空間分辨的配體-受體結(jié)合試驗(yàn)的制作方法
【專利摘要】一種用于分析配體-受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果的方法，其中避免了傳統(tǒng)的洗滌步驟，所述方法包括：混合其中受體附著于固體載體的試劑、懷疑含有配體的樣品以及包含標(biāo)記的綴合物形成復(fù)合物，其中標(biāo)記以與樣品中存在的配體量直接成正比的濃度存在或以與樣品中存在的分析物量成反比的濃度存在。在兩種不同類型的照明下提供沉降/固定支持物的數(shù)字圖像并數(shù)字化減去所述圖像以僅識別結(jié)合事件而非反應(yīng)組分。與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比量化這樣產(chǎn)生的圖像強(qiáng)度以便提供分析物的濃度。
【專利說明】空間分辨的配體-受體結(jié)合試驗(yàn)
[0001]本申請要求2011年6月6日提交的美國序列號13/153,934的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用并入本文中。
_2] 發(fā)明背景
1.發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及樣品中配體(更具體地，特異性結(jié)合受體的配體)濃度的測定。
[0003]2.本領(lǐng)域討論
在過去幾十年中，免疫測定使用熒光、化學(xué)發(fā)光或產(chǎn)生響應(yīng)于分析物的信號的其他方法來進(jìn)行。目前，許多免疫測定通過測量反應(yīng)混合物的總量中產(chǎn)生的光信號的強(qiáng)度來進(jìn)行。所產(chǎn)生的光信號可通過光學(xué)方法來測量，其中所產(chǎn)生的光信號由大量分子發(fā)出。在一個典型的實(shí)施方案中，這些免疫測定可通過將懷疑含有抗原的樣品與包含附著于固體載體(例如，珠、微粒)的第一抗體的試劑混合以形成反應(yīng)混合物來實(shí)現(xiàn)。所述抗原，如果存在于樣品中，特異性結(jié)合第一抗體。綴合物，其包含具有附著于其上的標(biāo)記的第二抗體，被引入到反應(yīng)混合物中，并特異性地結(jié)合至抗原，該抗原特異性結(jié)合第一抗體，如前所述，該第一抗體附著在固體載體上。這種免疫測定被稱為夾心免疫測定或免疫計(jì)量試驗(yàn)。這種類型的免疫測定示意性地示于圖1中。然后將未結(jié)合的綴合物從反應(yīng)混合物中移除(典型地通過洗滌步驟進(jìn)行)后，測量由標(biāo)記引起的信號。測量反應(yīng)混合物的總量所產(chǎn)生的信號，然后與校準(zhǔn)曲線對比以確定樣品中存在的抗原的濃度。
[0004]另一種類型的免疫測定被稱為競爭性免疫測定。在一個典型的實(shí)施方案中，未標(biāo)記抗原和標(biāo)記抗原競爭相同的抗體位點(diǎn)?；蛘?，抗體和標(biāo)記抗體競爭相同的抗原位點(diǎn)。在前者的實(shí)例中，使用標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原。將固體載體用能特異性地結(jié)合至標(biāo)記抗原或未標(biāo)記抗原的抗體包被。將固體載體、標(biāo)記抗原和懷疑含有抗原的患者樣品混合。當(dāng)然，患者樣品中的任何抗原都是未標(biāo)記的。標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原競爭固體載體上的抗體位點(diǎn)。只有當(dāng)標(biāo)記抗原附著于固體載體上的抗體才能產(chǎn)生信號，因?yàn)橹挥袠?biāo)記抗原可以產(chǎn)生信號?；颊邩悠分械目乖颗c信號的產(chǎn)生量成反比。這種類型的免疫測定示意性地示于圖2中。
[0005]在使用不同的光學(xué)方法進(jìn)行免疫測定時，大量參數(shù)必須加以考慮。這些參數(shù)包括進(jìn)行免疫測定所需要的時間、進(jìn)行免疫測定所需要的樣品量、進(jìn)行免疫測定所需要的其他試劑的量、完成免疫測定所需要的步驟數(shù)、免疫測定的靈敏度和免疫測定的動態(tài)范圍。該動態(tài)范圍通?？梢愿采w三個或更多個數(shù)量級。幾十年來，利用磁微粒的免疫測定已顯示可為前面提到的大部分參數(shù)提供足夠的值。磁微粒允許結(jié)合至綴合物的分析物以簡單的方式與未結(jié)合的綴合物和其它試劑分離。磁微粒的另一有吸引力的特性是可以在溶液中容易地控制它們以允許固相上的分析物或綴合物在相對短的時間內(nèi)結(jié)合。通過利用磁性吸引力，可移動和洗滌磁微粒以提供僅結(jié)合至磁微粒的分析物的信息。
[0006]使用任何微粒作為固體載體的主要缺點(diǎn)是關(guān)于包被在微粒上的抗體的量，微粒與微粒之間缺乏均一性。另一個缺點(diǎn)是綴合物與微粒的不期望的相互作用。這種不期望的相互作用可能會影響免疫測定的結(jié)果，因此，可能需要對用于在免疫測定分析儀中使用的由不同制造商制造的大量不同微粒進(jìn)行廣泛研究。當(dāng)在反應(yīng)器中進(jìn)行免疫測定時，自身存在另一個缺點(diǎn)。綴合物可結(jié)合至反應(yīng)器的表面，這是不希望的。這些缺點(diǎn)不僅限制了免疫測定的靈敏度，也可能對分析物的檢測產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。
[0007]免疫測定中可能出現(xiàn)的其他問題涉及(a)綴合物與固體載體的非特異性結(jié)合和(b)試劑的聚合。這些問題是試驗(yàn)的開發(fā)者所主要關(guān)注的。典型地，減少非特異性結(jié)合的方法不僅涉及試劑的調(diào)整(tailoring)，還涉及以適當(dāng)?shù)谋壤龑⑺鼈兓旌弦蕴峁┧杞Y(jié)果。這些方法需要顯著量的反復(fù)試驗(yàn)(trial and error)，往往會導(dǎo)致使試驗(yàn)的開發(fā)成為漫長的過程，以及使試驗(yàn)的開發(fā)成為實(shí)驗(yàn)性(empirical)過程，結(jié)果是從一批到另一批試劑經(jīng)常變化。此外，綴合物的非特異性結(jié)合所產(chǎn)生的信號可能比綴合物與分析物特異性結(jié)合所產(chǎn)生的信號更高，從而限制了免疫測定的靈敏度?？蓛H通過使用不含任何分析物的樣品進(jìn)行校準(zhǔn)來評估實(shí)際試驗(yàn)過程中非特異性結(jié)合的影響。
