專(zhuān)利名稱(chēng)：重組赤羽病毒核衣殼蛋白、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組蛋白，尤其涉及一種重組赤羽病毒核衣殼蛋白、編碼該重組赤羽病毒核衣殼蛋白基因，該重組赤羽病毒核衣殼蛋白的制備方法及其在檢測(cè)或診斷赤羽病毒抗原中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
赤羽病毒，又稱(chēng)阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)是屬于布尼病毒科布尼病毒屬辛波病毒群的蟲(chóng)媒病毒，可引起牛、綿羊、山羊生產(chǎn)先天性畸形胎兒，以流、早、死產(chǎn)及先天性關(guān)節(jié)彎曲和積水性無(wú)腦癥(Arthrogryposis-Hydraencephaly，AH綜合癥)為特征。最初于1959年在日本群馬縣赤羽村牛舍內(nèi)采集的蚊蟲(chóng)Cules Tritaeniorhynchis和AedesVexans體內(nèi)分離得到AKAV病毒，故命名為赤羽病毒。
AKAV為單股負(fù)鏈RNA病毒，其核酸由大(L，約7000nt)、中(M，4309nt)、小(S，858nt)三個(gè)節(jié)段組成。L節(jié)段編碼L蛋白，其具有轉(zhuǎn)錄和復(fù)制活性；M節(jié)段編碼囊膜糖蛋白G1、G2和非結(jié)構(gòu)蛋白NSm；S節(jié)段編碼核衣殼蛋白N(702bp)和非結(jié)構(gòu)蛋白Ns(276bp)。對(duì)23個(gè)分離株(包括OBE-1株)，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，N蛋白氨基酸97％-100％同源，具有高度保守性，用OBE-1株制作的N蛋白單克隆抗體做ELISA顯示，所有株均有很高的反應(yīng)活性。
赤羽病在1972-1975年曾在日本關(guān)東以西大流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，在東亞、東南亞、中東及東非許多國(guó)家分離到病毒或檢測(cè)到陽(yáng)性抗體。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)臺(tái)灣及大陸許多地區(qū)也有本病流行，1996-1997年上海曾爆發(fā)本病，牛場(chǎng)中流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)和畸形的胎兒約占20％-30％，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本病在我國(guó)被列為二類(lèi)動(dòng)物傳染病，為重點(diǎn)檢疫對(duì)象。
最近臺(tái)灣的研究人員發(fā)現(xiàn)豬可自然感染AKAV，試驗(yàn)證明其可經(jīng)口鼻傳播，他們對(duì)1088頭豬進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，證實(shí)有816頭豬呈血清學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率達(dá)75％，而且仔豬體內(nèi)也可檢到中和抗體，表明豬可能成為AKAV生活史的一環(huán)。以往認(rèn)為成年牛感染AKAV無(wú)明顯癥狀，但最近報(bào)道成年牛感染可導(dǎo)致腦脊髓炎。綜上因素，未來(lái)防控本病的難度將加大，一旦暴發(fā)流行其損失也會(huì)更大。在目前本病還未在我國(guó)大流行之際，加強(qiáng)對(duì)其檢疫為最佳防控措施。
鑒于本病給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，加強(qiáng)對(duì)本病的診斷防治顯的尤為迫切。迄今，國(guó)內(nèi)報(bào)道的診斷方法有微量中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、以及PCR和ELISA診斷方法，這些方法均有其不足之處，或操作煩瑣，或易受母源抗體干擾，或?qū)夹g(shù)設(shè)備要求較高。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際的需要，應(yīng)用間接熒光抗體法直接檢測(cè)組織中的AKAV抗原是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、敏感性高的診斷方法。但該方法能夠應(yīng)用的前提是需要制備得到高特異性的AKAV抗原蛋白，并且該抗原蛋白還需具備易純化制備、成本低，不存在散毒的危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性高，易純化制備、成本低的重組AKAV核衣殼蛋白，該重組AKAV核衣殼蛋白可制備成抗體血清，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出組織中的AKAV抗原。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種重組AKAV核衣殼蛋白，具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種編碼上述重組AKAV核衣殼蛋白基因。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種編碼上述重組AKAV核衣殼蛋白基因，具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備本發(fā)明重組AKAV核衣殼蛋白的方法。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種制備本發(fā)明重組AKAV核衣殼蛋白的方法，包括以下步驟構(gòu)建重組AKAV核衣殼蛋白基因原核表達(dá)載體；用該重組AKAV核衣殼蛋白基因原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；誘導(dǎo)重組核衣殼蛋白表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組核衣殼蛋白。
