專利名稱:改善的植物育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及改善的植物育種系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及用于育種程序中自動化、高通量分析植物表型和植物基因型的方法。
發(fā)明背景
植物育種程序要求分析巨大數(shù)目植物的表型。這些分析涉及測量類型眾多的植物特征，包括植物形態(tài)、疾病和環(huán)境脅迫耐受性、種子品質(zhì)和產(chǎn)量。除了評價表型外，育種程序還經(jīng)常需要確定基因型，例如旨在鑒定與特定表型相關(guān)的DNA標(biāo)記或旨在證實轉(zhuǎn)基因植物中存在轉(zhuǎn)基因。因此，提取植物基因組DNA也可能是必需的。
傳統(tǒng)上，育種程序中表型的分析通過目視評價和手工測量形態(tài)學(xué)特征實施。然而，因為必須進行評價的植物的數(shù)目巨大和早期評價植物時差異細微，該過程是極費時間的，因而限制了可以分析的植物的數(shù)目。已經(jīng)做出初始嘗試來通過開發(fā)模式植物擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的評價方法使這種過程自動化。例如，Granier等人描述了由支撐淺盤的鋼框架和能夠根據(jù)軟件程序運動的機械臂組成的系統(tǒng)，所述的淺盤帶有支撐盆缽的孔(Granier等人，2002，New Phytologist 169:623-635)。擬南芥植物在生長箱中培育并且位移傳感器、天平、灌溉管和照相機裝在該機械臂上以對每個盆缽稱重、灌溉和拍攝數(shù)字圖片。Boyes等人描述了基于擬南芥中一系列定義的生長階段用于表型分析的高通量方法，所述的生長階段充當(dāng)發(fā)育標(biāo)志和收集形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的觸發(fā)器。用測徑器或尺子或通過視檢進行測量(Boyes等人.，2001 ,Plant Cell 13:1499-1510)。Wang等人描述紅外熱顯影術(shù)作為非侵入性高通量工具用于篩選擬南芥衛(wèi)細胞信號傳導(dǎo)突變體的用途(Wang等人.， 2004，J. Exp. Bot. 55 :1187-1193)。
雖然已經(jīng)開發(fā)了用于擬南芥的高通量篩選方法，作物物種的更大尺寸和形態(tài)復(fù)雜度限制了這些方法對作物物種育種程序的適應(yīng)性。已經(jīng)開發(fā)了適應(yīng)于作物物種的表型分型系統(tǒng)的部件。例如，美國專利號5，253，302公開用于植物的自動光學(xué)分類的方法，在所述方法中每株植物的圖像由彩色攝影機捕獲。美國公開的申請?zhí)?005/0180608公開了使用用于表型功能分析的圖像采集系統(tǒng)的植物生長分析系統(tǒng)。該植物生長分析系統(tǒng)具有傳送許多所觀察對象的機制，其中所述的對象反復(fù)地通過照相機。美國公開的申請?zhí)?007/0186313 公開了用于快速評價玉米植物中轉(zhuǎn)基因功能的方法。該方法使用定量的、非破壞性成像技術(shù)來評價統(tǒng)計相關(guān)的受控溫室環(huán)境中的目的農(nóng)學(xué)性狀。美國專利號7，278，236公開用于非破壞地獲得植物根系統(tǒng)圖像的裝置和方法。所述裝置包括用于支撐植物根系統(tǒng)的基質(zhì)、用于容納該基質(zhì)的容器、X射線輻射源和X射線圖像捕獲系統(tǒng)。植物成像系統(tǒng)的一個關(guān)鍵方面是轉(zhuǎn)動植物以從幾個不同角度捕獲圖像的能力。存在使植物繞固定轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動同時被拍照的系統(tǒng)。一些系統(tǒng)提供幾臺照相機用于以不同角度對植物照相。雖然已經(jīng)開發(fā)了用于成像期間轉(zhuǎn)動植物的方法，但是仍需要其中可以精確轉(zhuǎn)動植物或成像裝置而同時仍以高速度移動植物的系統(tǒng)。
育種程序中的挑戰(zhàn)之一是開發(fā)用于辨識和追蹤正在評價的巨大數(shù)目植物的系統(tǒng)。 已經(jīng)開發(fā)了可能用于高通量表型篩選的幾個追蹤系統(tǒng)。美國專利號6，483，434公開了容器追蹤系統(tǒng)，其包含用于追蹤多個容器或載具的計算機系統(tǒng)。出于輕易追蹤任何單個容器或載具的目的，將應(yīng)答器安置在容器或載具的本體上。美國專利號7，403，855公開了追蹤從培育地點如田野、培育床、試驗地或溫室長出和/或取得的各株植物的裝置和方法。與各株植物相關(guān)的機器可讀數(shù)據(jù)同對應(yīng)植物保持密切關(guān)聯(lián)。美國公開的申請?zhí)?004/0200146提供了與其中一株或多株植物正在生長的容器聯(lián)合使用的裝置。該容器已經(jīng)使自身與裝置關(guān)聯(lián)，該裝置用于接收查詢信號并通過發(fā)射唯一標(biāo)識符信號自動應(yīng)答。EP1157961公開了容器辨識裝置，其具有帶發(fā)送器和接收器單元的詢問裝置，使用脈沖信號以詢問標(biāo)識信息。該標(biāo)識信息由連接于該容器的標(biāo)簽提供，其中所述的容器起到表面波傳感器作用。
在開發(fā)用于自動化分析植物表型的系統(tǒng)中的另一項挑戰(zhàn)是需要移動巨大數(shù)目的植物。已經(jīng)開發(fā)了用于移動植物以產(chǎn)生植物的系統(tǒng)。美國專利號5，394，646公開了用于自動栽培作物的系統(tǒng)，該系統(tǒng)由用于以第一預(yù)定途徑運送籽苗以允許在第一組受控生長條件下處理籽苗的第一結(jié)構(gòu)、用于以第二預(yù)定途徑運送籽苗以允許在第二組受控生長條件下處理籽苗的第二結(jié)構(gòu)和用于將籽苗從第一結(jié)構(gòu)選擇性轉(zhuǎn)移到第二結(jié)構(gòu)上的結(jié)構(gòu)組成。GB 1576010提供了用于支撐材料或容器的裝置，其中可以在所述材料或容器中培育植物以沿溫室移動。該裝置包含了形成路徑的至少兩條被隔開的平行軌道、安裝在每條軌道上的用于沿軌道運動的滑行裝置和用于支撐所述材料或容器的一個或多個細長載具構(gòu)件。一個或多個載具構(gòu)件是所述軌道的橫向延伸的槽形式并且是沿軌道隨所述滑行裝置可移動的。美國專利號3，824，736公開了用于通過在傳送機上移動植物穿過回廊而連續(xù)產(chǎn)生植物的方法，在所述回廊中維持嚴密受控的溫度和濕度條件。該回廊由一系列模塊單元形成，所述模塊單元包括照亮的部分和變暗的部分。每個模塊單元排列為構(gòu)成一個M小時生長時期。美國專利號4，035，949公開了用于培育植物的設(shè)施，其包含多個包括無窮循環(huán)性支撐裝置的連續(xù)、獨立培養(yǎng)箱，其中在所述支撐裝置上移動植物穿過所述箱內(nèi)受控環(huán)境條件下的區(qū)域。 美國專利號4，481，893公開了用于大量培育溫室中籽苗的裝置，用于自動操作包含盆缽的籽苗單元。該裝置檢查每個盆缽是否具有可接受的籽苗并且任選地將替換籽苗自動插入需要替換籽苗的任何盆缽。
在確定植物表型中，關(guān)鍵是使環(huán)境差異最小化以確保育種系之間所觀察的任何差異歸因于遺傳變異并且不單純地由環(huán)境影響引起。在常規(guī)育種程序中，將植物在田間于幾個不同地點培育以使每種基因型暴露于一系列不同的環(huán)境條件。另一種方法是將植物培育于受控環(huán)境如溫室和生長箱中以提供更均勻環(huán)境條件。然而，幾個參數(shù)如溫度和光強度的差異仍經(jīng)常出現(xiàn)。雖然在隨機完全區(qū)組中培育植物可以幫助減輕環(huán)境差異的影響，但是這種方法要求培育每種基因型的幾個植株。作為使培育區(qū)范圍內(nèi)環(huán)境差異最小化的替代， 通過移動植物穿過該培育區(qū)提供更均勻的培育條件也是可能的。例如，美國公開的申請?zhí)?2006/0150490公開了用于育種植物的方法，其包括在受控氣候條件的環(huán)境下培育植物并且根據(jù)要求在環(huán)境內(nèi)部改變?nèi)萜鞯奈恢靡源_保容器中的全部植物至少基本上均勻暴露于該環(huán)境中的條件。
評價植物表型的另一個方面是確定種子品質(zhì)。種子品質(zhì)測量經(jīng)常要求除去種子的外層，即脫殼。開發(fā)用于育種程序的種子脫殼裝置提出了特殊挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的種子脫殼機處理大量的種子(幾公斤)或極少量的種子(10-50粒種子)，但是育種程序經(jīng)常要求分析現(xiàn)有脫殼機不容易加工的中間量的種子(50至1000粒種子)。另外，育種程序涉及加工巨大數(shù)目的種子批次，其中每個種子批次具有不同的基因型。因此，重要的是不混合來自不同批次的種子。常規(guī)脫殼機可以經(jīng)常將種子卡在該裝置的腔體中，從而導(dǎo)致污染。最后，由于種子批次之間的遺傳變異可以產(chǎn)生不同大小、形狀和外殼強度的種子，因此種子脫殼裝置必須能夠加工類型眾多的種子而不造成損傷。許多現(xiàn)有的種子脫殼機含有橡膠輥或凹面圓盤，其具有除去外殼的摩擦性涂層(如在例如美國專利號4，454，806中所述)。這些裝置的彎曲表面可以造成破裂，尤其用于長的單薄種子。種子脫殼機也可以集成到用于分選和加工種子的系統(tǒng)中。例如，美國專利號6，706，989公開了用于加工種子或種子樣品的的方法和裝置，其包括通過預(yù)編程標(biāo)準分選種子的自動分選機。任選特征可以包括計數(shù)器、清潔裝置、脫殼機和標(biāo)簽施加器。
如上提及，從植物組織提取DNA用于分析基因型在育種程序中是經(jīng)常需要的。WO 00/63362公開了用于從植物提取DNA的方法。該方法使用固定化陰離子基團通過陰離子交換相互作用分離DNA，所述的陰離子基團優(yōu)選地位于色譜基質(zhì)上或更優(yōu)選地位于用陰離子基團如二乙基氨基乙基(DEAE)所衍生化的磁珠上。美國專利號5，523，231公開了從溶液回收包括DNA在內(nèi)的生物聚合物的方法，其涉及使用不特異結(jié)合所述聚合物的可磁吸珠子。所述珠子懸浮于溶液中并且聚合物從溶液中沉淀出來并且與珠子非特異性結(jié)合。當(dāng)磁性地拉下珠子時，聚合物隨珠子一起拉下。聚合物隨后可以再溶解并與珠子分離。
植物育種要求幾個不同步驟，包括評估植物生長和形態(tài)學(xué)、加工種子批次和植物組織的遺傳學(xué)分析。雖然已經(jīng)取得對這些步驟自動化的初步進展，但是仍需要克服障礙并解決問題以集成這些部件至用于作物物種表型與遺傳分析的高度自動化的高通量系統(tǒng)中。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及用于分析遺傳修飾對植物的影響并選擇具有目的遺傳修飾的植物的方法。在一個方面，該方法包括