[0008]典型的免疫測定的另一個潛在缺點(diǎn)是進(jìn)行試驗(yàn)后，試驗(yàn)的唯一記錄是信號的值。如果可獲取新的分析方法，沒有機(jī)會重新檢查樣品的缺陷或獲取更多的信息。將不僅沒有固相的性質(zhì)的記錄，也沒有辦法使用新開發(fā)的算法來核查記錄的數(shù)據(jù)。使用歷史數(shù)據(jù)來提取新信息的能力是不可能的。
[0009]因此，存在開發(fā)用于解決當(dāng)從試驗(yàn)中同步獲取數(shù)據(jù)時，在給定試驗(yàn)中固相的非特異性結(jié)合和非期望性能的分析儀器和方法以提高試驗(yàn)的靈敏度的需求。存在減少試劑的使用并為實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和即時設(shè)置的使用提供足夠的測量時間的需求。原則上，由于試驗(yàn)正在進(jìn)行，這種方法也能提供實(shí)時質(zhì)量控制。此外，期望緩解生成新的校準(zhǔn)曲線并減少從一批到另一批的試劑的變化的需求。還期望以這種方式保持試驗(yàn)的記錄，因?yàn)檫@些方法變?yōu)榭色@取的，故可在稍后的日期通過使用不同方法進(jìn)行核查。
[0010]新的檢測方法可配備來自納米技術(shù)和微流體的新興領(lǐng)域的設(shè)備以為生物樣品中分析物的檢測和測量提供更小、更有效和更靈敏的試驗(yàn)。
[0011]發(fā)明概沭
本發(fā)明提供一種用于分析配體-受體結(jié)合試驗(yàn)的方法，其包括以下步驟:
(a)使配體-受體結(jié)合試驗(yàn)的至少一個信號合格；和
(b)提供配體-受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果。
[0012]更具體地，該配體-受體結(jié)合試驗(yàn)涉及混合適當(dāng)?shù)脑噭?其中受體附著于固體載體，例如，微粒)、懷疑含有配體(例如，分析物)的樣品和包含標(biāo)記的綴合物以形成復(fù)合物，其中標(biāo)記以與樣品中存在的配體量直接成正比的濃度存在。綴合物的標(biāo)記附著于第二受體，所述第二受體不同于附著于固體載體的受體?；蛘?，該配體-受體結(jié)合試驗(yàn)涉及混合適當(dāng)?shù)脑噭┻M(jìn)行配體-受體結(jié)合試驗(yàn)，其中附著于固體載體(例如，微粒)的受體、懷疑含有配體(例如，分析物)的樣品與包含標(biāo)記的綴合物形成復(fù)合物，其中標(biāo)記以與樣品中存在的分析物量成反比的濃度存在。綴合物的標(biāo)記附著于配體，所述配體與懷疑存在于樣品中的配體是相同的配體。為提高免疫測定的靈敏度，可采用任選的反應(yīng)步驟和任選的洗滌步驟以減少非特異性結(jié)合并清除任何過量的綴合物。另一替代方法是一步均相免疫測定，其不需要分離步驟。
[0013]在一個實(shí)施方案中，將在其表面上帶有受體的微粒、懷疑含有分析物(即配體)的樣品以及包含附著于第二受體的標(biāo)記的綴合物(其中所述第二受體不同于附著于微粒的那些受體)引入到反應(yīng)器中并使其反應(yīng)，借此形成包含發(fā)射光信號的標(biāo)記的復(fù)合物。反應(yīng)器能夠使包含發(fā)射光信號的標(biāo)記的復(fù)合物記錄在圖像中。能夠存儲所得到的圖像以供稍后時間使用。在被用作測量分析物的濃度前使來自圖像的光信號合格。該圖像包括大量像素，并以逐個像素(pixel-by-pixel)為基礎(chǔ)使該圖像合格和定量該圖像。
[0014]使合格涉及將分析限制在復(fù)合物所在位置的那些圖像部分并測量圖像中復(fù)合物所發(fā)射的光的強(qiáng)度值。適于使來自圖像中復(fù)合物的光信號合格的算法包括以下步驟:
(a)獲取第一熒光圖像以確定復(fù)合物中第一綴合物的位置；
(b)在圖像中選擇像素進(jìn)行分析；
(c)計(jì)算并記錄步驟(b)中所選擇的像素的每像素計(jì)數(shù)的平均值和方差；
(d)省略計(jì)數(shù)大于或小于方差的指定水平的分析像素；和
(e)計(jì)算剩余像素的每像素計(jì)數(shù)的平均值。
[0015]從步驟(e)中獲取的數(shù)據(jù)，可確定樣品中分析物的濃度。
[0016]在任選的步驟中，可獲取反應(yīng)混合物的白光圖像以確定附著于固體載體的復(fù)合物的位置。在另一個任選的步驟中，可獲取第二熒光圖像以確定復(fù)合物中第二綴合物的位置。對于確定樣品中分析物濃度，第二熒光圖像可用于增加靈敏度。
[0017]對于夾心免疫測定，附著于固體載體的受體通常被稱為捕獲抗體。附著于標(biāo)記的第二受體通常被稱為檢測抗體。反應(yīng)器可以是微孔板的微孔。在典型的夾心免疫測定中，將反應(yīng)混合物孵育一段規(guī)定的時間后，通常洗滌反應(yīng)混合物以移除任何過量的檢測抗體和其它未結(jié)合的物質(zhì)。然后殘留在反應(yīng)器中的復(fù)合物通過例如配備有數(shù)碼相機(jī)的熒光顯微鏡進(jìn)行成像。然后確定每像素的光強(qiáng)度的平均值。然后由此確定的值可以用來確定樣品中抗原的濃度。
[0018]對于某些類型的競爭性免疫測定，附著于固體載體的受體也可被視為捕獲抗體。然而，當(dāng)抗原附著于標(biāo)記，并且懷疑樣品含有該抗原時，這種特定類型的競爭性免疫測定不具有檢測抗體。反應(yīng)器可以是微孔板的微孔。在這種特定類型的競爭性免疫測定中，將反應(yīng)混合物孵育一段規(guī)定的時間后，通常洗滌反應(yīng)混合物以除去過量的標(biāo)記抗原和殘留在反應(yīng)混合物中的任何其它物質(zhì)。然后殘留在反應(yīng)器內(nèi)的物質(zhì)通過例如配備有數(shù)碼相機(jī)的熒光顯微鏡進(jìn)行成像。然后確定每像素的光強(qiáng)度的平均值。然后所確定的值用于確定樣品中抗原的濃度。如前面所述，可以進(jìn)行其他類型的免疫測定以提供進(jìn)行本發(fā)明的成像方面所需要的結(jié)果。
[0019]在另一個實(shí)施方案中，配體可以是核酸的單鏈，例如，DNA、RNA，且受體可以是核酸的互補(bǔ)鏈，例如，DNA、RNA。在該實(shí)施方案中，配體-受體結(jié)合反應(yīng)可用于鑒定基因或特定核酸序列的存在，例如，DNA序列、RNA序列。
