)循環(huán)區(qū)室(ERCs)中。
      因?yàn)榕c過(guò)量的SST14共孵育(圖C和D)阻礙了熒光ERCs的形成,所以Atto590-SST14轉(zhuǎn)位入細(xì)胞質(zhì)區(qū)室很大程度上是受體特異性的。
      使用高內(nèi)涵篩選讀出裝置如ArrayScan 4.0,可以定量在點(diǎn)中集中的熒光強(qiáng)度差異。在本實(shí)施例中,應(yīng)用了受體內(nèi)化算法(Cellomics公司)。該軟件能夠確定圖像中較亮目標(biāo)如細(xì)胞核及點(diǎn)的位置、大小、形狀和強(qiáng)度?;诜謩e是Hoechst選擇性和熒光配體選擇性的兩個(gè)圖像,該算法鑒定細(xì)胞核的數(shù)目并定量位于鑒定的ERCs中的熒光強(qiáng)度。圖2介紹了這些如何能用于檢測(cè)受體競(jìng)爭(zhēng)性配體的存在。漸增的SST14濃度以劑量依賴的方式減少了由HCS讀出裝置檢測(cè)到的內(nèi)化的Atto590-SST14數(shù)量。
      計(jì)算IC50值。在三個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)中,平均的IC50值測(cè)定為70mM+/-20nM(n=3),表示受體藥理學(xué)可以以可重復(fù)的方式研究。濾光片設(shè)置如表1表示。
      實(shí)施例3hNK3R與Atto655-NKR的內(nèi)化對(duì)于該實(shí)施例,使用穩(wěn)定表達(dá)NK3受體的CHO細(xì)胞(用NK3受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞在Gether等,1992年,F(xiàn)EBS Lett,296,241-244中描述)。
      使用的細(xì)胞染料Hoechst 33258(用于細(xì)胞核染色)樣品的制備和測(cè)量如實(shí)施例1中進(jìn)行,并作以下修改作為熒光配體,將神經(jīng)激肽B(NKB)類(lèi)似物用熒光團(tuán)Atto655(sAtto-tec,目錄號(hào)AD 655-4)標(biāo)記。
      熒光NKB類(lèi)似物具有下式結(jié)構(gòu) (Seq ID No.11)在神經(jīng)激肽B類(lèi)似物中,NKB的第7位氨基酸用甲基苯丙氨酸替代并且第1位氨基酸用半胱氨酸替代。Atto655連接至半胱氨酸側(cè)鏈上。
      該肽由柏林Biosynthan公司定制合成。根據(jù)以下方法將熒光團(tuán)Atto655(Atto-tec,目錄號(hào)AD 655-4)共價(jià)連接到半胱氨酸側(cè)鏈上將含巰基肽以終濃度1-10mM溶于9∶1的DMSO∶50mM磷酸鹽緩沖液pH6中。滴加入熒光團(tuán)試劑(10-50mM,在DMSO中新鮮制備)并讓混合物室溫下反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)進(jìn)行后用RP-HPLC分析樣品。最后通過(guò)RP-HPLC分離熒光標(biāo)記的肽。
      通過(guò)將少量的樣品再注射至HPLC中,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物為>90%的純度。分子量由質(zhì)譜測(cè)定為1908.8Da。
      熒光劑分子量為650Da并且反應(yīng)基團(tuán)為馬來(lái)酰亞胺。熒光團(tuán)的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)未知。根據(jù)這些信息計(jì)算得到的Atto655-NKB分子量為1909Da。
      溶液9x熒光配體溶液9nM Atto655-NKB通過(guò)在I-緩沖液中新鮮制備9x競(jìng)爭(zhēng)劑溶液
      9x稀釋系列,在I-緩沖液中制備通過(guò)在I-緩沖液中稀釋新鮮制備檢測(cè)法如實(shí)施例1中描述進(jìn)行。Atto655-NKB用作熒光團(tuán)激動(dòng)劑。如實(shí)施例1中描述定量激動(dòng)劑內(nèi)化。
      為了定量配體內(nèi)化,使用下列濾光片設(shè)置Omega濾光片,XF93hoechst和XF110 Cy5。
      圖3顯示了NK3R表達(dá)細(xì)胞的圖像,該細(xì)胞已經(jīng)與Atto655-NKB和Hoechst 33258染料孵育。用Cellomics ArrayScan Reader 4.0獲得圖像。
      圖A表示與Atto655-NKB孵育的細(xì)胞,該圖片用Atto655熒光選擇性濾光片設(shè)置獲得。圖B中是同一樣品的熒光圖像,該圖像通過(guò)Hoechst選擇性濾光片獲得,表明細(xì)胞核的位置。當(dāng)重疊兩個(gè)圖像時(shí),可清楚地看見(jiàn)熒光配體作為點(diǎn)很近地位于細(xì)胞核周?chē)?。明顯地集中在內(nèi)質(zhì)循環(huán)區(qū)室(ERCs)中。
      因?yàn)橛眠^(guò)量的NK3R非肽拮抗劑SB222200共同孵育(圖C和D)阻礙了熒光ERCs的形成,所以Atto655-NKB轉(zhuǎn)位入細(xì)胞質(zhì)區(qū)室很大程度上是受體特異性的。在該實(shí)施例中受體表達(dá)細(xì)胞明顯地僅構(gòu)成全部細(xì)胞群的小部分(20-30%)。
      如實(shí)施例1描述,可用高內(nèi)涵篩選讀出裝置定量?jī)?nèi)化的配體量。該實(shí)施例闡明即使對(duì)于其中僅小量細(xì)胞群明顯表達(dá)NK3受體的細(xì)胞樣品,內(nèi)化的配體的定量也可以完成。圖4展現(xiàn)了SB222200漸增的濃度如何以劑量依賴的方式減少了由HCS讀出裝置檢測(cè)到的內(nèi)化的Atto655-NKB的量。
      在兩個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)中,平均的IC50值測(cè)定為10nM+/-8nM(N=2),表示受體藥理學(xué)可以以可重復(fù)的方式研究。