將編碼AKAV核衣殼蛋白基因插入到原核表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使編碼AKAV核衣殼蛋白基因可操作的與原核表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將編碼AKAV核衣殼蛋白基因插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)上的BamHI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組核衣殼蛋白原核表達(dá)載體PET-N；將所得到的重組核衣殼蛋白原核表達(dá)載體通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)；用IPTG誘導(dǎo)重組AKAV核蛋白的表達(dá)，優(yōu)選的，用IPTG誘導(dǎo)重組AKAV核蛋白表達(dá)的條件如下菌液OD600nm值為0.5-0.6時(shí)開(kāi)始用濃度為0.6-1.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4-5小時(shí)。所表達(dá)的重組核衣殼蛋白可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法純化。本發(fā)明重組工程菌表達(dá)的約27ku(801bp)的重組蛋白為含有N基因氨基酸序列(699bp，19-26ku)及pET-28a(+)載體部分序列(102bp，約3ku)的融合蛋白。在pET-28a(+)部分有一His tag序列(含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸)，因此可用ProBondTMPurification System(含Ni2+)親和層析的方法純化重組蛋白。
本發(fā)明重組AKAV核衣殼蛋白能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)，所表達(dá)重組蛋白僅含約3kD的載體部分氨基酸，序列與天然蛋白接近，這為利用重組蛋白研究AKAV核衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了便利，也為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢出AKAV抗原及其他應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)Western blot、瓊擴(kuò)檢測(cè)和免疫熒光、ELISA應(yīng)用試驗(yàn)顯示，本發(fā)明重組AKAV核衣殼蛋白具有高度的免疫學(xué)活性，利用該重組蛋白制備成的抗血清，采用間接熒光抗體法可以快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出組織中的AKAV抗原。由該重組AKAV核衣殼蛋白制備成的抗血清與AKAV全病毒免疫制備的高免血清相比具有以下優(yōu)點(diǎn)抗原易純化制備、成本低(工程菌經(jīng)超聲波破碎高速離心后，高濃度的重組蛋白全部在上清，以水溶性形式存在，這使其可直接進(jìn)行純化獲得大量高純度的融合蛋白，避免了變性、復(fù)性等復(fù)雜程序)，且不存在散毒的危險(xiǎn)，最重要的是本發(fā)明重組AKAV核衣殼蛋白具有高度的特異性，保證了利用該重組蛋白檢測(cè)AKAV抗原方法的特異性。
圖1為重組質(zhì)粒PMD-S酶切及PCR鑒定；1λ-EcoT14I digest Marker；2EcoRI and SalI雙酶切；3PCR擴(kuò)增出的S片段；4PCR擴(kuò)增的水對(duì)照；5DL2000Marker。
圖2為重組質(zhì)粒PET-N酶切及PCR鑒定；1λ-EcoT14I digest Marker；2BamHI and XhoI雙酶切；3PCR擴(kuò)增出的N基因片段；4PCR擴(kuò)增的水對(duì)照；5DL2000Marker。
圖3為重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜；1蛋白Marker；2BL21菌對(duì)照；3IPTG誘導(dǎo)前轉(zhuǎn)化菌對(duì)照；4IPTG誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)化菌；5純化后的融合蛋白。
圖4為重組蛋白的Western blot分析；1蛋白Marker；2BL21菌對(duì)照；3IPTG誘導(dǎo)前轉(zhuǎn)化菌對(duì)照；4IPTG誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)化菌；5純化后的融合蛋白。
圖5為重組工程菌SDS-PAGE薄層掃描結(jié)果(最大峰為融合蛋白)；圖6為誘導(dǎo)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果；系列11～7為誘導(dǎo)時(shí)間1～個(gè)小時(shí)(D600nm＝0.60，IPTG＝1mM)；系列2開(kāi)始誘導(dǎo)時(shí)D600nm值，1～6分別為0.10，0.35，0.51，0.73，0.91，1.03(誘導(dǎo)3.5小時(shí)，IPTG＝1mM)；系列3IPTG(mM)量，1～8分別為0.05，0.1，0.3，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0(誘導(dǎo)3.5小時(shí)，D600nm＝0.61)。