[0020]用于提供關(guān)于上述配體-受體結(jié)合試驗(yàn)的其他信息的替代方法涉及達(dá)到或超過至少一種所選標(biāo)準(zhǔn)的微粒或熒光斑點(diǎn)的數(shù)量的計(jì)數(shù)以用于計(jì)算強(qiáng)度。這種替代方法能夠?yàn)橹甘驹囼?yàn)的合適性能提供內(nèi)部控制。原則上，可對試驗(yàn)與試驗(yàn)之間的結(jié)果進(jìn)行對比以確保每個試驗(yàn)可靠，即，足夠靈敏和足夠精確。相對于每像素的強(qiáng)度值，每個微粒的熒光強(qiáng)度平均值可用來確定配體的濃度。這兩個值都應(yīng)該與校準(zhǔn)品的值一致，由此產(chǎn)生可用于確定分析物濃度的兩個統(tǒng)計(jì)量度。
[0021]本文所述的方法還能以與保持X射線和組織病理學(xué)記錄類似的方式保持試驗(yàn)的記錄。因?yàn)閳D像為離線獲取并存儲，即通過計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)存儲，其不適于在無人工干預(yù)下經(jīng)系統(tǒng)要求立即使用，可在稍后的時間采用用于分析的不同程序。該特點(diǎn)的優(yōu)勢是能夠?qū)崿F(xiàn)在不同時間取自同一患者的樣品的試驗(yàn)結(jié)果的直接對比。在該方式下，實(shí)際樣品及其試驗(yàn)的信息不會丟失，并且可以在稍后的時間進(jìn)行共享或核查。
[0022]本文所述的方法通過進(jìn)行配體-受體結(jié)合試驗(yàn)后生成包含微粒的復(fù)合物的熒光圖像，解決了總信號的測量中的固有問題。在本文所述的方法中，從樣品總量所發(fā)射的光強(qiáng)度的測量被替換為含有來自樣品的分析物的復(fù)合物的圖像分析以提高試驗(yàn)的靈敏度。通過合并常規(guī)配體-受體結(jié)合試驗(yàn)中未包含的空間信息，試劑的聚集和非特異性結(jié)合可以從產(chǎn)生的信號中消除，且可使樣品中的分析物合格并同時或隨后進(jìn)行定量。例如，關(guān)于使合格，與固相相關(guān)的不期望的人工制品，例如，微粒，可被檢查出并在使用強(qiáng)度信息之前移除?；蛘?，如果期望測量蛋白質(zhì)的聚集程度，可測量上述聚集相關(guān)的空間信息，而不是從生成的信號中移除。例如，淀粉樣蛋白的聚集是阿爾茨海默病的指標(biāo)。此外，關(guān)于定量，本文所述的方法允許省略非特異性結(jié)合至反應(yīng)器的壁上的試劑和綴合物以及在反應(yīng)混合物中擴(kuò)散的試劑和綴合物的強(qiáng)度信息?？臻g信息可用于精確定義應(yīng)從中測量強(qiáng)度的圖像的區(qū)域，以進(jìn)行精確和準(zhǔn)確的配體-受體結(jié)合試驗(yàn)。
[0023]常規(guī)試驗(yàn)需要大量的樣品和大量的試劑以提供足夠的信號。本文所述的方法只需要少量的固體載體材料，例如，僅幾百個包被的微粒，例如，至多約兩百(200)個微粒，或更少。如果新的分析方法變得可用，本文所述的方法能夠?qū)θ毕葸M(jìn)行樣品的復(fù)檢或獲取更多的信息。 [0024]附圖簡要說明
圖1為闡述夾心免疫測定的示意圖。
[0025]圖2為闡述競爭性免疫測定的示意圖。
[0026]圖3為紅色熒光團(tuán)標(biāo)記的捕獲抗體的熒光圖像。
[0027]圖4為附著于微粒的檢測抗體的熒光圖像。
[0028]圖5為顯示目標(biāo)區(qū)域的圖像，從中可計(jì)算每像素的平均強(qiáng)度。
[0029]圖6為具有附著于其上的抗體:分析物:綴合物(即，單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE)的復(fù)合物的微粒的白光圖像。
[0030]圖7為具有附著于其上的抗體:分析物:綴合物(即，單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE)的復(fù)合物的微粒的熒光圖像。
[0031]圖8為基于圖6和圖7的圖像的目標(biāo)區(qū)域的圖像。圖8由軟件程序生成。
[0032]圖9為圖7的熒光圖像在圖8的目標(biāo)區(qū)域的圖像上的覆蓋圖。
[0033]圖10為顯示由使用本文所述的成像算法所引起的免疫測定的靈敏度增加的校準(zhǔn)曲線。對于該校準(zhǔn)曲線，分析物(即，肌鈣蛋白)的校準(zhǔn)品的范圍為10 ?8/!^至50，000 pg/
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[0034]圖11為顯示由使用本文所述的成像算法所引起的免疫測定的靈敏度增加的校準(zhǔn)曲線。對于該校準(zhǔn)曲線，分析物(即，肌鈣蛋白)的校準(zhǔn)品的范圍為O pg/mL至200 pg/mL。在圖11中，還示出了來自每個校準(zhǔn)品的圖像總面積的每像素的熒光強(qiáng)度平均值。
[0035]圖12為顯示分析物(即，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，或者在本文中被稱為“NGAL”)的校準(zhǔn)品的每像素的平均熒光強(qiáng)度的校準(zhǔn)曲線。對于該校準(zhǔn)曲線，分析物NGAL的校準(zhǔn)品的范圍為O pM至94 pM。[0036]圖13為顯示分析物(即，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，或者在本文中被稱為“NGAL”)的校準(zhǔn)品的每像素的平均熒光強(qiáng)度的校準(zhǔn)曲線。對于該校準(zhǔn)曲線，分析物NGAL的校準(zhǔn)品的范圍為O pM至6 pM。
[0037]圖14為具有附著于其上的抗體:分析物:綴合物(即，單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE)的復(fù)合物的微粒的白光圖像。
[0038]圖15為基于圖14的圖像的目標(biāo)區(qū)域的圖像。圖14由軟件程序生成。
[0039]圖16為具有附著于其上的抗體:分析物:綴合物(即，單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE)的復(fù)合物的微粒的熒光圖像。
[0040]圖17為由每個濃度的校準(zhǔn)品肌鈣蛋白的每像素的平均強(qiáng)度值生成的校準(zhǔn)曲線。
[0041]圖18為顯示用于檢測DNA的試驗(yàn)方案的插圖。
[0042]詳細(xì)說明