      實(shí)施例4GHSR-1a與生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅的內(nèi)化對(duì)于該實(shí)施例,使用穩(wěn)定表達(dá)GHSR-1a受體的人胚腎(HEK293)細(xì)胞。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法(見(jiàn)例如Lindemann等,2005年,Genomics第85期,372-385頁(yè);J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis,MolecularCloninga Laboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,紐約,1989年;Casademunt等,EMBO J.18期(1999年)6050-6061頁(yè))產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)GHSR-1a的細(xì)胞。
      使用的細(xì)胞染料Hoechst 33258(用于細(xì)胞核的染色)樣品的制備及測(cè)量如實(shí)施例1進(jìn)行,并做如下修改使用用熒光團(tuán)德克薩斯紅(Molecular Probes)標(biāo)記的截短的生長(zhǎng)激素釋放激素類(lèi)似物作為熒光配體。
      該熒光生長(zhǎng)激素釋放激素類(lèi)似物具有下式結(jié)構(gòu) 將生長(zhǎng)激素釋放激素類(lèi)似物從第19位氨基酸后截除并用半胱氨酸替代第19位氨基酸(見(jiàn)Seq ID No.10)。根據(jù)前面描述的方法(見(jiàn)EP 1524274)合成該肽并將德克薩斯紅結(jié)合至半胱氨酸側(cè)鏈上。
      使用非肽配體MK0677(WO94113696)作為競(jìng)爭(zhēng)劑。
      溶液9x熒光配體溶液90nM生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)德克薩斯紅通過(guò)在I-緩沖液中新鮮制備9x競(jìng)爭(zhēng)劑溶液9x稀釋系列,在I-緩沖液中制備通過(guò)在I-緩沖液中稀釋新鮮制備該檢測(cè)法如實(shí)施例1中描述進(jìn)行。生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅用作熒光團(tuán)-激動(dòng)劑。如實(shí)施例1中描述定量激動(dòng)劑內(nèi)化。
      為了定量配體內(nèi)化,使用以下濾光片設(shè)置Omega濾光片,XF53 hoechst及XF53 TxR。
      圖7顯示了GHSR-1a表達(dá)細(xì)胞的圖像,該細(xì)胞已經(jīng)與生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅和Hoechst 33258染料孵育。用CellomicsArrayScan Reader 4.0獲得圖像。
      圖A表示與生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅孵育的細(xì)胞,該圖片用德克薩斯紅熒光選擇性濾光片設(shè)置獲得。圖B中是同一樣品的熒光圖像,該圖像通過(guò)Hoechst選擇性濾光片獲得,表明細(xì)胞核的位置。當(dāng)重疊兩個(gè)圖像時(shí),可清楚地看見(jiàn)熒光配體作為點(diǎn)很近地位于細(xì)胞核周?chē)C黠@地集中在內(nèi)質(zhì)循環(huán)區(qū)室(ERCs)中。
      因?yàn)橛眠^(guò)量的GHSR-1a非肽拮抗劑MK0677共同孵育(圖C和D)阻礙了熒光ERCs的形成,所以生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅轉(zhuǎn)位入細(xì)胞質(zhì)區(qū)室很大程度上是受體特異性的。
      如實(shí)施例1描述,可用高內(nèi)涵篩選讀出裝置定量?jī)?nèi)化的配體量。該實(shí)施例闡明即使對(duì)于其中僅小量細(xì)胞群明顯表達(dá)GHSR-1a受體的細(xì)胞樣品,內(nèi)化的配體的定量也可以完成。圖8展現(xiàn)了MK0677漸增的濃度如何以劑量依賴的方式減少了由HCS讀出裝置檢測(cè)到的內(nèi)化的生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)-德克薩斯紅的量。
      在兩個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)中,平均的IC50值測(cè)定為11nM+/-4nM(N=4),表示受體藥理學(xué)可以以可重復(fù)的方式研究。
      實(shí)施例5hV1bR與BO-TMR-加壓素的內(nèi)化對(duì)于該實(shí)施例,使用穩(wěn)定表達(dá)V1b受體的CHO細(xì)胞。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法(見(jiàn)例如Lindemann等,2005年,Genomics 85期,372-385頁(yè);J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloninga LaboratoryMannual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,紐約,1989年;Casademunt等,EMBO J.18期(1999年)6050-6061頁(yè))產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)V1b的細(xì)胞。
      使用的細(xì)胞染料Hoechst 33258(用于細(xì)胞核的染色)樣品的制備及測(cè)量如實(shí)施例1進(jìn)行,并做如下修改使用用熒光團(tuán)BODIPY-TMR標(biāo)記的加壓素類(lèi)似物作為熒光配體(熒光配體購(gòu)自Perkin Elmer公司,為熒光極化試劑盒FPA 120的一部分)。
      沒(méi)有提供該肽的序列或結(jié)構(gòu)。
      使用Arg-8加壓素(加壓素位置8是Arg)作為競(jìng)爭(zhēng)劑。
      加壓素的序列如Seq ID No.7所示。