(a)提供生長在受控環(huán)境條件下的多株植物，每株植物與區(qū)分該植物與其余植物的機讀標(biāo)識關(guān)聯(lián)；
(b)將植物在它們的生長周期期間以一個或多個時間間隔在自動化輸送器系統(tǒng)中移動，從而避免對特定微觀環(huán)境的延長暴露，因而減少微觀環(huán)境差異對植物表型的影響；
(c)將一株或多株植物在其生長周期期間以一個或多個時間間隔運送穿過用于植物成像的連續(xù)系統(tǒng)，其中用于成像的系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)動機構(gòu)和成像裝置，其中將植物以受控方式轉(zhuǎn)動和成像或移動成像裝置旨在以受控方式對植物成像；
(d)使植物移動穿過成像系統(tǒng)的同時，對植物的一個或多個特征成像；
(e)通過計算機處理分析植物的一個或多個特征的圖像并且將所得信息與植物的機讀標(biāo)識信息關(guān)聯(lián)；
(f)針對一株或多株植物的一個或多個特征分析所得信息以確定遺傳修飾的影響；并且
(g)選擇具有目的遺傳修飾的一株或多株植物或傳達來自分析步驟e)和/或f) 的信息至其他人以選擇具有目的遺傳修飾的一株或多株植物。
在一個實施方案中，該方法中所用的轉(zhuǎn)動機構(gòu)包括同步帶，其中同步帶和/或容器以高摩擦材料涂布。同步帶如此安置以扣住容器的側(cè)面并可以具有不同速度設(shè)置，允許容器以受控方式轉(zhuǎn)動同時在該帶上被運送。[0022]在一個實施方案中，該成像系統(tǒng)包括一臺或多臺高速和/或高分辨率照相機。
在另一個方面，本發(fā)明涉及用于高通量分析植物中遺傳性狀的植物育種系統(tǒng)，其包括
(a)受控條件的環(huán)境與受控的養(yǎng)分及補給水供應(yīng)下，裝有具有一致特征的培育介質(zhì)的容器陣列，每個容器包含一株或多株植物并且每個植物或容器同機讀標(biāo)識關(guān)聯(lián)，所述機讀標(biāo)識區(qū)分該植物或容器與其余植物或容器；
(b)包括多個共延性存儲輸送器和一個轉(zhuǎn)移傳送機的輸送器系統(tǒng)，
其中存儲輸送器為一列幾個容器提供支撐，其中每個存儲輸送器包含由馬達移動的皮帶，并且其中存儲輸送器的皮帶可以由馬達向后或向前牽引，從而允許容器運送至存儲輸送器或從中運走；
其中轉(zhuǎn)移傳送機毗鄰于存儲輸送器的末端部分并與存儲輸送器協(xié)作；
(c)與輸送器系統(tǒng)聯(lián)合的一臺或多臺馬達，其中存儲輸送器末端與轉(zhuǎn)移傳送機通訊，從而允許容器從存儲輸送器至存儲輸送器運回和/或運走并且向該陣列中的特定區(qū)域運回和/或運走；
(d)用于對植物作數(shù)字成像的連續(xù)系統(tǒng)，其包含在植物以受控方式被轉(zhuǎn)動和成像的同時，用于植物的生長周期期間以一個或多個時間間隔移動一株或多株植物穿過數(shù)字成像系統(tǒng)的輸送器系統(tǒng)、用于以受控方式轉(zhuǎn)動容器的帶機構(gòu)和一個或多個數(shù)字成像裝置；和
(e)計算機裝置，其用于分析圖像和/或信息，所述的圖像和/或信息從移動植物穿過數(shù)字成像系統(tǒng)移動時用一個或多個數(shù)字裝置所取得的植物一個或多個特征的數(shù)字圖像和/或信息獲得。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及開發(fā)改善植物育種的可出售信息的方法，其包括
(a)提供生長在受控環(huán)境條件下的多株植物，每株植物與區(qū)分該植物與其余植物的機讀標(biāo)識關(guān)聯(lián)；
(b)通過在植物的生長周期期間以一個或多個時間間隔在自動化輸送器系統(tǒng)中移動植物，從而避免對特定微觀環(huán)境的延長暴露，因而減少微觀環(huán)境差異對植物表型的影響；
(c)將一株或多株植物在其生長周期期間以一個或多個時間間隔連續(xù)運送穿過成像系統(tǒng)，該成像系統(tǒng)含有用于以受控方式轉(zhuǎn)動植物或成像裝置的轉(zhuǎn)動機構(gòu)；
(d)使植物移動穿過成像系統(tǒng)時，拍攝植物的一個或多個特征的圖像并且存貯圖像于計算機或處理裝置上；
(e)通過計算機處理分析植物的一個或多個特征的圖像并且將所得信息與植物的機讀標(biāo)識信息關(guān)聯(lián)；和
(f)針對一株或多株植物的一個或多個特征分析所得的信息；
(g)其中圖像和/或所得的信息提供了用于植物育種系統(tǒng)中做出植物鑒定和/或選擇決定的可出售信息。
本發(fā)明還涉及用于收集關(guān)于所選擇植物表型的數(shù)據(jù)以快速分析遺傳修飾對所選擇表型的影響的方法，其包括
(a)提供生長在受控環(huán)境條件下的多株植物，每株植物與區(qū)分該植物與其余植物的機讀標(biāo)識關(guān)聯(lián)；
(b)通過在植物的生長周期期間以一個或多個時間間隔在自動化輸送器系統(tǒng)中移動植物，從而避免對特定微觀環(huán)境的延長暴露，因而減少微觀環(huán)境差異對植物表型的影響；
(c)將一株或多株植物在其生長周期期間以一個或多個時間間隔運送穿過成像系統(tǒng)，該成像系統(tǒng)含有用于以受控方式轉(zhuǎn)動植物或成像裝置的轉(zhuǎn)動機構(gòu)；
(d)使植物移動穿過成像系統(tǒng)的同時，拍攝植物的一個或多個特征的圖像并且存貯圖像于計算機或處理裝置上；
(e)通過計算機處理分析植物的一個或多個特征的圖像并且將所得信息與植物的機讀標(biāo)識信息關(guān)聯(lián)；和
(f)針對一株或多株植物的一個或多個特征分析所得的信息；并且
(g)收集來自步驟f)和/或g)的關(guān)于所選擇植物表型的信息以快速分析遺傳修飾對所選擇表型的影響。
附圖簡述

圖1是說明性裝置的輸送器系統(tǒng)的示意圖。
圖2是支撐植物缽的輸送器系統(tǒng)的槽形構(gòu)件和傳送帶的透視圖。
圖3代表了顯示皮帶轉(zhuǎn)動機構(gòu)的成像系統(tǒng)。圖3A顯示俯視圖并且圖:3B顯示側(cè)視圖。
圖4代表種子脫殼系統(tǒng)的實施方案，其中接受器與塊體之間的運動是通過轉(zhuǎn)動。 圖4A描述接受器轉(zhuǎn)動的系統(tǒng)并且圖4B描述塊體轉(zhuǎn)動的系統(tǒng)。
圖5顯示在本發(fā)明連續(xù)系統(tǒng)與常規(guī)停止-啟動系統(tǒng)中所測量的葉面積之間的密切相關(guān)性。
圖6顯示與常規(guī)停止-啟動系統(tǒng)(舊系統(tǒng))相比在實現(xiàn)連續(xù)系統(tǒng)(新系統(tǒng))后每日成像流通量的增加。
圖7顯示不同實驗/方法(#種子+壓力)的結(jié)果，其展示為起始材料的脫殼種子百分數(shù)。
圖8描述了自動進樣盤。
圖9描述了雙重密封小瓶系統(tǒng)。
圖10顯示分子化合物的雙磁體提取系統(tǒng)。
本發(fā)明示例性實施方案的詳細描述
本發(fā)明為植物育種系統(tǒng)提供植物中遺傳性狀的高通量分析。本發(fā)明也包括令人驚奇的高效方法，所述方法用于測量遺傳修飾對植物的影響并使用該數(shù)據(jù)選擇具有目的遺傳修飾的植物和用于選擇性能最佳的候選者。所述方法提供對育種程序中植物表型和植物基因型的自動化高通量分析。
為成功育種，應(yīng)當(dāng)檢驗足夠數(shù)目的遺傳變異以鑒定眾多遺傳變異當(dāng)中具有農(nóng)學(xué)重要性的少數(shù)遺傳變異。用于選擇基因型的方法應(yīng)當(dāng)對檢測不同基因型之間的表型差異是足夠區(qū)分的，并且要求足夠詳細以充分描述所觀察表型的一組參數(shù)作為基礎(chǔ)。
本發(fā)明的系統(tǒng)和/或方法允許以出人意料高效的方式和比田間或受控條件下所進行的傳統(tǒng)植物育種評價和選擇系統(tǒng)大得多的規(guī)模(提供一年中處理成千至上萬個遺傳修飾的能力)評價和選擇遺傳修飾。
甚至在受控環(huán)境或溫室背景下在定義的基質(zhì)上以受控的水和養(yǎng)分供應(yīng)培育植物時，環(huán)境條件仍隨溫室內(nèi)部的幾何位置變動。這種環(huán)境差異可能歸因于植物之間距離的差異和接近或歸因于用于氣候控制和養(yǎng)分/水輸送的裝置，例如加熱元件、冷卻元件、窗戶、 門、噴霧裝置、通風(fēng)設(shè)備、入水口和出水口。在本發(fā)明的一個方面，通過自動化操作和通過改變正在生長的植物在溫室或受控環(huán)境中的位置明顯減少環(huán)境差異。
本發(fā)明的另一個方面提供了改善的成像系統(tǒng)，其明顯增加系統(tǒng)的流通量同時維持準確度。
本發(fā)明還提供了改善的用于植物育種的方法，其中可以使用比常規(guī)育種方法中更小的種子量實施植物育種。本發(fā)明的另一個方面涉及改善的方法，其用于加工和/或分析在用于培育的準備中或在選擇具有目的遺傳修飾的植物后的種子。
本發(fā)明的系統(tǒng)在另一個方面涉及改善的DNA提取和分離法以在用于該系統(tǒng)內(nèi)培育的準備中或在選擇具有目的遺傳修飾的植物后表征植物或種子的基因型。
植物材料
本發(fā)明的系統(tǒng)高度地適應(yīng)于多種作物物種，包括那些具有巨大尺寸和形態(tài)學(xué)復(fù)雜度的作物物種。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，育種過程的植物對象是自花傳粉的植物，如稻。自花傳粉植物是這樣一種植物，其中正常條件下任意一種給定植物物種的雌性器官由相同植物物種的雄性器官中產(chǎn)生的花粉授粉。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，育種過程的植物對象是開放傳粉的植物物種，如玉米。 開放傳粉植物物種是作為基本上為非自花傳粉植物物種的植物。就玉米而言，存在與使用相對小或短且快周期的植物相關(guān)的特殊優(yōu)勢，其中所述植物具有比較短的、優(yōu)選約4月或更短的周期時間。這些植物可以是不同的品種、雜種、近交種或群體如fespe或衍生自 Gaspe (例如來自多世代自交)的任何近交系。