圖7感染AKAV后的BHK21細(xì)胞和乳鼠腦組織及二者陰性對(duì)照在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)感染AKAV的細(xì)胞胞漿內(nèi)有陽(yáng)性熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照細(xì)胞則不能檢出。
a接毒的BHK21細(xì)胞；b陰性對(duì)照BHK21細(xì)胞；c攻毒鼠腦切片；d陰性對(duì)照鼠腦切片(1，2放大倍數(shù)200×；3，4放大倍數(shù)400×)。
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式
主要試驗(yàn)材料及來(lái)源1.1菌株種毒BHK21細(xì)胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；AKAV OBE-1株種毒及陽(yáng)性血清由日本農(nóng)林水產(chǎn)省動(dòng)物衛(wèi)生研究所惠贈(zèng)。
1.2主要試劑各種大腸桿菌株限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、pMD18-TVector、pET-28a(+)表達(dá)載體、DNA Marker均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量抽提試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)W5002以下同)、膠回收小量試劑盒(W5212)購(gòu)自上海華舜；RNeasyMini Kit(74106)、QAquickPCR Purification Kit(28104)購(gòu)自QIAGEN公司；蛋白Marker(SM0431)購(gòu)自Fermentas公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗牛IgG(A5295)購(gòu)自SIGMA公司；ProBondTMPurification System(K850-01)購(gòu)自Invitrogen公司。
1.3繁毒及TCID50測(cè)定將種毒接入BHK21細(xì)胞，待70％細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，將細(xì)胞凍融三次，1500g離心15分鐘，取上清用96孔板測(cè)定毒價(jià)為106TCID50/ml，分裝并于-80℃凍存。
重組AKAV核衣殼蛋白基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建用RNeasyMini Kit RNA抽提試劑盒提取AKAV總RNA，由賽百盛公司合成引物，擴(kuò)增S節(jié)段基因，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度840bp，引物序列p15-TAA CTA CGC ATT GCA ATG GC-3(SEQ ID NO3)；p25-AGT AGT GTGCTC CAC-3(SEQ ID NO4)。擴(kuò)增條件42℃ 1h，94℃ 5min變性后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃ 60s，55℃ 30s，72℃ 60s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。
用PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，涂布含氨芐青霉素(100ug/ml)、X-gale和IPTG的LB固體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取白色單菌落，接種至含氨芐青霉素(100ug/ml)的液體LB，于37℃搖床培養(yǎng)8小時(shí)后用試劑盒抽提質(zhì)粒，PCR、雙酶切鑒定正確后送上海博亞公司測(cè)序確認(rèn)，鑒定正確重組質(zhì)粒命名為PMD-S。用引物p1和p2、酶EcoRI和SalI對(duì)重組質(zhì)粒PMD-S進(jìn)行PCR和酶切鑒定(圖1)；結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果一致。
用設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，以PMD-S質(zhì)粒為模板亞克隆出N基因片段，引物序列p15-AGAGGA TCCATG GCA AAT CAA TTC-3(BamHI)(SEQ ID NO5)；p25-TAGCTC GAGTTA GAT CTG GAT AC-3(XhoI)(SEQ ID NO6)。用BamHI和XhoI對(duì)擴(kuò)增出的純化N基因片段和pET-28a(+)分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后用連接溶液I(寶公司)連接，然后轉(zhuǎn)化E.coli JM109，涂布含卡那霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基，挑取光滑單菌落，搖菌培養(yǎng)后用試劑盒抽提質(zhì)粒，PCR、雙酶切鑒定正確后送上海博亞公司測(cè)序確認(rèn)，鑒定正確重組質(zhì)粒命名為PET-N。用引物p1和p2、酶BamHI和XhoI對(duì)重組質(zhì)粒PET-N進(jìn)行PCR和酶切鑒定(圖2)，結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果一致，該重組質(zhì)粒PET-N經(jīng)序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如SEQ IDNO2所示。。