      溶液9x熒光配體溶液5nM BO-TMR-加壓素通過(guò)在I-緩沖液中新鮮制備9x競(jìng)爭(zhēng)劑溶液9x稀釋系列,在I-緩沖液中制備通過(guò)在I-緩沖液中稀釋新鮮制備該檢測(cè)法如實(shí)施例1中描述進(jìn)行。BO-TMR-加壓素用作熒光團(tuán)-激動(dòng)劑。如實(shí)施例1中描述定量激動(dòng)劑內(nèi)化。
      為了定量配體內(nèi)化,使用以下濾光片設(shè)置Omega濾光片,XF93 hoechst及TRITC。
      圖9顯示了V1bR表達(dá)細(xì)胞的圖像,該細(xì)胞已經(jīng)與BO-TMR-加壓素和Hoechst 33258染料孵育。用Cellomics ArrayScan Reader 4.0獲得圖像。
      圖A表示與BO-TMR-加壓素孵育的細(xì)胞,該圖片用BO-TMR熒光選擇性濾光片設(shè)置獲得。圖B中是同一樣品的熒光圖像,該圖像通過(guò)Hoechst選擇性濾光片獲得,表明細(xì)胞核的位置。當(dāng)重疊兩個(gè)圖像時(shí),可清楚地看見(jiàn)熒光配體作為點(diǎn)很近地位于細(xì)胞核周?chē)?。明顯地集中在內(nèi)質(zhì)循環(huán)區(qū)室(ERCs)中。
      因?yàn)橛眠^(guò)量的V1bR肽激動(dòng)劑Arg-8加壓素共同孵育(圖C和D)阻礙了熒光ERCs的形成,所以BO-TMR-加壓素轉(zhuǎn)位入細(xì)胞質(zhì)部位很大程度上是受體特異性的。
      如實(shí)施例1描述,可用高內(nèi)涵篩選讀出裝置定量?jī)?nèi)化的配體量。該實(shí)施例闡明即使對(duì)于其中僅小量細(xì)胞群明顯表達(dá)V1b受體的細(xì)胞樣品,內(nèi)化的配體的定量也可以完成。圖10展現(xiàn)了Arg-8加壓素漸增的濃度如何以劑量依賴的方式減少了由HCS讀出裝置檢測(cè)到的內(nèi)化的BO-TMR-加壓素的量。
      在兩個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)法中,兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中平均的IC50值分別測(cè)定為5nM和15nM,表示受體藥理學(xué)可以以可重復(fù)的方式研究。
      實(shí)施例6在NK3及SSTR5表達(dá)細(xì)胞系中內(nèi)化的多位方法多位方法描述的是需要多于一個(gè)獨(dú)立的參數(shù)用于讀出信息的檢測(cè)法。通過(guò)高內(nèi)涵篩選,基于圖像的分析直接將某個(gè)測(cè)定的光學(xué)信號(hào)賦予單獨(dú)的被鑒定細(xì)胞。這使得多位方法可用于單種細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)事件,或可用于異種細(xì)胞混合物中的多個(gè)事件,其中細(xì)胞亞群可產(chǎn)生不同反應(yīng)。
      在該實(shí)施例中闡述了高內(nèi)涵篩選可進(jìn)行多位方法,通過(guò)在同一板孔中混合兩種用于不同GPCRs的內(nèi)化檢測(cè)法實(shí)施。這里應(yīng)用的方法是使用具有熒光光譜的受體特異性熒光配體,這使得可獲得對(duì)每個(gè)獨(dú)立配體有選擇性的圖像。
      除了在同一板孔中共同接種兩種細(xì)胞系并與多于一種熒光配體同時(shí)孵育以外,根據(jù)實(shí)施例1到3進(jìn)行用于NK3R和SSTR-5的多位檢測(cè)法。為了分析,必須獲得同一視場(chǎng)的三個(gè)圖像而不是兩個(gè)圖像一個(gè)是細(xì)胞核的Hoechst染色圖像,第二個(gè)是Atto590熒光特異性圖像以及第三個(gè)為Atto655熒光特異性圖像。
      對(duì)于多位方法,將在實(shí)施例2和3中描述的兩個(gè)細(xì)胞系在96孔板中如上描述共同接種24小時(shí)。和用于單獨(dú)受體內(nèi)化一樣,使用相同濃度的儲(chǔ)備溶液并調(diào)整體積以滿足另外的競(jìng)爭(zhēng)劑和熒光配體溶液。
      為了用購(gòu)自美國(guó)佛蒙特州Omega Optical公司的ArrayScan 4.0來(lái)定量配體內(nèi)化,使用了Omega濾光片。在同一樣品上進(jìn)行了兩次掃描第1次掃描“XF93 hoechst”和“XF93 Cy5”(檢測(cè)內(nèi)化的Atto655-NKB),第2次掃描“XF53 hoechst”和“XF53 TxR”(檢測(cè)內(nèi)化的Atto590-SSTR14)。
      圖5顯示了與SSTR-5細(xì)胞混合的NK3R表達(dá)細(xì)胞的圖像,該混合細(xì)胞已經(jīng)與Atto590-SSTR14、Atto655-NKB及Hoechst染料孵育。圖像通過(guò)使用Cellomics ArrayScan Reader 4.0獲得。
      圖5中每一行圖像為在一個(gè)樣品中同一視場(chǎng)內(nèi)獲得,獲取圖像時(shí)采用三個(gè)不同的濾光片設(shè)置,該設(shè)置使得可實(shí)質(zhì)上選擇性地檢測(cè)單獨(dú)的熒光團(tuán)Hoechst(C、F、I和L)、Atto590(B、E、H和K)及Atto655(A、D、G和J)。在第一個(gè)樣品中(圖像A、B和C),NK3R表達(dá)細(xì)胞和SSTR5表達(dá)細(xì)胞都用內(nèi)化的配體染色,內(nèi)化配體分別是Atto655-NKB(A)和Atto590-SST14(B)。正如期望的,因?yàn)閱畏N細(xì)胞僅表達(dá)其中一種受體,兩種染色之間沒(méi)有觀察到顯著的交疊。在接下來(lái)的第二和第三行中的兩個(gè)樣品圖像組中,闡述了受體介導(dǎo)的熒光配體的內(nèi)化如何能通過(guò)受體特異性非熒光競(jìng)爭(zhēng)劑以選擇性的方式阻斷。因而過(guò)量的NK3R拮抗劑SB222200對(duì)SSTR-5沒(méi)有影響(E)卻阻礙了NK3R介導(dǎo)的熒光配體的內(nèi)化(D)。同樣當(dāng)加入過(guò)量的SST14時(shí),能以選擇性的方式抑制SSTR-5的內(nèi)化(G、H)。在最后一行中(J、K和L),顯示了兩種競(jìng)爭(zhēng)劑的混合物同時(shí)阻礙了NK3R和SSTR-5的內(nèi)化。