植物對象可以是其他自花傳粉和非自花傳粉的作物物種，包括但不限于小麥、大麥、黑麥、高粱、卡諾拉油菜、大豆、燕麥、甘蔗、甜菜、向日葵、煙草、棉花、苜蓿和亞麻。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的系統(tǒng)涉及轉(zhuǎn)基因植物的育種。轉(zhuǎn)基因植物的育種涉及通過使用重組技術(shù)將至少一種核酸導(dǎo)入單株植物中。不同的植物可以具有導(dǎo)入其中的相同或不同核酸。植物轉(zhuǎn)化方法的實例是本領(lǐng)域熟知的并且包括，但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和粒子加速或"基因槍"轉(zhuǎn)化技術(shù)。可以將核酸摻入能夠?qū)胨拗骷毎胁⒃谄渲袕?fù)制的重組DNA構(gòu)建體。這種構(gòu)建體可以是載體，其包括能夠在給定宿主細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼多肽的序列的復(fù)制系統(tǒng)和序列。已經(jīng)描述了適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細胞或適用于建立轉(zhuǎn)基因植物的眾多載體。轉(zhuǎn)化的植物細胞可以由已知方法再生成完整植物。隨后培育并評價轉(zhuǎn)基因植物以鑒定具有想要性狀的植物。轉(zhuǎn)基因植物可以與其他轉(zhuǎn)基因植物和/或與不含有所導(dǎo)入核酸的相應(yīng)對照植物比較。具有想要性狀的植物可以進一步在田間評價或可以與相同作物物種的近交系的不同品種回交或可以用來生成或測試雜交種或可以用于產(chǎn)生可能用于商業(yè)用途的種子。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化法是用于將基因轉(zhuǎn)移至植物中的最廣泛使用的方法之一。 農(nóng)桿菌是土壤中發(fā)現(xiàn)的天然存在的病原細菌，其具有轉(zhuǎn)移自身DNA至植物基因組中的能力。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于轉(zhuǎn)化單子葉植物、尤其禾本科植物、優(yōu)選稻的改善方法。這種改善的方法涉及改善歐洲專利申請EP1198985中所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法，所述專利的內(nèi)容在此通過引用的方式并入。
如今，例行地進行單子葉植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；一項曾認為限于轉(zhuǎn)化某些雙子葉植物(其種子中具有兩片子葉和具有闊葉的開花植物)如馬鈴薯和番茄的技術(shù)。單子葉植物或單子葉植物(monocot)是其種子中具有一片子葉和具有帶平行葉脈的窄葉的開花植物，如玉米和稻。
根癌農(nóng)桿菌是將其基因天然地插入植物的常見土壤細菌。在這個過程中，農(nóng)桿菌引起通常在根與莖的交界處看到的植物腫瘤，從中衍生出名字-冠纓病。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化法有利地利用這種自然現(xiàn)象作為導(dǎo)入外來基因至植物中的手段。
農(nóng)桿菌的特征在于以其感染植物時，存在于農(nóng)桿菌擁有的質(zhì)粒(例如Ti質(zhì)?；騌i 質(zhì)粒)上的T-DNA區(qū)域被摻入該植物。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)利用T-DNA區(qū)域摻入植物作為導(dǎo)入基因至植物中的手段。簡而言之，以含有想要的重組基因的農(nóng)桿菌感染植物。感染后，想要的重組基因從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到植物細胞中，從而被摻入植物基因組中。
本領(lǐng)域已知T-DNA通過農(nóng)桿菌向植物轉(zhuǎn)移的效率可能根據(jù)用于轉(zhuǎn)化的組織變動。 例如，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的多種方案依賴于愈傷組織轉(zhuǎn)化、早熟胚轉(zhuǎn)化、葉、枝頂端、根、下胚軸、子葉、種子和從植物多個部分衍生的愈傷組織。在其他方法中，轉(zhuǎn)化的組織不從植物取下，而留在其自然環(huán)境中，因而，轉(zhuǎn)化以植物原位方式發(fā)生。
找到快速和高效的用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法會是有利的，尤其在構(gòu)成世界大多數(shù)人口主食的經(jīng)濟重要的作物植物(如稻、谷物、小麥、大麥)的情況下。
因此，提供了用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法，包括步驟
(i)將包含目的基因的農(nóng)桿菌導(dǎo)入綠色種子；
(ii)培育該種子以產(chǎn)生包含所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
如本文中提到的術(shù)語“綠色種子”是以增加的優(yōu)選順序在授粉后約15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 日的種子。
術(shù)語“單子葉植物”或“單子葉植物(monocot) ”在本文中互換用來指其種子中具有一片子葉和具有帶平行葉脈的窄葉的開花植物。優(yōu)選地，單子葉植物是包括禾本科植物， 其包括禾谷類如稻、小麥、玉米和其他經(jīng)濟重要作物植物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，待轉(zhuǎn)化的植物是稻(Oryza sativa)。雖然發(fā)現(xiàn)所述方法特別有利于秈稻品種，但是本發(fā)明的方法適用于全部稻品種。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，使用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的綠色種子。
適于表達植物中目的基因的表達載體和用于制造所述載體的工具和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。術(shù)語“目的基因”指從任何來源獲得或人工合成的待導(dǎo)入植物的任何基因。該目的基因可以對待轉(zhuǎn)化的單子葉植物為內(nèi)源的，例如，從稻獲得的基因可以轉(zhuǎn)化到稻中。該目的基因也可以是靶內(nèi)源基因的反義序列。
目的基因與用于單子葉植物中表達目的基因的啟動子有效連接。該啟動子可以對目的基因是天然的(內(nèi)源啟動子)或它可以來自另一個來源(外源啟動子)。
表達載體也可以包含促進選擇轉(zhuǎn)化植物的選擇標(biāo)記基因。藥物抗性基因如賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因和賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 II(NPTII)基因是選擇標(biāo)記的實例。啟動子也有效地與選擇標(biāo)記連接以允許該選擇標(biāo)記基因的表達。
終止子序列也可以存在于表達載體中。終止子序列位于基因區(qū)域的下游并編碼在 DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA以及添加聚腺苷酸序列時參與轉(zhuǎn)錄終止的蛋白質(zhì)。終止子的非限制性實例包括CaMV35S終止子和胭脂堿合酶終止子(T nos)。
增強子也可以用于表達載體中以增強靶基因的表達效率。
如下文中定義的綠色種子用農(nóng)桿菌感染以導(dǎo)入目的基因至植物中。在除去待轉(zhuǎn)化的植物的綠色種子的殼后，預(yù)培養(yǎng)完好狀態(tài)下的種子。綠色種子為“完好”的意指該種子沒有經(jīng)歷任何人工操作，例如除去胚珠或胚盤的疤痕化。
在預(yù)培養(yǎng)中，將綠色種子播種在含有適宜濃度植物生長素(例如，2，4_D)的培養(yǎng)基(例如N6D培養(yǎng)基)上并且可以孵育一般4至5日，并且優(yōu)選地5日。預(yù)培養(yǎng)在種子組織進入再生過程之前結(jié)束。預(yù)培養(yǎng)期間的溫度一般是25°C至35°C，并且優(yōu)選地是27°C至 32°C。在結(jié)束預(yù)培養(yǎng)后，將種子消毒并隨后用水徹底洗滌。隨后用農(nóng)桿菌在無菌操作下感染種子。
在農(nóng)桿菌感染(共培養(yǎng))期間，將種子在黑暗中孵育，一般2至5日并且優(yōu)選3日。 在這個時間的溫度一般是^rc至和優(yōu)選地是^°c。隨后，為了消除培養(yǎng)基中的農(nóng)桿菌，種子經(jīng)適宜的除菌劑(例如羧芐青霉素)處理。基于選擇標(biāo)記(例如，藥物抗性如潮霉素抗性)選擇轉(zhuǎn)化的種子。
在適宜的細菌消除條件和選擇條件下培養(yǎng)后，選擇的轉(zhuǎn)化種子置于含有適宜植物調(diào)節(jié)物質(zhì)的再生培養(yǎng)基(例如，MS培養(yǎng)基)并孵育適宜的時間期限。為允許植物體再生， 再生的轉(zhuǎn)化體置于生根培養(yǎng)基(例如，不含有植物調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基)。在證實根的生長后，可以盆栽轉(zhuǎn)化體。
可以通過使用熟知技術(shù)證實想要的重組基因是否已經(jīng)導(dǎo)入植物。這種證實可以例如通過RNA印跡分析進行。具體而言，總RNA從再生植物的葉提取、進行瓊脂糖上變性條件下的電泳并且隨后印跡到適宜的膜上。通過允許與所導(dǎo)入基因的一部分互補的標(biāo)記RNA探針與印跡物雜交，可以檢測目的基因的mRNA。備選地，在希望通過導(dǎo)入想要的重組基因控制植物中內(nèi)源基因表達的情況下，可以測試靶內(nèi)源基因的表達，例如，通過前述的RNA印跡分析。如果靶內(nèi)源基因的表達與未轉(zhuǎn)化的對照植物中其表達相比被顯著抑制，則證實想要的重組基因已經(jīng)導(dǎo)入該植物并且想要的重組基因已經(jīng)發(fā)揮控制表達的作用。
在農(nóng)桿菌感染之前，常規(guī)方法通常要求3至4周時間以誘導(dǎo)再生。相反，本發(fā)明的方法不要求誘導(dǎo)再生的步驟，從而可以減少產(chǎn)生轉(zhuǎn)化單子葉植物所要求的日數(shù)。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法，也可能減少通過常規(guī)技術(shù)選擇所需要的時間，從而可以減少培養(yǎng)差異的影響。
可以在本發(fā)明一個方面使用的重組DNA技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且在例如 Sambrook(2001)Molecular Cloning -.a laboratory manual, 3 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH，New York (其因而通過引用的方式完整并入)或在Ausubel等人 (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (其因而通過弓| 用的方式完整并入)的第1和2卷中描述。用于植物分子生物學(xué)工作的標(biāo)準材料和方法在 BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的 R. D. D. Croy 的 Plant Molecular Biology Labfase (1993)(其因而通過引用的方式完
14整并入)中描述。