誘導(dǎo)條件優(yōu)化試驗(yàn)將重組質(zhì)粒PET-N轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)表達(dá)宿主菌，從LB平板上挑取單菌落接入3mlLB培養(yǎng)基(所有培養(yǎng)基均含卡那霉素)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后以150接入100ml 2×YT培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，做誘導(dǎo)條件優(yōu)化試驗(yàn)，以未誘導(dǎo)的菌作對(duì)照，分別做不同的誘導(dǎo)時(shí)間，不同的D600nm值起始誘導(dǎo)，不同的IPTG量誘導(dǎo)試驗(yàn)，最后確定最佳誘導(dǎo)條件。
由圖6可知不同誘導(dǎo)時(shí)間及開(kāi)始誘導(dǎo)時(shí)不同D600nm值對(duì)融合蛋白的表達(dá)率有明顯影響，而不同IPTG量誘導(dǎo)則不很明顯。確定D600nm值為0.5～0.6時(shí)起始用IPTG誘導(dǎo)重組核衣殼蛋白表達(dá)，IPTG的為0.6～1.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間為4～5小時(shí)。
重組AKAV核衣殼蛋白的鑒定、純化和表達(dá)量測(cè)定工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后，經(jīng)超聲裂解，12000×g離心15分鐘經(jīng)檢測(cè)表達(dá)蛋白均在上清，樣本條帶與對(duì)照比較，在27ku處多一條亮帶，與預(yù)期大小一致，ProBondTMPurification System純化后則只剩此帶，這說(shuō)明其確為誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白。用牛抗AKAV陽(yáng)性血清做一抗作用，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗牛IgG做二抗作用，DAB顯色后結(jié)果顯示，對(duì)應(yīng)位置均有明顯條帶，而對(duì)照沒(méi)有，這表明所表達(dá)的融合蛋白具有免疫學(xué)活性(圖3、圖4)。
本發(fā)明的重組融合蛋白，采用GENETYX-WIN Version5.1的軟件進(jìn)行推測(cè)，其結(jié)果為具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
收獲誘導(dǎo)后的菌液并與1500×g 4℃離心10min，棄上清，然后用同菌液體積的PBS溶液懸浮-離心-棄上清洗三次，最后用1/10菌液體積的PBS懸浮，超聲裂解至透明，以12000×g 4℃離心15min，取上清和沉淀備檢。在12％的SDS-PAGE檢測(cè)陽(yáng)性后，用Western blot檢測(cè)活性，以?？笰KAV陽(yáng)性血清做一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗牛IgG為二抗，DAB顯色，通過(guò)薄層掃描檢測(cè)融合蛋白表達(dá)率。用薄層掃描儀對(duì)工程菌SDS-PAGE檢測(cè)表明，融合蛋白占可溶性菌體總蛋白百分比最高達(dá)58.5％(圖5)。
本發(fā)明重組AKAV核衣殼蛋白制備抗血清檢測(cè)AKAV抗原試驗(yàn)1材料和方法1.1材料1.1.1種毒AKAV OBE-1株種毒由日本農(nóng)林水產(chǎn)省動(dòng)物衛(wèi)生研究所惠贈(zèng)。
1.1.2一抗和二抗 兔抗AKAV重組核衣殼蛋白血清的制備詳見(jiàn)下述；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號(hào)ZF-0311，批號(hào)64419；抗體稀釋液∶甘油＝1∶1，0.75mg/ml)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
1.1.3繁毒材料BHK21培養(yǎng)細(xì)胞由哈獸研保存；一窩昆明系小白鼠其中9只3日齡乳鼠和一只母鼠，由哈獸研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2方法1.2.1繁毒及TCID50測(cè)定 將種毒接入BHK21細(xì)胞，待70％細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，將細(xì)胞凍融三次，1500g離心15分鐘，取上清用96孔板測(cè)定毒價(jià)為106TCID50/ml，分裝并于-80℃凍存。
1.2.2兔抗AKAV重組核衣殼蛋白血清的制備采用本發(fā)明實(shí)施例3所純化的重組核蛋白，將重組核蛋白配制成濃度為460ug/ml，然后免疫2月齡的兔子。首免，1ml重組蛋白溶液與等量的完全福氏佐劑(Sigma公司)乳化后背部皮下多點(diǎn)注射；兩周后二免，取1ml重組核蛋白溶液與等量的不完全福氏佐劑乳化后背部皮下多點(diǎn)和腿部肌肉注射；再兩周后三免，取1.3ml重組蛋白溶液直接耳靜脈注射，一周后心臟采血，分離血清-20℃凍存。用哈獸研保存的瓊擴(kuò)抗原評(píng)價(jià)此血清，將其稀釋64倍后仍可見(jiàn)清晰沉淀線。
1.2.3細(xì)胞接毒將培養(yǎng)瓶上貼壁的BHK21細(xì)胞消化下來(lái)后，用含8％胎牛血清的DMEM吹散懸浮并計(jì)數(shù)，細(xì)胞終濃度為1×105個(gè)/ml，然后以每孔1ml將其接入24孔板，20小時(shí)后(此時(shí)細(xì)胞面積約占培養(yǎng)板面積的70～80％)吸出培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，樣本孔加200ulDMEM稀釋的病毒液(DMEM液∶病毒液＝199∶1，毒價(jià)為2×104TCID50/ml)，對(duì)照孔加200ulDMEM溶液，37℃感作1小時(shí)后加入含2％胎牛血清的DMEM維持液，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14小時(shí)。