      在圖6中顯示了圖像的定量,該圖片通過(guò)如上面介紹的濾光片并取自同一樣品,該濾光片使得可實(shí)質(zhì)上選擇性地檢測(cè)其中一種熒光配體。在圖像A中,增加SB222200的量減少了定位于ERCs中的Atto655-NKB的熒光強(qiáng)度而內(nèi)化的Atto590-SST14的量未受影響。抑制Atto655-NKB內(nèi)化的IC50值測(cè)定為21nM,該值與實(shí)施例2中介紹的單獨(dú)的NK3配體示蹤系統(tǒng)得到的IC50值很好地符合。在B中,情況相反,這里SST14減少了Atto590-SST14的ERC強(qiáng)度,而ERCs中的Atto655-NKB強(qiáng)度未變。抑制Atto590-SST14內(nèi)化的IC50值為36nM,該值與實(shí)施例2中介紹的SSTR-5系統(tǒng)中得到的值關(guān)聯(lián)得很好。
      序列表&lt;110&gt;弗·哈夫曼-拉羅切有限公司&lt;120&gt;配體-受體示蹤測(cè)定法&lt;130&gt;22817&lt;160&gt;11&lt;170&gt;PatentIn版本3.3&lt;210&gt;1&lt;211&gt;364&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人(Homo sapiens)&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;生長(zhǎng)抑素受體5&lt;222&gt;(1)..(364)&lt;223&gt;SSTR 5;基因座ID6755&lt;400&gt;1Met Glu Pro Leu Phe Pro Ala Ser Thr Pro Ser Trp Ash Ala Ser Ser1 5 10 15Pro Gly Ala Ala Ser Gly Gly Gly Asp Asn Arg Thr Leu Val Gly Pro20 25 30Ala Pro Ser Ala Gly Ala Arg Ala Val Leu Val Pro Val Leu Tyr Leu35 40 45Leu Val Cys Ala Ala Gly Leu Gly Gly Asn Thr Leu Val Ile Tyr Val50 55 60Val Leu Arg Phe Ala Lys Met Lys Thr Val Thr Asn Ile Tyr Ile Leu65 70 75 80
      Asn Leu Ala Val Ala Asp Val Leu Tyr Met Leu Gly Leu Pro Phe Leu85 90 95Ala Thr Gln Asn Ala Ala Ser Phe Trp Pro Phe Gly Pro Val Leu Cys100 105 110Arg Leu Val Met Thr Leu Asp Gly Val Asn Gln Phe Thr Ser Val Phe115 120 125Cys Leu Thr Val Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Val His Pro130 135 140Leu Ser Ser Ala Arg Trp Arg Arg Pro Arg Val Ala Lys Leu Ala Ser145 150 155 160Ala Ala Ala Trp Val Leu Ser Leu Cys Met Ser Leu Pro Leu Leu Val165 170 175Phe Ala Asp Val Gln Glu Gly Gly Thr Cys Asn Ala Ser Trp Pro Glu180 185 190Pro Val Gly Leu Trp Gly Ala Val Phe Ile Ile Tyr Thr Ala Val Leu195 200 205Gly Phe Phe Ala Pro Leu Leu Val Ile Cys Leu Cys Tyr Leu Leu Ile210 215 220Val Val Lys Val Arg Ala Ala Gly Val Arg Val Gly Cys Val Arg Arg225 230 235 240Arg Ser Glu Arg Lys Val Thr Arg Met Val Leu Val Val Val Leu Val245 250 255
      Phe Ala Gly Cys Trp Leu Pro Phe Phe Thr Val Asn Ile Val Asn Leu260 265 270Ala Val Ala Leu Pro Gln Glu Pro Ala Ser Ala Gly Leu Tyr Phe Phe275 280 285Val Val Ile Leu Ser Tyr Ala Asn Ser Cys Ala Asn Pro Val Leu Tyr290 295 300Gly Phe Leu Ser Asp Asn Phe Arg Gln Ser Phe Gln Lys Val Leu Cys305 310 315 320Leu Arg Lys Gly Ser Gly Ala Lys Asp Ala Asp Ala Thr Glu Pro Arg325 330 335Pro Asp Arg Ile Arg Gln Gln Gln Glu Ala Thr Pro Pro Ala His Arg340 345 350Ala Ala Ala Asn Gly Leu Met Gln Thr Ser Lys Leu355 360&lt;210&gt;2&lt;211&gt;366&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;生長(zhǎng)激素促分泌素受體la&lt;222&gt;(1)..(366)&lt;223&gt;GHSR 1a;基因座ID2693&lt;400&gt;2Met Trp Asn Ala Thr Pro Ser Glu Glu Pro Gly Phe Asn Leu Thr Leu