本發(fā)明的其他方面涉及非轉(zhuǎn)基因植物的育種。在非轉(zhuǎn)基因植物的育種中，遺傳變異的產(chǎn)生依賴于可以通過技術(shù)獲得的遺傳改變的產(chǎn)生，所述技術(shù)包括通過經(jīng)典雜交、化學(xué)誘變、輻射誘導(dǎo)突變、體細胞雜交、種間雜交和遺傳工程的重組。獲得的植物可以與其他非轉(zhuǎn)基因植物、與轉(zhuǎn)基因植物和/或與相應(yīng)的對照植物比較。在產(chǎn)生基因型變異后，選擇具有最想要的農(nóng)學(xué)表型的那些基因型。
表型評價
表型(例如基于生長習(xí)慣、產(chǎn)量潛力和脅迫抗性的觀察)是因基因型本身(基因相關(guān)表型)和因環(huán)境(環(huán)境相關(guān)表型)貢獻的結(jié)果。環(huán)境相關(guān)表型受到因例如溫度、濕度、 光、養(yǎng)分和水供應(yīng)的變異所引起的培育環(huán)境差異影響?；煜硇屯苿有阅康幕蛐瓦x擇的一個重要因素是環(huán)境相關(guān)表型組分的變異。
本發(fā)明因此提供了育種植物的方法，其包括在受控氣候條件的環(huán)境下于裝有具有一致特征的培育介質(zhì)的容器陣列中培育某種植物，所述環(huán)境具有受控的養(yǎng)分及補給水供應(yīng)，并且根據(jù)需要改變?nèi)萜髟谠摥h(huán)境內(nèi)部的位置以確保容器中的全部植物至少基本上均勻地暴露于環(huán)境中的條件。
本發(fā)明方法產(chǎn)生多種明顯和出乎意料的優(yōu)勢。它能夠有效地消除影響植物表型并因此干擾選擇想要的基因型相關(guān)表型的環(huán)境差異。通過改變植物在其生活周期期間的位置，使它們在每個位置暴露于略微不同的環(huán)境設(shè)置。當(dāng)育種群體中全部植物的調(diào)換以足夠高的頻率(例如每日一次或每周一次)發(fā)生時，則發(fā)現(xiàn)空間效應(yīng)在該群體范圍內(nèi)是隨機化的。育種期間減弱植物表型的環(huán)境貢獻能夠更可靠地選擇想要的基因型。通過改變的植物位置促進鑒定表型(如，不限于生長、產(chǎn)量或脅迫耐受性)的步驟。例如，在通過適宜設(shè)備評價植物表型的情況下，可以按適宜間隔移動植物至用于評估的設(shè)備的位置。培育植物的環(huán)境的增強均勻性允許使用更小的植物群體用于研究，這反過來降低成本。與要求大得多的植物群體(一般以田間規(guī)模)旨在精確評估不同基因型相關(guān)的表型差異的常規(guī)方法相比，使用出乎意料更小的植物群體(一般以溫室規(guī)模)，本發(fā)明的實施允許對多種農(nóng)學(xué)特征育種，如增強的產(chǎn)量和脅迫耐受性。該方法能夠令人驚奇地進行更高效植物育種。給定可以被研究的遺傳變異的固定數(shù)目和所要求區(qū)分力的固定水平，因為在有限的種子可獲性的條件(在產(chǎn)生遺傳變異后的世代中經(jīng)常是這樣)下可靠地建立表型的能力，可以減小代表某個遺傳變異的群體的尺寸。本發(fā)明系統(tǒng)的區(qū)分力因而減少大面積種子繁殖的需求并減少后續(xù)時間損失。
在能夠用比現(xiàn)有技術(shù)方法可能需要的量更小種子量實施育種過程方面固有的優(yōu)勢在就多種想要的表型特征(性狀)對轉(zhuǎn)基因植物育種的情況下是特別相關(guān)的。
本發(fā)明方法優(yōu)選地包括在生長周期中以一個或多個時間間隔鑒定表型特征如植物的生長、產(chǎn)量和對生物脅迫和非生物脅迫的耐受性?？梢酝ㄟ^測量例如植物高度、葉面積、種子大小、種子重量、種子數(shù)目、種子頭的大小(包括玉米中的玉米穗大小、果實的數(shù)目和大小、花序的存在、數(shù)目和大小及根面積、大小和形態(tài)來評價產(chǎn)量。生物脅迫可以例如由細菌病、真菌病、或病毒病、昆蟲和線蟲引起。非生物脅迫可以例如由熱、干旱、寒冷、風(fēng)、高鹽度和低養(yǎng)分水平引起?？梢栽诘宛B(yǎng)分水平下培育植物以評價特定化合物(例如氮和磷) 的使用效率。也可以評價植物的水使用效率。生物和非生物脅迫的作用可以通過測量葉顏
15色和形態(tài)學(xué)或可觀察的物理表現(xiàn)直接評價或通過測量生長特征如植物高度、葉面積、植物形態(tài)和/或產(chǎn)量間接評價。可以通過植物多個部分的數(shù)字成像系統(tǒng)實施表型評價。圖像分析可以提供對例如植物高度、葉面積、生物量的重心高度、根面積、綠色指數(shù)、穗/花序的存在和/或數(shù)目的測量或指示。
根據(jù)需要，可以使用算法來選擇和評價信息并且可以統(tǒng)計分析結(jié)果以鑒定具有目的遺傳修飾的植物，以選擇性能最好的候選者或為任何給定的其他方法選擇具有任何給定特征的候選者和/或鑒定性狀引導(dǎo)。
在另一個實施方案中，植物生活周期期間以一個或多個時間間隔實施一個或多個植物特征的多種測量。隨時間的測量允許計算例如最大植物高度、最大葉面積、生長周期的長度、出苗勢、開花時間、開花前綠色。如果施加脅迫，可以額外地計算參數(shù)如脅迫后綠色、 因脅迫所致的生物量減少。用于進行這類測量的工具和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
在一個實施方案中，可以根據(jù)需要使用和/或改造本發(fā)明的方法和/或系統(tǒng)以基于單株植物確定開花和/或花期的開始，例如，通過從植物生殖結(jié)構(gòu)的圖像測量這些結(jié)構(gòu)和從量值和平均生長速率推斷開花和/或花期的開始，如因而在此通過引用方式完整并入的 W 2007/093444 中所述。
優(yōu)選地，評價以高通量方式進行。與常規(guī)的溫室評價系統(tǒng)相比，高通量系統(tǒng)令人驚奇地允許處理和評價更多數(shù)目的植物。
還優(yōu)選地，通過比較植物的表型特征選擇植物用于進一步育種、用于育種實驗或進展實驗或用于商業(yè)用途。
植物鑒定
為了本發(fā)明的育種系統(tǒng)以可靠、高效和無人值守方式運行，可以通過自動化裝置鑒定植物。園藝產(chǎn)業(yè)中鑒定植物是一項常規(guī)實踐。最廣泛使用的標(biāo)識系統(tǒng)是有色標(biāo)簽、印刷文字標(biāo)簽和條形碼標(biāo)簽。由于自動化輸送系統(tǒng)變得更復(fù)雜，對下述系統(tǒng)的需求增加，所述系統(tǒng)精確地提供關(guān)于植物(或植物批次)位于溫室中何處、植物的歷史位置和/或操作和 /或這些植物特征方面的在線概覽。
在本發(fā)明的一個方面，植物(或植物批次)以唯一標(biāo)識符鑒定。每個容器的唯一標(biāo)識符和來自每株植物的信息可以明確地與計算機裝置中的這種標(biāo)識符聯(lián)系。優(yōu)選地，該信息本身(與植物鑒定標(biāo)簽關(guān)聯(lián)的特定植物的信息)存儲于數(shù)字數(shù)據(jù)庫中。
本發(fā)明在其多個方面之一提供適合與下述容器聯(lián)合使用的裝置，在所述容器中一株或多株植物正在生長并且所述容器已經(jīng)與接收查詢信號并通過發(fā)射唯一標(biāo)識符信號自動應(yīng)答的裝置連接。所述裝置包含
(a)輸送器系統(tǒng)，通過其可以支撐容器用于移動容器，
(b)用于發(fā)射查詢信號的裝置，
(c)用于記錄標(biāo)識符信號作為數(shù)字輸出的裝置，和
(d)計算機裝置，其支持數(shù)字輸出用于以規(guī)定格式存儲數(shù)據(jù)于數(shù)據(jù)庫中用于操作， 以提供與該容器關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)的比較。
在本發(fā)明這個方面的裝置中，查詢信號和標(biāo)識符信號優(yōu)選地是無線電信號，不過其他形式的通訊處于本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括但不限于通過使用條形碼讀出器(1D，2D)辨識或通過視覺(照相機)識別字符、數(shù)字或符號來辨識。[0116]便利地，用于接收查詢信號并通過發(fā)射唯一標(biāo)識符信號自動應(yīng)答的裝置由充當(dāng)小天線的銅線圈和存儲信息的芯片組成，如在此通過引用方式完整并入的美國申請公開號 2004/0200145中描述。此類裝置在下文稱作應(yīng)答器。這種形式的裝置體現(xiàn)了植物存貨系統(tǒng) (例如在溫室中)，其提供植物批中各株植物位置的在線概覽。本系統(tǒng)的原理是每個植物容器用一個應(yīng)答器標(biāo)記并且這些應(yīng)答器由沿著輸送系統(tǒng)定位的應(yīng)答器讀出器讀出。讀出器的地理位置的信息連同經(jīng)過讀出器的應(yīng)答器的身份允許概覽植物在溫室中的位置。
應(yīng)答器信息也可以用于關(guān)聯(lián)植物在整個系統(tǒng)中的歷史定位、對植物的操作(如養(yǎng)分或水供應(yīng)或通過該系統(tǒng)的多種數(shù)字部件)和/或關(guān)聯(lián)在該系統(tǒng)的多種部件中所獲得的植物特征。應(yīng)答器信息可以優(yōu)選地由算機裝置關(guān)聯(lián)。
自動化輸送裝置
本發(fā)明提供在受控氣候條件的環(huán)境與受控的養(yǎng)分及補給水供應(yīng)下于裝有具有一致特征的培育介質(zhì)的容器陣列中培育某物種的植物，并且根據(jù)需要改變?nèi)萜髟谠摥h(huán)境內(nèi)部的位置以確保容器中的全部植物至少基本上均勻地暴露于環(huán)境中的條件。
在本發(fā)明的方法中，可以連續(xù)或間隔地改變?nèi)萜鞯奈恢?。在一個優(yōu)選的方法中，由操作員根據(jù)對植物生長特征的觀察以預(yù)設(shè)的程度和時間間隔改變這些容器。可以以長達2 周的間隔、優(yōu)選地6小時至2周、更優(yōu)選地以1日至1周的間隔改變?nèi)萜髟诃h(huán)境內(nèi)部的位置。 優(yōu)選地可以按自動化方式或自動改變?nèi)萜髟诃h(huán)境內(nèi)部的位置。一個優(yōu)選的裝置以含有植物的盆缽形式支持容器陣列。雖然植物可以與盆缽中或淺盤中或由物理連接的盆缽組成的淺盤中的幾株個體一起培育，但是優(yōu)選地，每個盆缽中培育一株植物。
適用于本發(fā)明方法中的裝置優(yōu)選地包含輸送器系統(tǒng)，其上以水平放置的均勻陣列中支持容器，如在此通過引用方式完整并入的美國申請公開號2006/0150490中描述的系統(tǒng)。在一個實施方案中，該輸送器系統(tǒng)包括多個共延性存儲輸送器和一個轉(zhuǎn)移傳送機，每個共延性存儲輸送器包含“U”型槽，該“U”型槽配備有平臥于該槽底部上的皮帶。在另一個實施方案中，皮帶借助馬達如電動機在槽內(nèi)移動。在下文所述裝置的一個實施方案，提供往復(fù)自動機，它們可以本身位于特定槽的前面，并且可以開動自動機中的馬達以牽引該槽中的皮帶后退或前進，因而將容器運送入和運送出該槽。槽的末端與轉(zhuǎn)移傳送機連通，從而可以將容器從槽至槽運回和運走并且向陣列中的特定區(qū)域運回和運走。優(yōu)選地，使馬達連續(xù)地或以時間間隔(例如以6小時至2周間隔、更優(yōu)選地以1日至1周間隔)移動容器。因而， 存儲輸送器可以由馬達移動以移動該存儲輸送器上所支撐的成行容器至第一轉(zhuǎn)移站，在所述轉(zhuǎn)移站處該行最末端的容器被轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移傳送機，可以運行該轉(zhuǎn)移傳送機以移動其上所支撐的容器至第二轉(zhuǎn)移站并且可以運行第二存儲輸送器的馬達以收集該容器。