1.2.4乳鼠攻毒6只乳鼠分別腦內(nèi)接種1.2.1毒價(jià)為106TCID50/ml病毒液10ul，其余三只接種等量DMEM作為對(duì)照，尾端剪斷少許以示區(qū)別。
1.2.5抗原片處理方法1.2.5.1培養(yǎng)細(xì)胞棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，吹干細(xì)胞后用70％的冷乙醇4℃固定30分鐘然后用pH7.4的PBS洗片3遍，每次5分鐘；將一抗用PBS作1∶20稀釋后每孔加入200ul，37℃作用30分鐘，取出后用PBS洗3遍；二抗用含0.01‰伊文思蘭的樣品稀釋液作1∶100倍稀釋后每孔加入200ul，37℃作用30分鐘，取出后用PBS洗3遍，吹干后立即用熒光顯微鏡觀察。
1.2.5.2乳鼠腦冰凍切片將 接毒后5～6天出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的和對(duì)照乳鼠腦取出凍入-24℃冰凍切片機(jī)載樣板上，切出5um厚的切片，輕輕展開(kāi)后，立即將其粘到多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片上；待片子晾干后放入4℃丙酮中固定5分鐘，取出后室溫晾干，然后在洗滌缸內(nèi)用PBS洗片3遍，每次5分鐘；將I抗用PBS作1∶20稀釋后滴到樣品上，把片子放入濕盒中37℃作用30分鐘，取出后用PBS洗3遍；將二抗用含0.01‰伊文思蘭的樣品稀釋液作1∶100倍稀釋滴加到樣品上，37℃作用30分鐘，取出后用PBS洗3遍，吹干后封片并立即用熒光顯微鏡觀察。
2試驗(yàn)結(jié)果2.1BHK21細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察被病毒感染的培養(yǎng)細(xì)胞樣本，可見(jiàn)有單個(gè)或成團(tuán)的細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)有很強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，而對(duì)照細(xì)胞則沒(méi)有，見(jiàn)圖7。
2.1乳鼠攻毒后5～6天的乳鼠相繼出現(xiàn)在桌面上轉(zhuǎn)圈的神經(jīng)癥狀，直至死亡，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔出血，腦硬膜淤血，而對(duì)照鼠則正常。鏡檢可發(fā)現(xiàn)，在攻毒鼠腦神經(jīng)細(xì)胞胞漿中有亮綠色熒光信號(hào)，而對(duì)照組則無(wú)熒光信號(hào)，見(jiàn)圖7。
上述結(jié)果說(shuō)明，采用本發(fā)明重組AKAV核衣殼蛋白所制備成的抗血清，采用間接熒光抗體法可以快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出組織中的AKAV抗原，該方法特異性高且所需操作時(shí)間短，適合臨床診斷的需要。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>重組赤羽病毒核衣殼蛋白、其制備方法及應(yīng)用<130>012<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>267<212>PRT<213>Akababe virus<400>1Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg20 25 30Gly Ser Met Ala Asn Gln Phe Ile Phe Asn Asp Val Pro Gln Arg Asn35 40 45Ala Ala Thr Phe Asn Pro Asp Ala Gly Tyr Val Ala Phe Ile Ser Lys50 55 60Tyr Gly Gln Gln Leu Asn Phe Thr Val Ala Arg Val Phe Phe Leu Asn65 70 75 80Gln Lys Lys Ala Lys Met Val Leu His Lys Thr Pro Gln Pro Ser Val85 90 95Asp Leu Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Thr Val Val Asn Asn His Phe100 105 110Pro Gln Tyr Thr Ala Asn Pro Val Ser Asp Thr Ala Phe Thr Leu His115 120 125Arg Ile Ser Gly Tyr Leu Ala Arg Trp Val Ala Glu Gln Cys Lys Ala130 135 140Asn Gln Ile Lys Phe Ala Glu Ala Ala Ala Thr Ile Val Met Pro Leu145 150 155 160Ala Glu Val Lys Gly Cys Thr Trp Ser Asp Gly Tyr Ala Met Tyr Leu165 170 175Gly Phe Ala Pro Gly Ala Glu Met Phe Leu Glu Thr Phe Glu Phe Tyr180 185 190Pro Leu Val Ile Asp Met His Arg Val Ile Lys Asp Gly Met Asp Val195 200 205Asn Phe Met Arg Lys Val Leu Arg Gln Arg Tyr Gly Gln Leu Thr Ala210 215 220Glu Glu Trp Met Thr Ser Lys Leu Asp Ala Val Lys Ala Ala Phe Gly