      1 5 10 15Ala Asp Leu Asp Trp Asp Ala Ser Pro Gly Asn Asp Ser Leu Gly Asp20 25 30Glu Leu Leu Gln Leu Phe Pro Ala Pro Leu Leu Ala Gly Val Thr Ala35 40 45Thr Cys Val Ala Leu Phe Val Val Gly Ile Ala Gly Asn Leu Leu Thr50 55 60Met Leu Val Val Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Thr Thr Thr Asn Leu65 70 75 80Tyr Leu Ser Ser Met Ala Phe Ser Asp Leu Leu Ile Phe Leu Cys Met85 90 95Pro Leu Asp Leu Val Arg Leu Trp Gln Tyr Arg Pro Trp Asn Phe Gly100 105 110Asp Leu Leu Cys Lys Leu Phe Gln Phe Val Ser Glu Ser Cys Thr Tyr115 120 125Ala Thr Val Leu Thr Ile Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Phe Ala130 135 140Ile Cys Phe Pro Leu Arg Ala Lys Val Val Val Thr Lys Gly Arg Val145 150 155 160Lys Leu Val Ile Phe Val Ile Trp Ala Val Ala Phe Cys Ser Ala Gly165 170 175Pro Ile Phe Val Leu Val Gly Val Glu His Glu Asn Gly Thr Asp Pro
      180 185 190Trp Asp Thr Asn Glu Cys Arg Pro Thr Glu Phe Ala Val Arg Ser Gly195 200 205Leu Leu Thr Val Met Val Trp Val Ser Ser Ile Phe Phe Phe Leu Pro210 215 220Val Phe Cys Leu Thr Val Leu Tyr Ser Leu Ile Gly Arg Lys Leu Trp225 230 235 240Arg Arg Arg Arg Gly Asp Ala Val Val Gly Ala Ser Leu Arg Asp Gln245 250 255Asn His Lys Gln Thr Val Lys Met Leu Ala Val Val Val Phe Ala Phe260 265 270Ile Leu Cys Trp Leu Pro Phe His Val Gly Arg Tyr Leu Phe Ser Lys275 280 285Ser Phe Glu Pro Gly Ser Leu Glu Ile Ala Gln Ile Ser Gln Tyr Cys290 295 300Asn Leu Val Ser Phe Val Leu Phe Tyr Leu Ser Ala Ala Ile Asn Pro305 310 315 320Ile Leu Tyr Asn Ile Met Ser Lys Lys Tyr Arg Val Ala Val Phe Arg325 330 335Leu Leu Gly Phe Glu Pro Phe Ser Gln Arg Lys Leu Ser Thr Leu Lys340 345 350Asp Glu Ser Ser Arg Ala Trp Thr Glu Ser Ser Ile Asn Thr
      355 360 365&lt;210&gt;3&lt;211&gt;424&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;加壓素受體lB&lt;222&gt;(1)..(424)&lt;223&gt;基因座ID553&lt;400&gt;3Met Asp Ser Gly Pro Leu Trp Asp Ala Asn Pro Thr Pro Arg Gly Thr1 5 10 15Leu Ser Ala Pro Asn Ala Thr Thr Pro Trp Leu Gly Arg Asp Glu Glu20 25 30Leu Ala Lys Val Glu Ile Gly Val Leu Ala Thr Val Leu Val Leu Ala35 40 45Thr Gly Gly Asn Leu Ala Val Leu Leu Thr Leu Gly Gln Leu Gly Arg50 55 60Lys Arg Ser Arg Met His Leu Phe Val Leu His Leu Ala Leu Thr Asp65 70 75 80Leu Ala Val Ala Leu Phe Gln Val Leu Pro Gln Leu Leu Trp Asp Ile85 90 95Thr Tyr Arg Phe Gln Gly Pro Asp Leu Leu Cys Arg Ala Val Lys Tyr100 105 110
      Leu Gln Val Leu Ser Met Phe Ala Ser Thr Tyr Met Leu Leu Ala Met115 120 125Thr Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Val Cys His Pro Leu Arg Ser Leu Gln130 135 140Gln Pro Gly Gln Ser Thr Tyr Leu Leu Ile Ala Ala Pro Trp Leu Leu145 150 155 160Ala Ala Ile Phe Ser Leu Pro Gln Val Phe Ile Phe Ser Leu Arg Glu165 170 175Val Ile Gln Gly Ser Gly Val Leu Asp Cys Trp Ala Asp Phe Gly Phe180 185 190Pro Trp Gly Pro Arg Ala Tyr Leu Thr Trp Thr Thr Leu Ala Ile Phe195 200 205Val Leu Pro Val Thr Met Leu Thr Ala Cys Tyr Ser Leu Ile Cys His210 215 220Glu Ile Cys Lys Asn Leu Lys Val Lys Thr Gln Ala Trp Arg Val Gly225 230 235 240Gly Gly Gly Trp Arg Thr Trp Asp Arg Pro Ser Pro Ser Thr Leu Ala245 250 255Ala Thr Thr Arg Gly Leu Pro Ser Arg Val Ser Ser Ile Asn Thr Ile260 265 270Ser Arg Ala Lys Ile Arg Thr Val Lys Met Thr Phe Val Ile Val Leu275 280 285