在本發(fā)明的方法中，考慮容器中植物或諸植物占據(jù)的體積，將容器在可行的情況下緊密放置。
圖1和圖2中繪制的說明性裝置適合與植物盆缽(10)(圖2)形式的多個容器聯(lián)合使用，在所述的植物盆缽中一株或多株植物正生長于為該目的所選擇的介質(zhì)中。
該裝置包含了輸送器系統(tǒng)(20)，盆缽?fù)ㄟ^其支撐并根據(jù)需要移動(圖1)。輸送器系統(tǒng)00)包括多個共延性存儲輸送器(22)，每個共延性存儲輸送器為一列幾個盆缽提供支撐，存儲輸送器彼此毗鄰布置以支撐水平部署的陣列中的成行盆缽。每個存儲輸送器 (22)包含槽形構(gòu)件，其由相鄰于毗鄰槽以平行關(guān)系固定的剛性“U”型槽04)提供。環(huán)帶(26)在每個槽內(nèi)部運行(圖2)并且以上表面位于槽內(nèi)并安排為沿該槽被牽引。每條帶 (26)支撐一行緊密分隔的盆缽(10)。使槽04)以其末端部分接近橫跨槽04)存在的轉(zhuǎn)移傳送機08)的傳送帶(30)定位。
使用電氣操作的往復(fù)自動機(32，34)來驅(qū)動槽04)中皮帶Q6)的運動。該運動導(dǎo)致盆缽運送至或運離傳送帶(30)。提供馬達以連續(xù)地移動傳送帶(30)。當(dāng)皮帶06)在其槽內(nèi)以一個方向移動時，將該皮帶所支撐的成行盆缽向轉(zhuǎn)移站移動，在所述轉(zhuǎn)移站處該行最末端的盆缽被轉(zhuǎn)移至傳送帶(30)。當(dāng)以另一個方向移動時，皮帶06)將該皮帶上所支撐的成行盆缽從傳送帶(30)移開，為待導(dǎo)入該行末端的盆缽騰出空間。將每臺往復(fù)自動機(32，34)排列以沿著傳送帶(30)移動，從而它可以根據(jù)需要分別與所述槽連通。它們具有相似的結(jié)構(gòu)并包含用于引導(dǎo)沿傳送帶(30)移動的盆缽的引導(dǎo)構(gòu)件(未顯示)。氣動操作的活塞和汽缸裝置的氣缸(未顯示)安裝在引導(dǎo)構(gòu)件之間的往復(fù)自動機上并且安排其活塞跨傳送帶(30)并在其上方水平運動。在其靜止位置，活塞起到阻止盆缽從槽中被槽內(nèi)皮帶06)運送的作用。當(dāng)想要從傳送帶(30)移走盆缽時，驅(qū)動活塞以推動盆缽和驅(qū)入所選擇的槽(22) 0
歷史位置數(shù)據(jù)連同肥料、澆水和任何其他相關(guān)數(shù)據(jù)能使該裝置的操作員保持追蹤陣列中每單株植物的營養(yǎng)方案。該信息也能使操作員以最高效的方式規(guī)劃全部植物的運動。
裝置如此安排，從而往復(fù)自動機應(yīng)答于數(shù)據(jù)庫所包含的數(shù)據(jù)被開動，從而將盆缽從一個位置移動至另一個位置。
植物成像系統(tǒng)
該系統(tǒng)的另一個方面包括工作站或成像系統(tǒng)，在這里對容器中植物或諸植物進行一個或多個成像操作。
由于許多植物的對對稱形狀，想要來自幾個角度的植物圖像。存在使植物繞固定可轉(zhuǎn)動或旋轉(zhuǎn)臺轉(zhuǎn)動同時被拍照的許多系統(tǒng)。本發(fā)明的一個方面涉及改善的機構(gòu)，其令人驚奇地在植物以高速度移動穿過成像系統(tǒng)時給出轉(zhuǎn)動運動和植物位置的絕對精確性。優(yōu)選地，植物穿過該系統(tǒng)的運動是連續(xù)的。
本發(fā)明的一個方面涉及數(shù)字成像系統(tǒng)，其中制造所述數(shù)字成像系統(tǒng)旨在同時移動和轉(zhuǎn)動植物時對植物成像，以能夠取得植物全部側(cè)面的圖像并以數(shù)字形式存儲這些圖像。
在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)動成像裝置而非植物，旨在連續(xù)地移動植物穿過該系統(tǒng)時從不同角度取得植物的圖像。
該裝置包括借以移動含有植物的容器或盆缽穿過成像室的輸送器系統(tǒng)。在傳送帶上用確保恒定速度的速度控制器移動植物。將植物在其生長周期期間以一個或多個時間間隔在輸送器系統(tǒng)上以連續(xù)方式移動穿過成像系統(tǒng)。在一個實施方案中，以受控方式轉(zhuǎn)動植物并對它們成像，其中用于成像的連續(xù)系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)動機構(gòu)和成像裝置。轉(zhuǎn)動機構(gòu)可以包含同步帶(見圖幻。同步帶和/或容器可以用高摩擦材料涂布。
摩擦力可以由摩擦系數(shù)表征。摩擦系數(shù)是希臘字母μ表示的無量綱量并且用來近似摩擦力(靜摩擦或動摩擦)μ =F/N。高摩擦材料對應(yīng)于約0.6或更高的摩擦系數(shù)。 下文描述合適的高摩擦材料的實例。高摩擦材料可以由但不限于例如聚氨酯或多種類型的橡膠如乙烯丙烯橡膠(EPDM)、丙烯腈-丁二烯橡膠(NBR)、氯丁二烯橡膠(CR)、丁二烯橡膠(BR)、苯乙烯-丁二烯橡膠(SBR)、丁基橡膠(IIR)、異戊二烯橡膠(IR)和天然橡膠組成。
當(dāng)植物抵達成像室時，容器或盆缽的側(cè)面被夾在(例如圖3中所繪制的)兩條同步帶之間，所述的同步帶優(yōu)選地用泡沫狀高摩擦材料涂布以確保牢固夾住。摩擦力足以允許充分夾住并轉(zhuǎn)動容器或盆缽。安置同步帶以夾住容器的側(cè)面。可以變動同步帶的位置以容納多種尺寸的容器。皮帶機構(gòu)和同步帶可以隨任何類型的盆缽或容器材料一起使用并且可以適應(yīng)于任何尺寸的盆缽或容器。同步帶的速度被精確地控制，優(yōu)選地由變頻器或頻率調(diào)節(jié)馬達控制。當(dāng)兩條同步帶具有不同的速度設(shè)置時，容器開始在該帶上被運送的同時以受控方式轉(zhuǎn)動?？梢匝刂D(zhuǎn)動軌道在該系統(tǒng)的一個面安裝幾個傳感器以檢測容器和/或觸發(fā)成像裝置。
在優(yōu)選的實施方案中，植物連續(xù)地移動穿過該系統(tǒng)，無需將植物從輸送器系統(tǒng)移到獨立的轉(zhuǎn)動平臺用于成像，隨后使植物再返回到該輸送器系統(tǒng)上，或無需停住植物用于成像。與常規(guī)的啟動和停止系統(tǒng)相比，這導(dǎo)致通過成像系統(tǒng)的流通量增加。
在另一個實施方案中，當(dāng)植物在傳動帶上移動穿過該成像系統(tǒng)時，可以轉(zhuǎn)動照相機。
在優(yōu)選的實施方案中，成像裝置是高速和/或高分辨率照相機。可以在系統(tǒng)中使用多于一臺照相機。照相機可以是在75毫秒內(nèi)拍攝高分辨率圖片的高速照相機。該照相機可以具有大于或等于4百萬像素的高分辨率模式。優(yōu)選地，該成像裝置是數(shù)字成像裝置， 但是也可以包括紅外、近紅外、X射線和熒光成像裝置，如用于葉綠素?zé)晒饣蛉~溫度紅外線。
多種成像裝置是本領(lǐng)域已知的并可從幾個供應(yīng)商獲得，例如，Qbit, Walz, Hansatech、Photon-Systems-Instruments、LEMNATEC、REGENT、VISSER、ARIS 禾口 FLIER。
成像室優(yōu)選地與自然日光隔離。成像室內(nèi)部的光由可由標(biāo)準化燈組提供，其控制光強度。在優(yōu)選的實施方案，因為容器正在以連續(xù)流方式移動穿過該系統(tǒng)，故使用高功率和高頻率照明來提供短曝光時間以維持成像的準確度。
成像系統(tǒng)中拍攝的圖像可以使用成像分析軟件在線處理以提取關(guān)于植物的信息 (例如圖像上植物的高度、綠色像素的數(shù)目、根生物量的評價)并且處理的數(shù)據(jù)以及圖像與應(yīng)答器標(biāo)簽唯一標(biāo)識符關(guān)聯(lián)并下載至計算機。
在該裝置的另一個實施方案中，由工作站處存在的容器的應(yīng)答器進行的標(biāo)識符信號發(fā)射驅(qū)動成像裝置以執(zhí)行操作?？梢砸匀绱朔绞桨惭b應(yīng)答器讀出器天線，使得它僅讀出穿過成像系統(tǒng)的容器的應(yīng)答器。應(yīng)答器的讀出器發(fā)射信號至軟件系統(tǒng)，其控制成像室中數(shù)字照相機并因此驅(qū)動該照相機拍攝一系列圖片。
在一個實施方案中，捕獲了多于一張圖像，優(yōu)選地拍攝了 2、3、4、5、6或更多張圖像。在另一個實施方案中，拍攝了 6張高分辨率彩色圖片，例如，24比特χ 4百萬像素。在另一個方面，為了高通量，在少于5秒內(nèi)，拍攝1-10、2-8、4-6或約6張圖像，進行一次背景品質(zhì)檢驗，取得必需的植物量值并且存儲圖像。在又一個實施方案中，使用對處理速度優(yōu)化的工業(yè)成像軟件，該軟件可以包括使用一臺或多臺計算機或處理器用于處理，其中所述處理可以包括，但不限于，在多于一臺計算機上并行化或并行處理，優(yōu)選地使用2、3、4或更多臺計算機或處理器。
上文所述的成像裝置可以與其他自動化裝置如例如根據(jù)衍生自數(shù)字圖像的參數(shù) (例如植物高度)分選植物的“分選裝置”組合。其他自動化裝置可以對應(yīng)答器標(biāo)記的植物執(zhí)行特定動作并且可以根據(jù)數(shù)據(jù)庫中與生長植物的容器的應(yīng)答器標(biāo)簽關(guān)聯(lián)的信息區(qū)分此類動作(例如修剪、收獲、包裝、摧毀等)。這種裝置能夠以無人值守和完全自動化的方式運行，雖然可以手工操作或部分自動化一個或多個部件，尤其中試規(guī)模設(shè)施的部件。該裝置可以為育種目的用于植物的表型分型中。因而，可以從具有不同遺傳組成的植物群體選出具有可以從數(shù)字圖像得出的特定形態(tài)學(xué)參數(shù)的植物。該裝置可以在無人工介入下使用，并且植物可以以高通量速率成像，因而不僅允許在短時間內(nèi)對大的植物群體成像，還允許對相同的植物群體反復(fù)成像，從而可以記錄參數(shù)隨時間的演化，這兩種情況均是植物育種中想要的。對來自該群體的每株單一植物收集從數(shù)字圖像得出的信息，并存儲該信息以允許下游數(shù)據(jù)分析。每個容器的唯一標(biāo)識符和衍生自每株植物的信息可以明確地與計算機裝置中的這種標(biāo)識符聯(lián)系。優(yōu)選地，該信息原樣(與植物鑒定標(biāo)簽關(guān)聯(lián)的特定植物的信息)存儲于數(shù)字數(shù)據(jù)庫中。
植物根評價
本發(fā)明的另一個方面涉及用于通過在基本上透明的容器中培育植物并通過成像系統(tǒng)(例如通過數(shù)字成像系統(tǒng))透過基本上透明的容器評價植物根的方法，其中所述的容器裝有有顆粒狀不透明培育介質(zhì)。本發(fā)明也提供用于評價植物根的裝置，該裝置特別適用于以高通量方式評價溫室中生長的植物的根。在此通過引用方式完整并入的美國申請公開號2006/0150490中描述的系統(tǒng)可以根據(jù)需要改進并在本發(fā)明系統(tǒng)中用于對根成像和評價。