如本文所用，術(shù)語“分析物”是指待測量的化合物或組合物，其可以是配體，其為單表位或者多表位，抗原或半抗原，單個或多個化合物，其共享至少一個共同表位位點(diǎn)或受體。
[0043]免疫測定是一種測量在經(jīng)常含有物質(zhì)的復(fù)雜混合物的溶液中物質(zhì)的存在或濃度的生化試驗(yàn)。生物液體例如血清或尿液中的分析物經(jīng)常使用免疫測定方法進(jìn)行檢測。這種試驗(yàn)是基于抗體高特異性結(jié)合于一個或非常有限組的分子的獨(dú)特能力。結(jié)合至抗體的分子被稱為抗原。免疫測定可以對抗原/抗體對的任一成員進(jìn)行。除了結(jié)合特異性，所有免疫測定的另一關(guān)鍵特征是響應(yīng)于特異性結(jié)合產(chǎn)生可測量的信號的方法。歷史上，這通過測量某些物理特性的變化例如光散射或折射率改變來實(shí)現(xiàn)。然而，如今大多數(shù)免疫測定依賴于使用與可檢測標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的分析試劑。已證明了各種各樣的標(biāo)記，包括酶；熒光、磷光和化學(xué)發(fā)光染料；膠乳和磁性顆粒；結(jié)晶染料、金、銀和硒膠體粒子；金屬螯合物；輔酶；電活性基團(tuán)；寡核苷酸、穩(wěn)定的基團(tuán)及其他。這種標(biāo)記用于檢測和定量結(jié)合事件，在分離游離和結(jié)合的標(biāo)記試劑后或通過以結(jié)合事件影響標(biāo)記所產(chǎn)生的信號的變化的方式設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行。需要分離步驟的免疫測定(通常稱為分離免疫測定或異相免疫測定)是流行的，因?yàn)樗鼈兒苋菀自O(shè)計(jì)，但它們經(jīng)常需要多個步驟，包括仔細(xì)清洗標(biāo)記試劑已結(jié)合在其上的表面。信號受結(jié)合影響的免疫測定通常可以不經(jīng)分離步驟來運(yùn)行。這種試驗(yàn)經(jīng)?？梢院唵蔚赝ㄟ^混合試劑和樣品并進(jìn)行物理測量來實(shí)現(xiàn)。這種試驗(yàn)被稱為均相免疫測定或較不頻繁的非分離的免疫測定。
[0044]如本文所用，表述“夾心免疫測定”是指采用至少兩種特異性結(jié)合至相同配體的受體的免疫測定。在這種類型的免疫測定中，配體是分析物。一個受體能夠特異性結(jié)合至配體，借此受體使配體能夠直接或間接地附著于固體載體，例如，微粒。另一受體能夠特異性結(jié)合至配體，借此受體使配體可以直接或間接地附著于標(biāo)記以提供用于檢測配體的信號。例如，一個受體可以是特異性結(jié)合至樣品中抗原的捕獲抗體，借此使抗原直接或間接地附著于固體載體，例如，微粒，另一受體可以是特異性結(jié)合至樣品中抗原的檢測抗體，借此使抗原直接或間接地附著于用于檢測抗原的標(biāo)記。如果樣品中存在相對高量的配體，將會產(chǎn)生較高的信號。如果樣品中存在相對低量的配體，將會產(chǎn)生較低的信號。圖1為闡述夾心免疫測定的代表性實(shí)例的示意圖。
[0045]如本文所用，表述“競爭性免疫測定”是指采用結(jié)合至配體的受體的免疫測定。在這種類型的免疫測定中，配體是分析物。受體能夠特異性結(jié)合至配體，借此使配體直接或間接地附著于固體載體，例如，微粒。標(biāo)記的配體與分析物競爭相同的受體。例如，受體可以是特異性結(jié)合至樣品中抗原的捕獲抗體，借此使抗原直接或間接地附著于固體載體，例如，微粒。樣品中的抗原是未標(biāo)記的。標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原競爭相同的捕獲抗體。變得附著于固體載體的標(biāo)記抗原為檢測抗原提供標(biāo)記?；蛘撸谑荏w是特異性結(jié)合至樣品中抗體的抗原的情況下，借此使抗體直接或間接地附著于固體載體，例如，微粒，未標(biāo)記的抗體和標(biāo)記抗體可競爭相同的抗原。變得附著于固體載體的標(biāo)記抗體為檢測抗體提供標(biāo)記。如果樣品中存在相對高量的配體，將會產(chǎn)生較低的信號。如果樣品中存在相對低量的配體，將會產(chǎn)生較高的信號。圖2為闡述競爭性免疫測定的代表性實(shí)例的示意圖。
[0046]如本文所用，術(shù)語“復(fù)合物”是指特異性彼此結(jié)合的至少兩個分子。復(fù)合物的實(shí)例包括但不限于結(jié)合至受體的配體、結(jié)合至多個受體的配體(例如，結(jié)合至兩個受體的配體)、結(jié)合至多個配體的受體(例如，結(jié)合至兩個配體的受體)。
[0047]如本文所用，表述“固相”是指受體的狀態(tài)，其中所述受體附著于固體載體的表面，使得該受體不能從液體介質(zhì)中的固體載體脫離。固相可以容易地從分散固相的液體中分離。受體可附著的固體載體的實(shí)例是微粒，例如，磁微粒。所述微粒可以容易地從分散該微粒的液體中分離。所述微粒易于分散在水性介質(zhì)中。
[0048]如本文所用，表述“固體載體”是指有助于產(chǎn)生固相的物質(zhì)。固體載體的代表性實(shí)例包括但不限于微粒、微孔板的微孔、納米顆粒、凝膠、膠體、生物細(xì)胞。
[0049]如本文所用，表述“捕獲抗體”是指使分析物(即，抗原)結(jié)合至固體載體的抗體，其結(jié)果是該抗體使分析物附著于固體載體，借此使分析物直接或間接通過干預(yù)基團(tuán)或干預(yù)分子附著于固體載體。
[0050]如本文所用，表述“檢測抗體”是指附著于提供或可制備成提供在化學(xué)或生物反應(yīng)中的可檢測信號的基團(tuán)或分子的抗體。
[0051]如本文所用，表述“特異性結(jié)合對”是指兩個不同的分子，其中一個分子在表面上或空腔中具有特異性地結(jié)合至另一分子的特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。所述特異性結(jié)合對的成員被稱為配體和受體。
[0052]如本文所用，表述“非特異性結(jié)合”是指兩個或更多實(shí)體(例如，兩個分子)之間以不同于導(dǎo)致特異性結(jié)合對的方式結(jié)合。
[0053]如本文所用，術(shù)語“配體”是指其受體天然存在或可被制備的任何物質(zhì)。這種物質(zhì)包括但不限于有機(jī)化合物、無機(jī)化合物和化學(xué)元素，例如銅、鋰。
[0054]如本文所用，術(shù)語“受體”是指能夠識別分子的特定空間和極性結(jié)構(gòu)(即，表位位點(diǎn))的任何化合物或組合物。例示性的受體包括天然存在的受體，例如甲狀腺素結(jié)合球蛋白、抗體、酶、Fab片段、凝集素等。