      Ala Tyr Ile Ala Cys Trp Ala Pro Phe Phe Ser Val Gln Met Trp Ser290 295 300Val Trp Asp Lys Asn Ala Pro Asp Glu Asp Ser Thr Asn Val Ala Phe305 310 315 320Thr IIe Ser Met Leu Leu Gly Asn Leu Asn Ser Cys Cys Asn Pro Trp325 330 335Ile Tyr Met Gly Phe Asn Ser His Leu Leu Pro Arg Pro Leu Arg His340 345 350Leu Ala Cys Cys Gly Gly Pro Gln Pro Arg Met Arg Arg Arg Leu Ser355 360 365Asp Gly Ser Leu Ser Ser Arg His Thr Thr Leu Leu Thr Arg Ser Ser370 375 380Cys Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Leu Ser Leu Thr Leu Ser Gly Arg385 390 395 400Pro Arg Pro Glu Glu Ser Pro Arg Asp Leu Glu Leu Ala Asp Gly Glu405 410 415Gly Thr Ala Glu Thr Ile Ile Phe420&lt;210&gt;4&lt;211&gt;465&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;神經(jīng)激肽3受體
      &lt;222&gt;(1)..(465)&lt;223&gt;NK3R;基因座ID6870&lt;400&gt;4Met Ala Thr Leu Pro Ala Ala Glu Thr Trp Ile Asp Gly Gly Gly Gly1 5 10 15Val Gly Ala Asp Ala Val Asn Leu Thr Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala20 25 30Ala Thr Gly Ala Val Glu Thr Gly Trp Leu Gln Leu Leu Asp Gln Ala35 40 45Gly Asn Leu Ser Ser Ser Pro Ser Ala Leu Gly Leu Pro Val Ala Ser50 55 60Pro Ala Pro Ser Gln Pro Trp Ala Asn Leu Thr Asn Gln Phe Val Gln65 70 75 80Pro Ser Trp Arg Ile Ala Leu Trp Ser Leu Ala Tyr Gly Val Val Val85 90 95Ala Val Ala Val Leu Gly Asn Leu Ile Val Ile Trp Ile Ile Leu Ala100 105 110His Lys Arg Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Leu Val Asn Leu Ala115 120 125Phe Ser Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Asn Thr Leu Val Asn Phe Ile130 135 140Tyr Ala Leu His Ser Glu Trp Tyr Phe Gly Ala Asn Tyr Cys Arg Phe145 150 155 160
      Gln Asn Phe Phe Pro Ile Thr Ala Val Phe Ala Ser Ile Tyr Ser Met165 170 175Thr Ala Ile Ala Val Asp Arg Tyr Met Ala Ile Ile Asp Pro Leu Lys180 185 190Pro Arg Leu Ser Ala Thr Ala Thr Lys Ile Val Ile Gly Ser Ile Trp195 200 205Ile Leu Ala Phe Leu Leu Ala Phe Pro Gln Cys Leu Tyr Ser Lys Thr210 215 220Lys Val Met Pro Gly Arg Thr Leu Cys Phe Val Gln Trp Pro Glu Gly225 230 235 240Pro Lys Gln His Phe Thr Tyr His Ile Ile Val Ile Ile Leu Val Tyr245 250 255Cys Phe Pro Leu Leu Ile Met Gly Ile Thr Tyr Thr Ile Val Gly Ile260 265 270Thr Leu Trp Gly Gly Glu Ile Pro Gly Asp Thr Cys Asp Lys Tyr His275 280 285Glu Gln Leu Lys Ala Lys Arg Lys Val Val Lys Met Met Ile Ile Val290 295 300Val Met Thr Phe Ala Ile Cys Trp Leu Pro Tyr His Ile Tyr Phe Ile305 310 315 320Leu Thr Ala Ile Tyr Gln Gln Leu Asn Arg Trp Lys Tyr Ile Gln Gln325 330 335
      Val Tyr Leu Ala Ser Phe Trp Leu Ala Met Ser Ser Thr Met Tyr Asn340 345 350Pro Ile Ile Tyr Cys Cys Leu Asn Lys Arg Phe Arg Ala Gly Phe Lys355 360 365Arg Ala Phe Arg Trp Cys Pro Phe Ile Lys Val Ser Ser Tyr Asp Glu370 375 380Leu Glu Leu Lys Thr Thr Arg Phe His Pro Asn Arg Gln Ser Ser Met385 390 395 400Tyr Thr Val Thr Arg Met Glu Ser Met Thr Val Val Phe Asp Pro Asn405 410 415Asp Ala Asp Thr Thr Arg Ser Ser Arg Lys Lys Arg Ala Thr Pro Arg420 425 430Asp Pro Ser Phe Asn Gly Cys Ser Arg Arg Asn Ser Lys Ser Ala Ser435 440 445Ala Thr Ser Ser Phe Ile Ser Ser Pro Tyr Thr Ser Val Asp Glu Tyr450 455 460Ser465&lt;210&gt;5&lt;211&gt;116&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;生長(zhǎng)抑素14&lt;222&gt;(1)..