基本上透明的容器可以是缽、盤等。優(yōu)選地，該容器是由透明材料(如合適的塑料材料)模制的典型的植物盆缽。優(yōu)選每個盆缽具有一株植物。透明材料優(yōu)選地含有(綠色)色素以吸收基本上全部波長的光，除了 500與600納米之間的那些光例外。這起到抑制根的避光應(yīng)答并起到避免盆缽內(nèi)壁上藻類生長的作用。在使用中，可以見到植物根抵住容器的壁。容器可以基本上完全由透明材料組成或可以僅具有透明的底部。
顆粒狀不透明培育介質(zhì)可以是任何土壤樣基質(zhì)(例如土壤、堆肥、泥炭、砂等或其組合)。限定基質(zhì)如盆栽土壤或巖棉的使用可以進一步減少由土壤異質(zhì)性引起的差異。另外，溫室植物在確定成分基質(zhì)中的生長允許給予植物的水和養(yǎng)分量得到控制。
在一個實施方案中，植物根通過數(shù)字成像評價，這促進大量樣本(級數(shù)直至例如幾萬)的處理。優(yōu)選使用至少一臺照相機以自動化方式評價植物?？梢詫⒅参?依次)呈遞至固定的照相機。將植物取回(例如，從溫室或其他地方的位置)并且將其中放置植物的基本上透明的容器依次呈遞至準備記錄根圖像的成像裝置。
成像之前，可以清潔透明容器，例如通過洗滌或刷洗，以從盆缽的側(cè)面和/或底表面除去塵、土壤或冷凝水，從而改善圖像質(zhì)量。容器可以使用如在此通過引用方式完整并入的美國申請公開號2007/(^89211中描述的一種水盆及成像裝置洗滌。在另一個實施方案中，可以施加水流至容器的多個部分。在又一個實施方案，可以使用一個或多個刷子或吹氣裝置從容器的一個或多個部分除去塵、土壤或殘渣。在另一個實施方案中，可以使用一個或多個刷子或吹氣裝置從成像裝置除去塵和殘渣。
在本發(fā)明的另一個方面，將植物從傳送帶移動到轉(zhuǎn)動平臺并在成像裝置前轉(zhuǎn)動植物。在本發(fā)明的另一個方面，植物留在傳送帶上并通過用如上所述的高摩擦材料涂布的兩條同步帶轉(zhuǎn)動。在另一個實施方案中，當(dāng)植物在傳動帶上移動時，可以轉(zhuǎn)動照相機。隨后將
20植物返回其最初位置或至另一個位置，均基本上無人類介入?？梢栽谶x擇植物或一系列植物用于評價的步驟中存在一些程度的人類介入，但是這也可以自動化或計算機化。在另一個實施方案中，每小時可以評價最少約500株植物。用于植物的輸送器系統(tǒng)優(yōu)選地是移動的皮帶。待評價的根性狀包括，但不限于生長速率、根長度和厚度、根分枝和根錨定。
種子加工
本發(fā)明的另一個方面包括改良的種子脫殼裝置，包含容納種子的容器或接受器和裝配在接受器內(nèi)部的塊體，其令人驚奇地使種子破損最小化并適用于多種類型種子(例如，如圖4中所述)。接受器的底部和塊體的表面由高摩擦材料(見上文描述)制成。
高摩擦材料對應(yīng)于約0. 6或更高的摩擦系數(shù)。合適的高摩擦材料實例是VULK0LAN 90 (Bayer AG)，其中90反映該材料的硬度(紹爾)。高摩擦材料的其他實例如下
-Iinatexy = 1. 1 紹爾=35
-supergrip bluey = 0. 8 紹爾=30
-PVC 藍 μ = 1. 0 紹爾=40
-Correx 膠 μ = 0. 9 紹爾=40
-Porrol μ = 0. 8 紹爾=10
-PU D15y = 0. 8 紹爾=70
-Linatriley = 1. 0 紹爾=55
-RP400y = 1. 0 紹爾=35
-PVC 白 μ = 1. 1 紹爾=40
制造接受器旨在以基本上單層容納所需量的種子。種子脫殼裝置也包括用于移動接受器或塊體的馬達和使得向下力擠壓接受器與塊體之間種子的壓力系統(tǒng)。接受器或塊體的運動可以包括，但不限于轉(zhuǎn)動、滾動或磨擦。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)動接受器或塊體，例如，如圖4中所繪制。該裝置可以制成不同的尺寸以容納適宜量的種子，從而僅需要執(zhí)行一次運行以使全部想要的種子脫殼。為運轉(zhuǎn)該裝置，將種子傾入接受器，啟動馬達并施加壓力以迫使塊體向下壓到種子上。預(yù)定義的壓力水平和壓力循環(huán)確保在短時幀例如2至20秒內(nèi)使種子脫殼，伴以有限破損或無破損。停止該裝置并且種子/外殼混合物可以轉(zhuǎn)移至清潔裝置以分離種子與外殼。接受器和塊體是開放系統(tǒng)，其可以被充分檢查以確保脫殼后沒有種子留下， 因而防止種子批次污染。接受器和塊體可以目視地或用成像裝置檢查。接受器和塊體的表面均是平坦的，因而使種子破損最小化。種子脫殼裝置適用于任何形式或形狀的種子?？梢栽谑归L橢圓形種子(如稻)破損最小的情況下使用該裝置?？梢钥刂坪妥儎臃N子上的壓力以優(yōu)化脫殼并且使得種子破損最小化。在本發(fā)明的一個方面，可以控制和變動塊體和接受器的轉(zhuǎn)動速度和該系統(tǒng)中所施加的力。
在本發(fā)明的又一個方面，種子可以自動地運送至或運離種子脫殼裝置。種子外殼和脫殼的種子可以從種子脫殼裝置運送至以自動和/或自動化方式分離種子與外殼的系統(tǒng)。分離種子外殼和脫殼種子的系統(tǒng)還可以包括種子的計數(shù)、成像和/或評價其物理和/ 或生物化學(xué)參數(shù)。種子的計數(shù)、成像和/或評價也可以以自動或自動化方式進行。該系統(tǒng)也可以包括對種子進行物理測試或選擇性動作以評估或分類該批脫殼種子的裝置。種子脫殼系統(tǒng)的用途的實例包括，但不限于在栽種之前改善種子的萌發(fā)和/或在收獲后種子分析之前除去種皮。[0166]在已經(jīng)針對特定表型或遺傳修飾選擇植物后或在評估前用于培育植物的制備物中，可以用種子脫殼裝置加工種子。種子可以由本領(lǐng)域已知的方法，如在此通過引用方式完整并入的美國專利號7，367，458中所述的方法進一步加工。脫殼后，也可以對種子分析幾個不同的性狀，包括但不限于脂肪酸、蛋白質(zhì)、糖類和維生素組成。
在又一個實施方案，可以使用自動進樣儀，其自動地將種子樣品插入分析裝置，如但不限于近紅外分析儀(NIR)。圖8中描述了自動進樣儀的實例。當(dāng)該裝置啟動時，它逐一測量小瓶，在分析之間每次向前移動該盤一個位置。待分析樣品的數(shù)目對應(yīng)于進樣盤中孔的數(shù)目。該盤可以制成或改造成具有不同數(shù)目的孔，因而容納不同數(shù)目的小瓶和/或樣品。 以這種方式使用自動進樣儀允許以自動化或自動方式分析該盤上所容納的樣品的總數(shù)，無需操作員存在。可以使用下述種子樣品，它們來自待用于栽種的種子、來自培育和收獲在溫室中培育的植物后所獲得的種子和/或通過該脫殼裝置加工后所獲得的脫殼種子。
為與肌R分析儀一起使用，將種子樣品(例如，25粒種子的樣品)插入具有平底的小玻璃瓶中，這是優(yōu)選的，因為OTR從底部向上測量。將小瓶插入自動進樣儀盤的孔中，例如，如圖8中所述。當(dāng)該裝置啟動時，它逐一測量小瓶，在分析之間每次向前移動該盤一個位置。待分析的樣品的數(shù)目對應(yīng)于進樣盤中孔的數(shù)目，例如圖8中描述了具有60份樣品的進樣盤。該盤可以制成或改造成具有不同數(shù)目的孔，因而容納不同數(shù)目的小瓶和/或樣品。 以這種方式使用自動進樣儀允許以自動化或自動方式分析該盤上所容納的樣品的總數(shù)，無需操作員存在。OTR可以通過插入樣品小瓶前產(chǎn)生的樣品清單或通過掃描置于小瓶上或與小瓶關(guān)聯(lián)的條形碼或其他機讀標(biāo)識來辨識種子小瓶。自動分析結(jié)果并且對每份樣品定量不同的生物化學(xué)化合物(如脂肪酸、蛋白質(zhì)、水等)。這些結(jié)果隨后可以上載到或輸入數(shù)據(jù)庫中并作為可能的標(biāo)準之一用于評價和/或選擇目的基因。
用于提取DNA的改良采樣系統(tǒng)
育種程序中經(jīng)常需要從植物組織提取DNA用于評價基因型。在DNA提取的準備工作中，一個實施方案提供了改善的采樣系統(tǒng)。該采樣系統(tǒng)由形成反應(yīng)小瓶的改良方法組成， 在所述的改良方法中可以以改良多孔形式進行為制備植物材料用于DNA提取所需要的步驟，其中所述的改良多孔形式通過使用雙重密封小瓶系統(tǒng)使樣品對樣品的污染(濺灑)的風(fēng)險最小化。另一個實施方案包括以多孔形式使用單個可追溯管以形成一批反應(yīng)小瓶，在所述反應(yīng)小瓶中可以進行DNA分離的制備步驟。
常規(guī)反應(yīng)小瓶，如圖9中所述的部件(a)，通常是可以用實心的蓋(h)(分別或成組)密封的容器。為能夠執(zhí)行分子生物學(xué)方案中的不同步驟，應(yīng)當(dāng)開啟反應(yīng)小瓶(即，必須取下該蓋)以添加和/或從反應(yīng)小瓶取出組分。當(dāng)反應(yīng)小瓶含有單一或唯一成分時，通過在不同時刻開啟/關(guān)閉小瓶或通過將小瓶彼此分隔得足夠遠而消除材料從一個小瓶擴散至鄰近小瓶的風(fēng)險。在小瓶以多孔形式排列下，使用獨立的瓶蓋時，不可能避免樣品污染。 本發(fā)明的改良方法包括雙重密封小瓶系統(tǒng)，其組合兩個蓋墊片(以多孔形式排列的蓋)(見圖9，新系統(tǒng)，b和c)以替代常規(guī)的單片實心蓋(見圖9，舊系統(tǒng)，h)。
小瓶雙蓋的使用是有利的，原因是它允許通過取出第二蓋墊片和由于第一蓋墊片的可刺穿縫隙特征而迅速抵達小瓶內(nèi)部而不打開小瓶本身?？纱檀┛p隙也允許無小瓶間污染的情況下和以陣列形式工作。兩個蓋子的組合產(chǎn)生了封蓋，該封蓋牢固得足以允許用小瓶進行“重負荷”工作，例如在-80°C用實心珠研磨植物材料或在較高溫度溫育而不因蒸發(fā)
22損失液體。
多孔系統(tǒng)的另一個部件包括排列在支架中的一排固定管(例如，96，384或1536 孔)或松散的單獨的管。單獨的管可以是不標(biāo)記的或是標(biāo)記的。在優(yōu)選的實施方案中，使用標(biāo)記的管作為可追溯的反應(yīng)小瓶。在對管標(biāo)記的情況下，樣品保持其身份，不需要給予新身份。通過在矩陣中排列標(biāo)記的管，不僅孔的位置標(biāo)識樣品，樣品還保持其唯一身份，與一個陣列或其他陣列中的位置獨立。因而，借助標(biāo)記的管，每次該管或樣品離開多孔支架 (例如，被取至合成/提取過程中的下一個工作站，如溫育站等)時，樣品不要求一個新標(biāo)識 (例如，在新工作站的支架中的位置)。
DNA提取系統(tǒng)
育種程序中經(jīng)常需要從植物組織提取DNA用于評價基因型。本發(fā)明的一個方面涉及從植物組織提取DNA方法，包括使用磁珠和雙磁體系統(tǒng)。該方法增加每份樣品所提取的 DNA的量并因而需要更少的植物組織作為原材料。該方法也允許提高的DNA濃度、降低的洗脫體積和提高的純度，這因磁珠與洗脫緩沖液的接觸改善所致。圖10中描述了與單磁體方法比較的本發(fā)明的改良雙磁體提取系統(tǒng)。
改良的提取系統(tǒng)也提供了使用更小的緩沖液體積，因為珠子總是被吸引至反應(yīng)小瓶底下的第二磁體。
這種系統(tǒng)也可以使用取決于磁珠的結(jié)合親和性而結(jié)合不同分子組分的磁珠(例如，DNA、RNA、蛋白質(zhì)等)。
本文中公開的全部參考文獻因而在此通過引用的方式完整并入。 實施例