[0055]配體與受體的結(jié)合涉及兩個分子物種(species)之間的非共價相互作用。典型地，但不一定，較小的配體是可溶性分子，其結(jié)合至較大的受體。配體結(jié)合至受體的實(shí)例包括但不限于以下:
(a)具有短單鏈DNA配體的互補(bǔ)序列的長單鏈DNA受體；
(b)結(jié)合至其互補(bǔ)抗原配體的任何抗體受體或結(jié)合至其互補(bǔ)抗體配體的抗原受體；
(c)與維生素B12配體結(jié)合的內(nèi)因子蛋白受體；
(d)氧分子配體的血紅蛋白受體。[0056]如本文所用，術(shù)語“綴合物”是指包含結(jié)合對成員和信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員(例如，標(biāo)記)的實(shí)體。如本文所用，術(shù)語“標(biāo)記”是指信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員，其直接或間接地結(jié)合至結(jié)合對成員或微粒。如本文所用，術(shù)語“信號產(chǎn)生系統(tǒng)”是指具有一種或多種組分的系統(tǒng)，至少一種組分綴合至特異性結(jié)合對成員。信號產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生可測量的信號，其可通過外部工具檢測，通常為電磁輻射的測量，且取決于所使用的系統(tǒng)，信號的水平將隨處于固體載體(例如，微粒)環(huán)境中的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的范圍而變化。在大多數(shù)情況下，信號產(chǎn)生系統(tǒng)將涉及發(fā)色團(tuán)，其中發(fā)色團(tuán)包括在紫外或可見區(qū)吸收光的染料、熒光體、熒光劑、熒光團(tuán)、發(fā)光團(tuán)和化學(xué)發(fā)光劑。另外，酶可以用來產(chǎn)生信號或放大信號或上述二者兼有。
[0057]如本文所用，術(shù)語“使…合格”、“合格的”等是指從不是由包含目標(biāo)分析物的復(fù)合物所引起的圖像中除去那些信號的程序。這樣被除去的信號包括但不限于非特異性結(jié)合、不期望的聚合所產(chǎn)生的信號，或從未附著于固體載體的位置發(fā)出的信號。在大多數(shù)情況下，但有一些例外，使分析和測量合格的那些信號是包含標(biāo)記的綴合物的特異性結(jié)合的結(jié)果。
[0058]如本文所用，且一般在數(shù)字圖像領(lǐng)域中，術(shù)語“像素(pixel) ”或“象素(pel) ” (圖像元素)是指數(shù)字圖像中的單個點(diǎn)，或顯示裝置中的最小可尋址(addressable)的屏幕元素。它是能夠表示或控制的圖像的最小單元。每像素具有其自己的地址。像素的地址與其空間坐標(biāo)相對應(yīng)。像素通常排列在二維網(wǎng)格中，且往往用點(diǎn)或正方形表示。每個像素為原始圖像的樣品；更多的樣品典型地提供原物(the original)的更準(zhǔn)確表示。每個像素的強(qiáng)度是可變的。圖像中像素的總數(shù)可以變化。數(shù)字圖像中像素?cái)?shù)量的代表性實(shí)例為1024X1024。
[0059]如本文所用，術(shù)語“強(qiáng)度”是指每單位面積或體積的電、光、熱或聲音的強(qiáng)度的量或程度。更具體地，關(guān)于本文中實(shí)際描述的方法，術(shù)語“強(qiáng)度”是指每單位時間每單位面積所計(jì)數(shù)的光子數(shù)。例如，每單位面積1000個光子在單個像素中可記錄為500計(jì)數(shù)，而每單位面積80個光子在單個像素記錄為40計(jì)數(shù)。特定的轉(zhuǎn)換取決于所使用的照相機(jī)系統(tǒng)。強(qiáng)度與所計(jì)數(shù)的光子數(shù)成正比。
[0060]如本文所用，表述“目標(biāo)區(qū)域”是指經(jīng)選擇用于進(jìn)一步分析的圖像中的那些像素。在圖像中，像素可以是連續(xù)的`或非連續(xù)的。
[0061]如本文所用，短語“空間信息”是指識別從其中發(fā)射信號的位置。
[0062]如本文所用，術(shù)語“ IgG”是指免疫球蛋白G。
[0063]在本文所述的發(fā)明的一般陳述中，配體特異性結(jié)合至受體以形成配體-受體復(fù)合物。得到配體-受體復(fù)合物的圖像。優(yōu)選將圖像儲存以便它可在稍后的時間使用，如果需要的話。以僅進(jìn)一步研究配體-受體復(fù)合物的方式從圖像中選擇目標(biāo)區(qū)域。該選擇特征確保背景信號和非特異性結(jié)合信號基本上從進(jìn)一步分析中排除。計(jì)算目標(biāo)區(qū)域的每像素光計(jì)數(shù)的平均數(shù)。
[0064]適合于本文所述方法的配體包括但不限于美國專利號4，275，149中所提到的那些，其通過引用并入本文中。適合于本文所述方法的受體包括但不限于美國專利號4，275，149中所提到的那些，其通過引用并入本文中。適合于本文所述方法的配體-受體復(fù)合物包括但不限于美國專利號4，275，149中所提到的那些，其通過引用并入本文中。
[0065]受體典型地附著于固體載體。適用于本文的固體載體為微粒。適用于本文所述方法的微粒包括但不限于磁微粒。微粒的尺寸典型地為約0.1 μ m至約100 μπι。市售的微?？刹捎酶鞣N材料，包括陶瓷、玻璃、聚合物和金屬所制成的那些。適用于本文所述方法的磁微粒可商購自 Polymer Laboratories, Agilent Technologies 的子公司。雖然 0.1 μ m至100 μ m的通常所接受的定義是納米顆粒的尺寸定義的補(bǔ)充(complements),但還有其他的方法來定義尺寸。通常接受認(rèn)為小于100 nm的微粒為納米顆粒。大于0.5 μ m的任何微粒和小于0.5 mm的任何物質(zhì)被認(rèn)為是微粒。一般而言,適用于本文所述方法的微粒尺寸必須足夠大使得可以通過所選擇的圖像系統(tǒng)來分辨兩個微粒。適用于本文所述方法的微粒的性質(zhì)(例如，顏色)是選擇的問題。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠選擇微粒的性質(zhì)以完成該方法的適當(dāng)變化所施加的要求。
[0066]適用于本文所述方法的反應(yīng)器包括微孔板。優(yōu)選反應(yīng)器具有這種特征:可制造配體-受體復(fù)合物的圖像。優(yōu)選反應(yīng)器對電磁輻射是透明的，典型地在光譜的紫外和可見范圍內(nèi)。適于制造反應(yīng)器的材料包括玻璃和聚合物材料。優(yōu)選反應(yīng)器的材料不會自發(fā)突光。然而，反應(yīng)器的特定形式或形狀不是關(guān)鍵的。
[0067]考慮用于本文所述方法的試驗(yàn)的反應(yīng)條件不是關(guān)鍵的。可使用與常規(guī)免疫測定或其他常規(guī)的特異性結(jié)合反應(yīng)所使用的基本上相同的條件。這種條件包括但不限于孵育的持續(xù)時間、孵育的溫度范圍、洗滌步驟的次數(shù)、緩沖液和試驗(yàn)中的其他非反應(yīng)性物質(zhì)等。原則上，設(shè)計(jì)用作化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)的任何免疫測定可通過本文所述方法使用熒光標(biāo)記來進(jìn)行。
[0068]適用于本文所述方法的成像系統(tǒng)可以是能夠獲取圖像使得可分辨各個微粒的任何系統(tǒng)。適用于本文所述方法的成像裝置包括但不限于光學(xué)顯微鏡、掃描顯微鏡、熒光成像掃描儀等。適用于本文所述方法的圖像文件類型包括但不限于JPEG/JFIF、GIF、BMP、TIFF和FITS。圖像文件格式描述于圖像文件格式-維基百科，免費(fèi)的百科全書中，其可通過 Hypertext Transfer Protocol 在網(wǎng)站 en.wikipedia.0rg/wiki/image_file_formats訪問，其通過引用并入本文中，且FITS描述于FITS-維基百科，免費(fèi)的百科全書中，其可通過 Hypertext Transfer Protocol 在網(wǎng)站 en.wikipedia.0rg/wiki/FITS 訪問，其通過引用并入本文中。
[0069]圖像的獲取過程中曝光持續(xù)時間不是關(guān)鍵的。適用于本文所述方法的曝光時間可以是提供足夠的分辨率以辨別圖像的相關(guān)細(xì)節(jié)的任何曝光時間。
[0070]目標(biāo)區(qū)域的選擇是重要的。通過使用合適的計(jì)算機(jī)程序，借助于對比或一些替代標(biāo)準(zhǔn)確定各個微粒的位置。與微?；蚱渌腆w載體相關(guān)聯(lián)的像素可被視為目標(biāo)區(qū)域。為了得到樣品中分析物的濃度的有意義的值，優(yōu)選至少約100個微粒，更優(yōu)選至少約200個微粒位于圖像中。適用于本文所述方法的市售計(jì)算機(jī)程序包括但不限于具有商標(biāo)“SLIDEB00K”和“METAM0RPH”的那些程序或公共領(lǐng)域的軟件，例如，ImageJ0
[0071]為了執(zhí)行該方法的簡化形式，市售的落射熒光顯微鏡可用于通過支持它們的透明表面對復(fù)合物進(jìn)行成像。這種顯微鏡的代表性實(shí)例是配備有高分辨CXD相機(jī)(Hamamatsu型號C4742-80-12AG)的機(jī)動倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS “ 1X81”)，其可商購自許多來源。
[0072]在該方法的基本形式中，單色方法可利用來自反應(yīng)混合物的總量的光信號用于提供比常規(guī)免疫測定更高的靈敏度。該更高的靈敏度可通過在較低濃度時具有較大斜率的線性函數(shù)的圖與在常規(guī)免疫測定中用作校準(zhǔn)曲線的線性圖的對比來證實(shí)。
[0073]帶有捕獲抗體的微粒、附著于熒光團(tuán)的檢測抗體和懷疑含有分析物的樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下混合以進(jìn)行免疫測定。進(jìn)行免疫測定后，排除不是從包含附著于捕獲抗體的微粒、分析物和包含附著于熒光團(tuán)的檢測抗體的綴合物的復(fù)合物發(fā)出的任何熒光信號。然后，基于綴合物的熒光團(tuán)所發(fā)射的熒光使剩余的復(fù)合物進(jìn)一步合格。該較后的步驟排除了不符合選擇標(biāo)準(zhǔn)的微粒的表面的任何部分?；诮y(tǒng)計(jì)參數(shù)(例如，標(biāo)準(zhǔn)偏差)，選擇標(biāo)準(zhǔn)的典型實(shí)例是用于測量的微粒具有大體上均勻的包被，其基本上消除了由于高度的非特異性結(jié)合所導(dǎo)致的綴合物的過度聚集。一般而言，選擇標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)特定的試驗(yàn)會有所不同。特定試驗(yàn)領(lǐng)域的一個普通技術(shù)人員應(yīng)該能夠?yàn)樘囟ǖ脑囼?yàn)制定有意義的選擇標(biāo)準(zhǔn)。最后，測量合格顆粒的每像素強(qiáng)度的平均值以與建立作為強(qiáng)度函數(shù)的分析物的濃度的校準(zhǔn)曲線的強(qiáng)度進(jìn)行比較。合格顆粒的每像素強(qiáng)度的平均值可通過CCD相機(jī)來確定，其能夠測量光的強(qiáng)度。將強(qiáng)度的測量轉(zhuǎn)換為參數(shù)，并將其在計(jì)數(shù)的單元中指定。每像素具有與在該象素測得的光強(qiáng)度相對應(yīng)的數(shù)。
[0074]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，得到反應(yīng)混合物的白光圖像。白光圖像用來定位每個固體載體(例如，微粒)的位置。使用用于照明和檢測的整個電磁光譜形成白光圖像。該步不是必需的，但是是優(yōu)選的，因?yàn)榭赡苄枰ㄎ幻總€固體載體(例如，微粒)的位置。然后獲取熒光圖像以確定附著于微粒的檢測抗體的位置和強(qiáng)度。熒光圖像使用顏色，例如，紅色、綠色。計(jì)算每像素計(jì)數(shù)并記錄每像素計(jì)數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。從分析中排除具有計(jì)數(shù)大于或小于例如上述標(biāo)準(zhǔn)偏差2倍的像素。計(jì)算剩余像素的每像素計(jì)數(shù)的平均數(shù)。從檢測抗體的標(biāo)記所測得的信號的數(shù)量確定分析物的濃度。
[0075]為了執(zhí)行將提供更高程度的靈敏度的更復(fù)雜測量，市售的落射熒光顯微鏡可用于通過支持它們的透明表面對復(fù)合物進(jìn)行成像。這種顯微鏡的代表性實(shí)例是配備有高分辨率的CCD相機(jī)(Hamamatsu型號C4742-80-12AG)的機(jī)動倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS “1X81”)，其可商購自許多來源。
[0076]在該更復(fù)雜的測量中，雙色方法利用來自反應(yīng)混合物的總量的光信號，用于提供比常規(guī)的免疫測定和采用早期所述的單色方法進(jìn)行的測量更高的靈敏度。該更高的靈敏度可通過在較低濃度時具有較大斜率的線性函數(shù)的圖與在常規(guī)免疫測定或使用單色方法進(jìn)行的試驗(yàn)中用作校準(zhǔn)曲線的線性圖的對比來證實(shí)。
[0077]將帶有捕獲抗體的微粒、附著于熒光團(tuán)的檢測抗體和懷疑含有分析物的樣品在適當(dāng)?shù)臈l件下混合以進(jìn)行免疫測定。進(jìn)行免疫測定后，排除不是從包含附著于捕獲抗體的微粒、分析物和包含附著于第一熒光團(tuán)的檢測抗體的綴合物的復(fù)合物發(fā)出的任何熒光信號。接下來，獲取捕獲抗體(以第二熒光團(tuán)為特征，其不同于第一熒光團(tuán))的圖像。該圖像排除與未以均相方式包被有捕獲抗體的任何微粒相對應(yīng)的任何像素。如果微粒未均勻包被，則排除來自不是均勻包被的部分的像素。然后，基于綴合物所發(fā)射的熒光使復(fù)合物進(jìn)一步合格。該后一步驟排除了不符合選擇標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)合物的任何部分。選擇標(biāo)準(zhǔn)的典型實(shí)例是均勻的包被，其基本上消除了可由高度的非特異性結(jié)合所導(dǎo)致的綴合物的過度聚集。如前所述，選擇標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)特定的試驗(yàn)會有所不同。最后，測量合格顆粒的每像素強(qiáng)度的平均值以與建立分析物的濃度的校準(zhǔn)曲線的強(qiáng)度進(jìn)行對比。
[0078]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，得到反應(yīng)混合物的白光圖像。白光圖像用來定位每個固體載體(例如，微粒)的位置。使用用于照明和檢測的整個電磁光譜形成白光圖像。該步驟不是必需的，但是是優(yōu)選的，因?yàn)榭赡苄枰ㄎ幻總€固體載體(例如，微粒)的位置。然后獲取第一熒光圖像以確定附著于微粒的捕獲抗體的位置。第一熒光圖像使用顏色，例如，紅色、綠色。獲取第二熒光圖像以確定作為綴合物的組分存在的抗體的位置。第二熒光圖像使用顏色，例如，紅色、綠色，但第二熒光圖像的顏色不同于第一熒光圖像的顏色。選擇來自于微粒上的捕獲抗體和綴合物上的抗體的像素用于進(jìn)一步分析。計(jì)算每像素計(jì)數(shù)并記錄每像素計(jì)數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。從分析中排除具有計(jì)數(shù)大于或小于例如上述標(biāo)準(zhǔn)偏差兩倍的像素。計(jì)算剩余像素的每像素計(jì)數(shù)的平均數(shù)。從檢測抗體的標(biāo)記測得的信號的數(shù)量確定分析物的濃度。
[0079]圖3、4和5闡述使配體-受體結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果合格所需的步驟。通過包含激發(fā)濾波器和發(fā)射濾波器的一組濾波器對熒光通道進(jìn)行限定，其允許具有特定波長的光到達(dá)樣品和具有特定波長的信號到達(dá)CCD相機(jī)。例如，熒光團(tuán)R-藻紅蛋白(或者在本文中被稱為“PE”)只能在PE通道中檢測且不能在任何其它熒光通道中檢測。類似地，熒光團(tuán)散二碳青色素(indodicarbocyanine)(或者在本文中被稱為“Cy5”)只能在Cy5通道檢測且不能在任何其它熒光通道檢測。在圖3中，檢測器中的一個通道測量用紅色熒光團(tuán)(Cy5通道)標(biāo)記的捕獲抗體的熒光圖像。僅顯現(xiàn)已被具有紅色熒光標(biāo)記的捕獲抗體包被的微粒。有兩個位置(白色圓圈)可以被省略，因?yàn)樗鼈兾锤街谖⒘?。在圖4中，檢測器的另一通道測量附著于微粒的檢測抗體的熒光圖像。顯現(xiàn)與其他微粒的強(qiáng)度分布不一致的非常亮的點(diǎn)，并用白色圓圈進(jìn)行指定。該位置也可以從分析中排除。圖5表示目標(biāo)區(qū)域，從該區(qū)域可計(jì)算每像素的強(qiáng)度值。不符合給定的選擇標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)域可以從該類型的分析中排除。
[0080]以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的實(shí)施方案。在以下實(shí)施例中，所有濃度以重量計(jì)(w/w)，除非另有說明。在以下實(shí)施例中，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備綴合物，除非另有說明。在實(shí)施例1中，除非另有說明，帶有抗肌鈣蛋白單克隆抗體19C7的包被但在免疫測定中尚未反應(yīng)的微粒被稱為“包被有抗肌鈣蛋白單克隆抗體19C7的微?！?在免疫測定中已經(jīng)反 應(yīng)且存在于夾心復(fù)合物中的微粒被稱為“附著于單克隆抗體19C7:肌鈣蛋白:綴合物M06-PE復(fù)合物的微粒”。在實(shí)施例2中，除非另有說明，帶有抗人IgG單克隆抗體的包被但在免疫測定中尚未反應(yīng)的微粒被稱為“包被有抗人IgG單克隆抗體的微?！?在免疫測定中已經(jīng)反應(yīng)且存在于夾心復(fù)合物中的微粒被稱為“附著于綴合物2322-Cy5 =NGAL:綴合物903-PE復(fù)合物的微粒”。
[0081]實(shí)施例1
該實(shí)施例通過使用單一熒光染料作為標(biāo)記來檢測抗體，闡述肌鈣蛋白的免疫測定。
[0082]制備包被有抗肌鈣蛋白單克隆抗體19C7的微粒。在含有牛血清白蛋白(BSA)(0.5%)、表面活性劑(“STANDAP0L”，。.2 %)和抗微生物劑(“PR0CLIN” 300,0.1%)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中制備以下濃度的一組肌鈣蛋白(Tnl (28-1 IOaa)-TnC)校準(zhǔn)品。下表列出了每個校準(zhǔn)品中Tnl (28-1 IOaa)-TnC的濃度。