(116)&lt;223&gt;基因座ID6750&lt;400&gt;5Met Leu Ser Cys Arg Leu Gln Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Val1 5 10 15Leu Ala Leu Gly Cys Val Thr Gly Ala Pro Ser Asp Pro Arg Leu Arg20 25 30Gln Phe Leu Gln Lys Ser Leu Ala Ala Ala Ala Gly Lys Gln Glu Leu35 40 45Ala Lys Tyr Phe Leu Ala Glu Leu Leu Ser Glu Pro Asn Gln Thr Glu50 55 60Asn Asp Ala Leu Glu Pro Glu Asp Leu Ser Gln Ala Ala Glu Gln Asp65 70 75 80Glu Met Arg Leu Glu Leu Gln Arg Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met85 90 95Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr100 105 110Phe Thr Ser Cys115&lt;210&gt;6&lt;211&gt;117&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人
      &lt;220&gt;
      &lt;221&gt;生長(zhǎng)激素釋放激素前體&lt;222&gt;(1)..(117)&lt;223&gt;基因座ID51738&lt;400&gt;6Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110Ala Pro Ala Asp Lys115&lt;210&gt;7&lt;211&gt;164&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人
      &lt;220&gt;
      &lt;221&gt;加壓素(avp)&lt;222&gt;(1)..(164)&lt;223&gt;基因座ID551&lt;400&gt;7Met Pro Asp Thr Met Leu Pro Ala Cys Phe Leu Gly Leu Leu Ala Phe1 5 10 15Ser Ser Ala Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly Gly Lys Arg Ala20 25 30Met Ser Asp Leu Glu Leu Arg Gln Cys Leu Pro Cys Gly Pro Gly Gly35 40 45Lys Gly Arg Cys Phe Gly Pro Ser Ile Cys Cys Ala Asp Glu Leu Gly50 55 60Cys Phe Val Gly Thr Ala Glu Ala Leu Arg Cys Gln Glu Glu Asn Tyr65 70 75 80Leu Pro Ser Pro Cys Gln Ser Gly Gln Lys Ala Cys Gly Ser Gly Gly85 90 95Arg Cys Ala Ala Phe Gly Val Cys Cys Asn Asp Glu Ser Cys Val Thr100 105 110Glu Pro Glu Cys Arg Glu Gly Phe His Arg Arg Ala Arg Ala Ser Asp115 120 125Arg Ser Asn Ala Thr Gln Leu Asp Gly Pro Ala Gly Ala Leu Leu Leu130 135 140
      Arg Leu Val Gln Leu Ala Gly Ala Pro Glu Pro Phe Glu Pro Ala Gln145 150 155 160Pro Asp Ala Tyr&lt;210&gt;8&lt;211&gt;121&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;神經(jīng)激肽B&lt;222&gt;(1)..(121)&lt;223&gt;基因座ID6866&lt;400&gt;8Met Arg Ile Met Leu Leu Phe Thr Ala Ile Leu Ala Phe Ser Leu Ala1 5 10 15Gln Ser Phe Gly Ala Val Cys Lys Glu Pro Gln Glu Glu Val Val Pro20 25 30Gly Gly Gly Arg Ser Lys Arg Asp Pro Asp Leu Tyr Gln Leu Leu Gln35 40 45Arg Leu Phe Lys Ser His Ser Ser Leu Glu Gly Leu Leu Lys Ala Leu50 55 60Ser Gln Ala Ser Thr Asp Pro Lys Glu Ser Thr Ser Pro Glu Lys Arg65 70 75 80Asp Met His Asp Phe Phe Val Gly Leu Met Gly Lys Arg Ser Val Gln85 90 95
      Pro Asp Ser Pro Thr Asp Val Asn Gln Glu Asn Val Pro Ser Phe Gly100 105 110Ile Leu Lys Tyr Pro Pro Arg Ala Glu115 120&lt;210&gt;9&lt;211&gt;14&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;生長(zhǎng)抑素14&lt;222&gt;(1)..(14)&lt;223&gt;生長(zhǎng)抑素C端肽(103-117)二硫鍵在C(3)和C(14)之間&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;生長(zhǎng)抑素14&lt;222&gt;(8)..(8)&lt;223&gt;D-Trp&lt;400&gt;9Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys1 5 10&lt;210&gt;10&lt;211&gt;19&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)&lt;222&gt;(1)..(19)&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;生長(zhǎng)激素釋放激素(1-19)&lt;222&gt;(3)..(3)&lt;223&gt;辛?;苌锘駾apa-辛?;苌?amp;lt;400&gt;10Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Asn Arg Val Asn Asn Arg Lys1 5 10 15Glu Ser Cys&lt;210&gt;11&lt;211&gt;10&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;神經(jīng)激肽B肽&lt;222&gt;(1)..(10)&lt;220&gt;
      &lt;221&gt;神經(jīng)激肽B肽&lt;222&gt;(7)..(7)&lt;223&gt;Phe(7)=甲基-苯丙氨酸&lt;400&gt;11Cys Met His Asp Phe Phe Phe Gly Leu Met1 5 10
      權(quán)利要求
      1.用于高內(nèi)涵篩選化合物的多位方法,其中對(duì)表達(dá)至少一種靶標(biāo)受體的至少一種單細(xì)胞或至少一種細(xì)胞亞群或異種細(xì)胞群的至少一個(gè)細(xì)胞參數(shù)在存在或不存在化合物時(shí)進(jìn)行光學(xué)測(cè)量。
      2.權(quán)利要求1的方法,其中對(duì)至少兩個(gè)細(xì)胞參數(shù)進(jìn)行測(cè)量。
      3.權(quán)利要求1的方法,其中對(duì)至少三個(gè)細(xì)胞參數(shù)進(jìn)行測(cè)量。
      4.權(quán)利要求2或3的方法,其中對(duì)表達(dá)不同靶標(biāo)受體的至少兩種單細(xì)胞或兩種細(xì)胞亞群進(jìn)行測(cè)量。
      5.權(quán)利要求1到4中任意一項(xiàng)所述的多位方法,其中至少一個(gè)細(xì)胞參數(shù)是配體-受體復(fù)合物的示蹤,并且其中所述的配體-受體復(fù)合物通過(guò)光學(xué)檢測(cè)受標(biāo)記的配體或受標(biāo)記的受體得以示蹤。
      6.權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的多位方法,其中至少一個(gè)細(xì)胞參數(shù)是配體-受體內(nèi)化的示蹤,并且其中所述的配體-受體內(nèi)化通過(guò)光學(xué)檢測(cè)受標(biāo)記的配體或受標(biāo)記的受體得以示蹤。
      7.權(quán)利要求5或6所述的多位方法,其中所述的受標(biāo)記受體不包括融合有熒光蛋白的受體。
      8.權(quán)利要求5到7中任意一項(xiàng)所述的多位方法,其中所述的受標(biāo)記配體是連接有發(fā)光團(tuán)的配體。
      9.權(quán)利要求5到8中任意一項(xiàng)所述的多位方法,其中所述的受標(biāo)記受體是被特異性抗體結(jié)合的受體,并且其中所述抗體用可光學(xué)檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記。
      10.權(quán)利要求2到9中任意一項(xiàng)所述的多位方法,其中不同的細(xì)胞或細(xì)胞亞群獨(dú)立地表達(dá)能結(jié)合相同配體的不同靶標(biāo)受體。
      11.權(quán)利要求6到9中任意一項(xiàng)所述的多位方法,其中用兩種不同的能被獨(dú)立檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記的至少兩種不同配體的內(nèi)化在至少兩種不同細(xì)胞亞群中于存在或不存在化合物時(shí)得以測(cè)量,其中所述至少兩種不同細(xì)胞亞群獨(dú)立地表達(dá)至少兩種不同的靶標(biāo)受體。
      12.權(quán)利要求1到11中任意一項(xiàng)所述的多位篩選方法,其中至少一種靶標(biāo)受體是GPCR。
      13.權(quán)利要求1到12中任意一項(xiàng)所述的多位篩選方法,其中至少一種標(biāo)記物是熒光團(tuán)。
      14.發(fā)光團(tuán)標(biāo)記的誘導(dǎo)受體內(nèi)化的激動(dòng)劑的用途,用于在多位高內(nèi)涵篩選化合物中示蹤受體-配體。
      15.發(fā)光團(tuán)標(biāo)記的受體的用途,用于在多位高內(nèi)涵篩選化合物中示蹤受體-配體。
      16.發(fā)光團(tuán)標(biāo)記的針對(duì)GPCR的抗體的用途,用于在多位高內(nèi)涵篩選化合物中示蹤受體-配體。
      全文摘要
      本發(fā)明提供基于圖像的篩選化合物的方法,該方法基于測(cè)量熒光標(biāo)記的配體的內(nèi)化。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于高內(nèi)涵篩選化合物的多位方法,其中測(cè)量至少一個(gè)細(xì)胞參數(shù)。
      文檔編號(hào)G01N33/48GK1955715SQ200510116938
      公開(kāi)日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2005年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月25日
      發(fā)明者C·阿普費(fèi)爾, T·恩德勒, S·J·佐夫曼, M·莫塞爾 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
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