現(xiàn)在將參考以下實施例描述本發(fā)明，所述實施例僅是說明作用并且不意圖完全定義或限制本發(fā)明的范圍。
實施例1環(huán)境相關(guān)表型的減少
在經(jīng)典育種中，在幾個地點并經(jīng)過幾個季節(jié)測試新品種是良好慣例，并且在作物品種評價程序中是必要的。其原因在于表型隨改變的環(huán)境而改變并且在不同環(huán)境下獲得品種的不同評級。分析澳大利亞西部小麥40年作物評價(Cullis等人，2000，Journal of Agricultural Science,第135卷，第213-222頁)和澳大利亞西部燕麥10年作物評價 (Frensham等人，1997，Euphytica，第99卷，第43-56頁)的公眾可獲得的數(shù)據(jù)，表明季節(jié)對季節(jié)(即天氣條件)是迄今這種環(huán)境差異性中最重要的因素。Cullis等人發(fā)現(xiàn)小麥產(chǎn)量數(shù)據(jù)中89%的環(huán)境差異性由季節(jié)差異性引起。Frensham等人估計該百分數(shù)對于燕麥產(chǎn)量在82%。預(yù)期該百分數(shù)對于全部作物具有相似的幅度。
因環(huán)境相互作用所致的基因型是極早期發(fā)現(xiàn)程序中的一項挑戰(zhàn)。早起發(fā)現(xiàn)程序不能在幾個季節(jié)內(nèi)試驗，從而依賴于某個特定季節(jié)，并且難以跨季節(jié)比較結(jié)果。因而，為減少環(huán)境差異性，使氣候穩(wěn)定化應(yīng)當(dāng)是首要目標(biāo)。
本發(fā)明提供在受控氣候條件的環(huán)境下于裝有具有一致特征的培育介質(zhì)的容器陣列中培育某物種的植物，所述環(huán)境具有受控的養(yǎng)分及補給水供應(yīng)，并且根據(jù)需要改變?nèi)萜髟谠摥h(huán)境內(nèi)部的位置以確保容器中的全部植物至少基本上均勻地暴露于環(huán)境中的條件。
實施例2通過用于成像的連續(xù)系統(tǒng)增加系統(tǒng)流通量[0185]在常規(guī)成像系統(tǒng)中，將植物正好在進入觀察單元之前停下并允許其逐一進入。植物可以額外地被停住，位于轉(zhuǎn)動平臺上用于成像，隨后從該平臺移走并再次定位并且從成像站運走，每次一個植物/容器。在本發(fā)明的系統(tǒng)中，植物不停下而以連續(xù)方式穿過成像系統(tǒng)。植物以植物之間的適宜距離放置以獲得最高速度，而不造成應(yīng)答器讀出期間的配錯和 /或碰撞。利用機械和光學(xué)傳感器來使植物運送和成像動作同步。一些標(biāo)準光學(xué)傳感器有時將懸垂葉感知為獨立的運動物體(即，帶有懸垂葉的植物被感知為兩株或多株植物)。優(yōu)選地使用能夠區(qū)分單片葉與整株植物的光學(xué)傳感器。
在常規(guī)系統(tǒng)中，將植物臨近應(yīng)答器讀出器安置并繞其轉(zhuǎn)動直至應(yīng)答器讀出。僅在此時拍攝圖片并且該過程繼續(xù)；因此，應(yīng)答器讀數(shù)被確保，但是緩慢。在本發(fā)明的系統(tǒng)中，植物在不停頓的情況下通過應(yīng)答器讀出器，從而成功讀出的時幀明顯減低。通過適當(dāng)調(diào)整例如應(yīng)答器的類型、讀出器的尺寸、數(shù)目及其相對于植物路徑的距離和位置或通過最小化因金屬物質(zhì)和電氣裝置(如皮帶馬達)所致的干擾來優(yōu)化讀出條件。此外，利用一些檢驗算法來避免配錯應(yīng)答器身份，如這可能在讀不出應(yīng)答器時或當(dāng)兩株植物在接近應(yīng)答器的讀出器時太接近以至于讀出器不能分別讀出應(yīng)答器時發(fā)生。
在該成像系統(tǒng)中，將植物被捕獲于多于一張高分辨率彩色圖片上如M比特χ 4 百萬像素，優(yōu)選地捕獲于6張圖片上，隨后執(zhí)行一次背景質(zhì)量檢驗，進行必須的植物測量并存儲圖片，這些均在約5秒或更短時間內(nèi)進行，與常規(guī)系統(tǒng)相比，時幀短，尤其在如此大的彩色圖片下。連續(xù)步驟優(yōu)選地對速度最大優(yōu)化，同時維持準確度。
優(yōu)選地，使用具有最高可能幀率的工業(yè)照相機。
對速度優(yōu)化的工業(yè)成像軟件包運行于一臺或多臺計算機或處理器上，其需要稱作 “并行化”的專門編程技術(shù)(進程在多于一臺處理器上并行運行)，優(yōu)選地運行于“四核”計算機G臺并行處理器)上。
穿過成像系統(tǒng)的連續(xù)流增加了被處理的植物的流通量和數(shù)量。維持成像準確度， 同時成像期間以連續(xù)方式移動并轉(zhuǎn)動植物，如圖5中所示。
圖5顯示在本發(fā)明連續(xù)系統(tǒng)與常規(guī)停止-啟動系統(tǒng)中所測量的葉面積之間的密切相關(guān)性。該數(shù)據(jù)集代表2500株植物的群體，所述的植物在相同日在本發(fā)明系統(tǒng)和常規(guī)系統(tǒng)中成像。常規(guī)量值與本發(fā)明量值之間的差異平均是3%，這與相同植物在一個或另一個系統(tǒng)中的重復(fù)測量之間觀察到的差異相似。
常規(guī)系統(tǒng)通常使用兩臺照相機，一臺用于幼齡植物(即照相機2，窄視野(FOV))和一臺用于大于25日的植物(即照相機1，廣F0V)。這歸因于常規(guī)系統(tǒng)中照相機的較低分辨率(1.2百萬像素)，所述的常規(guī)系統(tǒng)要求對幼齡植物使用較小視野以減少差異性。本發(fā)明的系統(tǒng)優(yōu)選地僅具有一臺照相機，但具有高得多的分辨率(例如，4百萬像素)，這允許以與常規(guī)系統(tǒng)中相同的準確度測量幼齡的小植物。
圖6顯示與常規(guī)停止-啟動系統(tǒng)(舊系統(tǒng))相比在實現(xiàn)連續(xù)系統(tǒng)(新系統(tǒng))后每日成像流通量的增加。
實施例3改良的種子脫殼裝置
開發(fā)了用于高效脫殼并使種子破損最小化的改良種子脫殼裝置。圖4中描述了該裝置的實例。
使用Nipponbare種子050S0. 000. 311. 754并評價其破損。測試了壓力的多種參數(shù)和所施加壓力的時間。將種子置于接受器中，用杠桿降下塊體至接受器內(nèi)以安放在接受器下方的天平上所測量的壓力置于種子上，并且隨后釋放杠桿。
表1顯示對所測試的不同壓力和時間參數(shù)(#種子+壓力)的實驗(方法)的結(jié)果。每種實驗進行兩次。結(jié)果描述平均值。
權(quán)利要求
1.用于分析遺傳修飾對植物的影響并選擇具有目的遺傳修飾的植物的方法，該方法包括a)提供生長在受控環(huán)境條件下的多株植物，每株植物與區(qū)分該植物與其他植物的機讀標(biāo)識關(guān)聯(lián)；b)將植物在它們的生長周期期間以一個或多個時間間隔在自動化輸送器系統(tǒng)中移動以便避免對特定微觀環(huán)境的延長暴露，從而減少微觀環(huán)境差異對植物表型的影響；c)將一株或多株植物在其生長周期期間以一個或多個時間間隔運送穿過用于植物成像的連續(xù)系統(tǒng)，其中該用于成像的系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)動機構(gòu)和成像裝置，其中轉(zhuǎn)動機構(gòu)以受控方式轉(zhuǎn)動植物或成像裝置；d)使植物移動穿過成像系統(tǒng)的同時，對植物的一個或多個特征成像；e)通過計算機處理分析植物的一個或多個特征的圖像并且將所得信息與植物的機讀標(biāo)識信息關(guān)聯(lián)；f)對一株或多株植物的一個或多個特征分析所得信息以確定遺傳修飾的影響；和g)選擇具有目的遺傳修飾的一株或多株植物或傳達來自分析步驟e)和/或f)的信息至其他人以選擇具有目的遺傳修飾的一株或多株植物。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中轉(zhuǎn)動機構(gòu)包括同步帶，其中同步帶和/或容器以高摩擦材料涂布。
3.權(quán)利要求
2的方法，其中同步帶如此定位以夾住容器的側(cè)面。
4.權(quán)利要求
2的方法，其中同步帶具有不同速度設(shè)置，允許容器以受控方式轉(zhuǎn)動同時在該帶上被運送。
5.權(quán)利要求
2的方法，其中含有植物的容器的位置由觸發(fā)成像系統(tǒng)動作的傳感器探測。
6.權(quán)利要求
1的方法，其中成像系統(tǒng)包括一臺或多臺高速和/或高分辨率照相機。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中所述照相機能夠在75毫秒內(nèi)拍攝高分辨率照片。
8.權(quán)利要求
1的方法，其中所述一個或多個特征包括植物的可觀察的物理表現(xiàn)、表型性狀、顏色、綠色、產(chǎn)量、生長、生物量、成熟度、轉(zhuǎn)基因性狀、開花、養(yǎng)分使用、水使用或疾病、 害蟲和/或脅迫影響中的一個或多個。
9.權(quán)利要求
1的方法，其中所述一個或多個特征包括面積、高度、寬度、葉角、葉數(shù)目、 花序的存在和/或數(shù)目、枝條數(shù)目和分支模式中的一個或多個。
10.權(quán)利要求
1的方法，其中所述一株或多株植物包含一株或多株轉(zhuǎn)基因植物。
11.權(quán)利要求
1的方法，其中選擇所述一株或多株植物進一步用于植物育種或進展實驗或者用于導(dǎo)入其他修飾。
12.權(quán)利要求
1的方法，其中所述圖像和/或信息取自地上植物部分的和/或植物根。
13.權(quán)利要求
12的方法，其中地上植物部分包括枝條、葉、分蘗、花序，花、種子或其任思組合。
14.權(quán)利要求
1的方法，還包括用種子脫殼裝置加工來自所選植物的種子或加工用于培育轉(zhuǎn)基因植物的制備物中的種子，所述種子脫殼裝置包括各自具有高摩擦力平坦表面的接受器-塊體組合，種子置于所述表面上，其中接受器或塊體在壓力下如此移動以釋放外殼并且最小化對種子的損傷。
15.權(quán)利要求
14的方法，其中自動地調(diào)節(jié)或控制接受器或塊體運動的速度和壓力。
16.權(quán)利要求
14的方法，其中所述接受器或塊體的移動包括轉(zhuǎn)動、滾動或磨擦。
17.權(quán)利要求
14的方法，其中種子所述包括長橢圓形種子。
18.權(quán)利要求
14的方法，其中將種子自動運送至種子脫殼裝置或從種子脫殼裝置中運出ο
19.權(quán)利要求
14的方法，其中將種子和外殼從脫殼裝置運送至系統(tǒng)從而以自動方式分離種子與外殼。
20.權(quán)利要求
19的方法，還包括種子的計數(shù)、成像和/或評價物理和/或生物化學(xué)參數(shù)。
21.權(quán)利要求
20的方法，其中種子的計數(shù)、成像和/或評價以自動方式進行。
22.權(quán)利要求
14的方法，其中種子和外殼從種子脫殼裝置移出后，目視或用成像裝置檢查接受器和塊體以確保沒有種子留下以防止成種子批次之間的交叉污染。
23.權(quán)利要求