225 230 235 240Ser Val Ala Gln Ile Ser Trp Ala Lys Ser Gly Phe Ser Pro Ala Ala245 250 255Arg Ala Phe Leu Ala Gln Phe Gly Ile Gln Ile260 265<210>2<211>804<212>DNA<213>Akababe virus<400>2atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatggcaaa tcaattcatt120ttcaacgatg ttccacaacg gaatgcagct acatttaatc cggatgcagg gtatgtggca180tttatcagta agtatgggca gcagctcaac tttactgttg ctagagtctt cttcctcaac240cagaagaagg ccaagatggt cttacataag acgccacaac caagtgtcga tcttactttt300gcaggggtca aatttacagt ggttaataac cattttcccc agtacactgc aaatccagtg360tcagacactg cctttacgct tcaccgcatc tcgggctact tagctcgctg ggttgctgag420cagtgcaagg ctaatcagat caaatttgca gaggcagctg ccacaattgt gatgccactg480gctgaggtga agggttgcac ctggagtgac gggtatgcaa tgtacctggg atttgcccct540ggtgctgaga tgtttctgga aacctttgag ttttacccac tggttatcga catgcaccgt600gtgataaagg atggaatgga tgtcaacttc atgaggaagg tcttacgtca gaggtatggg660cagctgactg cagaagagtg gatgacatct aagttggacg cagtcaaggc tgcatttggc720tcagttgccc aaatatcctg ggctaaatct ggcttctcac ctgcagctag agctttcctg780gctcaatttg gtatccagat ctaa 804<210>3<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
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<400>6tagctcgagt tagatctgga tac 2權(quán)利要求
1.一種重組赤羽病毒核衣殼蛋白，其特征是具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1的重組赤羽病毒核衣殼蛋白基因，其特征是具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
3.一種制備權(quán)利要求1的重組赤羽病毒核衣殼蛋白的方法，包括以下步驟構(gòu)建重組赤羽病毒核衣殼蛋白基因原核表達(dá)載體；用該原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；誘導(dǎo)重組核衣殼蛋白表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組核衣殼蛋白。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征是所述的重組赤羽病毒核衣殼蛋白基因原核表達(dá)載體為PET-N。
5.按照權(quán)利要求3的方法，其特征是所述的大腸桿菌是BL21(DE3)。
6.按照權(quán)利要求3的方法，其特征是所述的誘導(dǎo)是當(dāng)菌液OD600nm值為0.5-0.6時(shí)，用濃度為0.6-1.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4-5小時(shí)。
7.按照權(quán)利要求3的方法，其特征是采用親和層析的方法純化重組蛋白。
8.權(quán)利要求1的重組赤羽病毒核衣殼蛋白在制備診斷或檢測(cè)赤羽病毒抗原藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2的編碼重組赤羽病毒核衣殼蛋白基因在制備診斷或檢測(cè)赤羽病毒抗原藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的重組赤羽病毒核衣殼蛋白、編碼該重組蛋白基因以及該重組蛋白的制備方法。本發(fā)明重組蛋白具有SEQ ID No1所示的氨基酸序列，編碼該重組赤羽病毒核衣殼蛋白基因具有SEQ ID No2所示的核苷酸序列。本發(fā)明重組蛋白的制備方法包括以下步驟構(gòu)建重組赤羽病毒核衣殼蛋白基因原核表達(dá)載體；用重組赤羽病毒核衣殼蛋白基因原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；用IPTG誘導(dǎo)重組核衣殼蛋白表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組核衣殼蛋白。本發(fā)明重組赤羽病毒核衣殼蛋白能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)，所表達(dá)的重組蛋白具有高免疫學(xué)活性和高敏感性，利用該重組赤羽病毒核衣殼蛋白制備成的抗血清，采用間接熒光抗體法可以快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出組織中的赤羽病毒抗原。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1769294SQ20051011685
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日
發(fā)明者吳東來(lái), 李少英, 孟慶文, 尹訓(xùn)南 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所