[0083]表1
【權(quán)利要求】
1.一種用于分析配體-受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果的方法，其包括以下步驟: (a)通過使用選自圖像的至少一個目標(biāo)區(qū)域，提供配體-受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果；和 (b)使配體-受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果合格。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述圖像為數(shù)字圖像。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一個目標(biāo)區(qū)域包括用于進(jìn)一步分析所選的數(shù)字圖像的像素。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述使合格步驟包括: (a)獲取第一熒光圖像以確定第一綴合物的位置； (b)選擇用于分析的像素； (c)計(jì)算并記錄步驟(b)中所選像素的每像素的計(jì)數(shù)的平均值和方差； (d)省略計(jì)數(shù)大于或小于指定方差的像素；和 (e)計(jì)算剩余像素的每像素的計(jì)數(shù)的平均值。
5.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)步驟(e)中的數(shù)據(jù)確定分析物濃度的步驟。
6.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括提供包含配體-受體的反應(yīng)混合物；和制備反應(yīng)混合物的白光圖像以確定微粒的位置的步驟。
7.步驟4的方法，進(jìn)一步包括獲取第二熒光圖像以用于確定第二綴合物的位置的步驟。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述省略的像素從分析中排除.
9.源文件第九條權(quán)利要求書缺失。
10.權(quán)利要求1的方法，其中聚集蛋白從分析中排除.
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述結(jié)果源于免疫測定.
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述結(jié)果源于夾心免疫測定.
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述結(jié)果源于競爭性免疫測定.
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述結(jié)果源于均相免疫測定.
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫測定涉及在反應(yīng)器中混合附著于微粒的捕獲抗體、附著于標(biāo)記的檢測抗體和懷疑含有抗原的樣品并允許反應(yīng)發(fā)生的步驟.
16.權(quán)利要求15的方法，其中僅需要至多約兩百(200)個包被微粒.
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫測定涉及在反應(yīng)器中混合附著于微粒的捕獲抗體、附著于標(biāo)記的抗原和懷疑含有分析物的樣品并允許反應(yīng)發(fā)生的步驟.
18.權(quán)利要求17的方法，其中僅需要至多約兩百(200)個包被微粒.
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述結(jié)果源于核酸.
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述試驗(yàn)涉及混合含有DNA單鏈的配體和含有與配體的DNA單鏈互補(bǔ)的DNA鏈的受體的步驟.
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述圖像通過配備有數(shù)碼相機(jī)的熒光顯微鏡記錄.
22.權(quán)利要求1的方法，其中試驗(yàn)的記錄以與保持X-射線和組織病理學(xué)記錄的那些方式類似的方式保持.
23.權(quán)利要求1的方法，其中獲取圖像并離線存儲.
24.權(quán)利要求1的方法，其中測量蛋白質(zhì)的聚集而不是從生成的圖像中移除.
25.權(quán)利要求1的方法，其中空間信息用于使配體-受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果合格和定量配體-受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果.
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述使合格包括使來自圖像中的配體-受體復(fù)合物的光信號合格.
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述使合格步驟包括: (a)獲取第一熒光圖像以確定第一綴合物的位置； (b)選擇用于分析的目標(biāo)區(qū)域； (c)省略計(jì)數(shù)大于或小于計(jì)算平均值的目標(biāo)區(qū)域；和 (d)根據(jù)剩余目標(biāo)區(qū)域確定分析物濃度.
28.權(quán)利要求27的方法，其進(jìn)一步包括提供包含配體-受體復(fù)合物的反應(yīng)混合物；和制備所述反應(yīng)混合物的白光圖像以確定微粒位置的步驟.
29.權(quán)利要求27的方法，其進(jìn)一步包括獲取第二熒光圖像以確定第二綴合物位置的步驟.
30.權(quán)利要求27的方法，其中省`略的像素從分析中排除。
【文檔編號】G01N21/64GK103733066SQ201280038566
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月6日
【發(fā)明者】阮俏俏, S.C.薩爾達(dá)納, J.P.斯金納, S.Y.特丁 申請人:雅培制藥有限公司