1的方法，還包括利用包括雙重密封小瓶系統(tǒng)的改良樣品提取系統(tǒng)從種子、植物或植物部分、從所選植物或用于培育轉(zhuǎn)基因植物的制備物提取DNA，所述的雙重密封小瓶系統(tǒng)包含一個或多個包含可刺穿縫隙的第一蓋和鑲嵌在第一蓋內(nèi)部的一個或多個弟·~‘蓋ο
24.權(quán)利要求
1的方法，還包括在改良的珠介導(dǎo)的提取系統(tǒng)中利用雙磁體從種子、植物或植物部分、從所選植物或用于培育轉(zhuǎn)基因植物的制備物中提取DNA，所述的珠介導(dǎo)的提取系統(tǒng)包含能夠與分子化合物結(jié)合的磁珠、位于反應(yīng)小瓶蓋內(nèi)部的第一磁體和位于反應(yīng)小瓶下方的第二磁體。
25.用于高通量分析植物中遺傳性狀的植物育種系統(tǒng)，包括(a)受控條件的環(huán)境下裝有具有一致特征的培育介質(zhì)的容器陣列，所述環(huán)境具有受控的養(yǎng)分及補給水供應(yīng)，每個容器包含一株或多株植物并且每個植物或容器與機讀標(biāo)識關(guān)聯(lián)，所述機讀標(biāo)識區(qū)分該植物或容器與其他的植物或容器；(b)輸送器系統(tǒng)，其包括多個共延性存儲輸送器和一個轉(zhuǎn)移傳送機，其中存儲輸送器為一列幾個容器提供支撐，其中每個存儲輸送器包含由馬達移動的皮帶，并且其中存儲輸送器的皮帶可以由馬達向后或向前牽引，允許容器運送至存儲輸送器或從存儲輸送器中運走；其中轉(zhuǎn)移傳送機與存儲輸送器的末端部分相鄰并與存儲輸送器協(xié)作；(c)與輸送器系統(tǒng)結(jié)合的一臺或多臺馬達，其中存儲輸送器末端與轉(zhuǎn)移傳送機連通，從而允許容器從存儲輸送器至存儲輸送器運回和/或運走并且向陣列中的特定區(qū)域運回和/ 或運走；(d)用于植物的數(shù)字成像的連續(xù)系統(tǒng)，其包含用于在植物以受控方式被轉(zhuǎn)動和成像的同時，在植物的生長周期期間以一個或多個時間間隔移動一株或多株植物穿過該系統(tǒng)的輸送器系統(tǒng)、用于以受控方式轉(zhuǎn)動容器的帶機構(gòu)和一個或多個數(shù)字成像裝置；和(e)用于分析圖像和/或信息的計算機裝置，所述的圖像和/或信息從移動植物穿過數(shù)字成像系統(tǒng)的同時用一個或多個數(shù)字裝置所取得的一個或多個植物特征的數(shù)字圖像和/ 或信息獲得。
26.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，其中用于數(shù)字成像的系統(tǒng)的帶機構(gòu)包括以高摩擦材料涂布的同步帶和/或容器。
27.權(quán)利要求
沈的系統(tǒng)，其中同步帶由頻率調(diào)節(jié)的馬達驅(qū)動。
28.權(quán)利要求
沈的系統(tǒng)，其中同步帶這樣定位以夾住容器的側(cè)面。
29.權(quán)利要求
沈的系統(tǒng)，其中同步帶具有不同速度設(shè)置，允許容器以受控方式轉(zhuǎn)動同時在該帶上被運送。
30.權(quán)利要求
觀的系統(tǒng)，其中含有植物的容器的位置由觸發(fā)數(shù)字成像系統(tǒng)動作的傳感器探測。
31.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，其中所述數(shù)字成像系統(tǒng)包括一臺或多臺高速和/或高分辨率照相機。
32.權(quán)利要求
31的系統(tǒng)，其中所述照相機能夠在75毫秒內(nèi)拍攝高分辨率照片。
33.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，其中所述存儲輸送器彼此相鄰放置以支撐水平部署的陣列中的成行容器。
34.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，其中所述存儲輸送器由其馬達移動以移動該存儲輸送器上所支撐的成行容器至第一轉(zhuǎn)移站，在所述轉(zhuǎn)移站處該行最末端的容器被轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移傳送機， 運行該轉(zhuǎn)移傳送機以移動其上所支撐的容器至第二轉(zhuǎn)移站并且運行第二存儲輸送器的馬達以收集該容器。
35.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，其中所述一個或多個特征包含植物的可觀察物理表現(xiàn)、表型性狀、顏色、綠色、產(chǎn)量、生長、生物量、成熟度、轉(zhuǎn)基因性狀、開花、養(yǎng)分利用、水利用或疾病、 害蟲和/或脅迫影響中的一個或多個特征。
36.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，其中所述一株或多株植物包含一株或多株轉(zhuǎn)基因植物。
37.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，其中用一個或多個數(shù)字裝置取得地上植物部分的和/或植物根的圖像和/或信息。
38.權(quán)利要求
37的系統(tǒng)，其中所述地上植物部分是枝條、葉、分蘗、花序、花、種子或其任意組合。
39.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，其中所述機讀標(biāo)識包含用于接收查詢信號并通過發(fā)射唯一標(biāo)識符信號自動應(yīng)答的裝置，其中查詢信號和標(biāo)識符信號是無線電信號。
40.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，還包括用于加工來自容器中所培育植物的種子或加工用于容器中培育植物的制備物中種子的種子脫殼裝置，該種子脫殼裝置包括各自具有高摩擦力平坦表面的接受器-塊體組合，種子置于所述表面上，其中接受器或塊體在壓力下以如此方式移動以釋放外殼并且最小化對種子的損傷。
41.權(quán)利要求
40的系統(tǒng)，其中以自動化方式調(diào)節(jié)或控制接受器或塊體移動的速度和壓力。
42.權(quán)利要求
40的系統(tǒng)，其中接受器或塊體的移動包含轉(zhuǎn)動、滾動或磨擦。
43.權(quán)利要求
40的系統(tǒng)，其中所述種子包括長橢圓形種子。
44.權(quán)利要求
40的系統(tǒng)，其中將所述種子以自動化方式運送至種子脫殼裝置或從種子脫殼裝置中運出。
45.權(quán)利要求
40的系統(tǒng)，其中將種子和外殼從種子脫殼裝置運送至系統(tǒng)中以分離種子與外殼。
46.權(quán)利要求
45的系統(tǒng)，還包括種子的計數(shù)、成像和/或評價其物理和/或生物化學(xué)參數(shù)。
47.權(quán)利要求
46的系統(tǒng)，其中種子的計數(shù)、成像和/或評價以自動化方式進行。
48.權(quán)利要求
40的系統(tǒng)，其中種子和外殼從種子脫殼裝置移出后，目視或用成像裝置檢查接受器和塊體以確保沒有種子留下以防止種子批次之間的交叉污染。
49.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，還包括用于從種子、植物或植物部分、從容器中所培育的植物或用于容器中培育該植物的制備物中提取DNA的改良樣品提取系統(tǒng)，該樣品提取系統(tǒng)包含雙重密封小瓶系統(tǒng)，所述雙重密封小瓶系統(tǒng)包含一個或多個包含可刺穿縫隙的第一蓋和安裝在第一帽內(nèi)部的一個或多個第二蓋。
50.權(quán)利要求
25的系統(tǒng)，還包含用于從種子、植物或植物部分、從容器中所培育植物或用于容器中培育該植物的制備物中分離DNA的改良的珠介導(dǎo)的分離系統(tǒng)，所述的珠介導(dǎo)的分離系統(tǒng)包含能夠與分子化合物結(jié)合的磁珠、位于反應(yīng)小瓶蓋內(nèi)部的第一磁體和位于反應(yīng)小瓶下方的第二磁體。
51.用于開發(fā)改善植物育種的可出售信息的方法，該方法包括(a)提供生長在受控環(huán)境條件下的多株植物，每株植物與區(qū)分該植物與其他植物的機讀標(biāo)識關(guān)聯(lián)；(b)通過在植物的生長周期期間以一個或多個時間間隔在自動化輸送器系統(tǒng)中移動植物以避免對特定微觀環(huán)境的延長暴露，因而減少微觀環(huán)境差異對植物表型的影響；(c)將一株或多株植物在其生長周期期間以一個或多個時間間隔運送穿過成像系統(tǒng)， 該成像系統(tǒng)含有用于以受控方式轉(zhuǎn)動植物或成像裝置的轉(zhuǎn)動機構(gòu)；(d)使植物移動穿過成像系統(tǒng)的同時，拍攝植物的一個或多個特征的圖像并且存貯圖像于計算機或處理裝置上；(e)通過計算機處理分析植物的一個或多個特征的圖像并且將所得信息與植物的機讀標(biāo)識信息關(guān)聯(lián)；和(f)針對一株或多株植物的一個或多個特征分析所得的信息；(g)其中圖像和/或所得的信息提供了用于植物育種系統(tǒng)中做出植物鑒定和/或選擇決定的可出售信息。
52.用于收集關(guān)于所選擇植物表型的數(shù)據(jù)以快速分析遺傳修飾對所選擇表型的影響的方法，該方法包括(a)提供生長在受控環(huán)境條件下的多株植物，每株植物與機讀標(biāo)識關(guān)聯(lián)，所述機讀標(biāo)識區(qū)分該植物與其他植物；(b)通過在植物的生長周期期間以一個或多個時間間隔在自動化輸送器系統(tǒng)中移動植物以避免對特定微觀環(huán)境的延長暴露，從而減少微觀環(huán)境差異對植物表型的影響；(c)將一株或多株植物在其生長周期期間以一個或多個時間間隔運送穿過成像系統(tǒng)， 該成像系統(tǒng)含有用于以受控方式轉(zhuǎn)動植物或成像裝置的轉(zhuǎn)動機構(gòu)；(d)使植物移動穿過成像系統(tǒng)的同時，拍攝植物的一個或多個特征的圖像并且存貯圖像于計算機或處理裝置上；(e)通過計算機處理分析植物的一個或多個特征的圖像并且將所得信息與植物的機讀標(biāo)識信息關(guān)聯(lián)；和(f)針對一株或多株植物的一個或多個特征分析所得的信息；和(g)收集來自步驟f)和/或g)的關(guān)于所選擇植物表型的數(shù)據(jù)以快速分析遺傳修飾對所選擇表型的影響。
53.同步帶系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)動植物容器同時使植物以受控方式被移動并成像的用途。
專利摘要
本發(fā)明一般地涉及改善的植物育種系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及用于育種程序中自動化、高通量分析植物表型和植物基因型的方法。
文檔編號A01H1/04GKCN102159065SQ200980136161
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月16日
發(fā)明者C·范達爾, F·萊恩斯, P·勒熱納, W·范卡內(nèi)岡 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan