專利名稱:一種羊膜長期保存液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羊膜保存液，尤其是一種羊膜長期保存液及其制備方法。
背景技術(shù)：
羊膜(厚約0.02 0.05mm)來源于胚胎，是一種透明、無神經(jīng)、血管和淋巴管、低抗原性且具有韌性的組織，由上皮細胞層、基底膜、基質(zhì)層、纖維母細胞層、海綿層組成。羊膜在促進上皮修復(fù)、愈合及分化，抑制炎癥，抗新血管生成，抑制纖維化及瘢痕化，防止瞼球粘連等眼科多個領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。隨著羊膜用量的不斷增加，羊膜的保存，尤其是羊膜活性成分的保存，成了當前眼科界研究的一個熱點。
現(xiàn)在使用較為普遍的羊膜保存液為DMEM和甘油混合液(體積比為DMEM:甘油=I: I)，將羊膜片放入裝有DMEM和甘油混合液的容器中，密封置-70°C冰箱保存?zhèn)溆?，該保存液會使羊膜上皮細胞形態(tài)有所改變，代謝酶活性和生長因子的表達有所降低，但過快的降溫會造成細胞水腫，發(fā)生老化及功能減退，影響羊膜的品質(zhì)。
申請?zhí)枮?00710150436.9、公開號為CN101444202A的專利申請公開了“一種新鮮羊膜保存液及新鮮羊膜保存方法與應(yīng)用”，該新鮮羊膜保存液的組成及含量為=DMEM培養(yǎng)基9.0-12.0克，硫酸軟骨素10.0-25.0克，透明質(zhì)酸鈉0.5-1.0克，HEPES4.0-5.0克，右旋糖苷10.0-15.0克，慶大霉素1.0-3.0毫升，地塞米松24.0-30.0毫克，非必需氨基酸
10.0-15.0毫升，還原型谷胱甘肽0.50-0.95克，胎牛血清20.00-50.0毫升，注射用水加至1000毫升。該新鮮羊膜保存液具有在4°C冰箱中保存，將新鮮羊膜保存期延長20-30天的特點。但具有如下不足之處:該保存液中加入了血清成分，增加了病毒在羊膜與保存液之間傳播的機會；成分以多種粘稠劑為主，只加入了 0.9-1.2%的普通DMEM培養(yǎng)液作為保存液的成分，遠沒有達到保持羊膜細胞活性的需求；沒有加入細胞營養(yǎng)成分，細胞很快會凋亡甚至壞死，只是稍稍延長羊膜·保存時間；沒有加入血管擴容劑，容易使羊膜細胞和組織腫脹，從而使羊膜細胞凋亡和膠原破壞；加入的地塞米松雖有促進細胞分裂與分化作用，但損耗了部分羊膜細胞的能量，影響羊膜細胞的存活，此外還可能浸附于羊膜的襯里，影響羊膜發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種保存時間長、質(zhì)量高、無污染、成本低的羊膜長期保存液，以及該羊膜長期保存液的制備方法。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種羊膜長期保存液，其特征在于:以IOOOml保存液計，組分為硫酸軟骨素和低分子右旋糖酐IOg 200g,輕乙基淀粉IOg 50g,氨基酸5ml 20ml,妥布霉素5ml 20ml，HEPESlOml 50ml，抗壞血酸 5ml 30ml，丙酮酸鈉 5ml 20ml，培養(yǎng)液 860ml_970ml。優(yōu)選組分為硫酸軟骨素和低分子右旋糖酐20g 100g，羥乙基淀粉15g 35g，氨基酸IOml 15ml,妥布霉素IOml 15ml, HEPES25mI 35ml,抗壞血酸15ml 20ml,丙麗酸納IOml 15ml，培養(yǎng)液 900ml-930ml。
硫酸軟骨素是一種高分子物質(zhì)，其大分子基團帶有負電荷，可與羊膜上皮形成共價結(jié)合，從而在羊膜上皮表面形成一個保護層。實驗證明這一保護層對羊膜上皮具有保護作用，可以顯著地提高保存羊膜上皮和基質(zhì)的活性。右旋糖酐也是一種高分子化合物。溶液中的硫酸軟骨素與低分子右旋糖酐一起產(chǎn)生膠體滲透壓，使得保存羊膜保持脫水狀態(tài)，維持正常的羊膜厚度和韌性，有利于手術(shù)操作。
所述氨基酸為非必需氨基酸，非必需氨基酸為除8種必需氨基酸外的多種氨基酸，包括甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和組氨酸中的至少一種。
所述HEPES,英文名為 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl]ethanesulfonicacid,中文名為羥乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式為C8H18N204S。
所述培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液、KSFM培養(yǎng)液或者1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)液包含了細胞生長發(fā)育所需的大部分營養(yǎng)成分，可以滿足保存期間羊膜上皮和基質(zhì)細胞的營養(yǎng)需要。
所述羊膜長期保存液的制備方法，其特征在于:按體積百分比，將硫酸軟骨素、低分子右旋糖酐、氨基酸、妥布霉素、羥乙基淀粉、抗壞血酸、丙酮酸鈉加入培養(yǎng)液混合均勻，用HEPESlOml 50ml調(diào)pH值為7.2 7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)膜過濾除菌，即得羊膜長期保存液。
所述的滲透壓緩沖劑選自氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一種。
本方法制得的羊膜長期保存液4°C保存60天，-20°C保存I年可維持羊膜上皮和間充質(zhì)細胞形態(tài)和基底膜成分，易批量處理，集中存放，運輸方便，可隨時滿足臨床需要，并能維持部分細胞活性和生長因子的活性。
與現(xiàn)有的羊膜保存液相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:(I)利用本發(fā)明羊膜長期保存液進行病原菌培養(yǎng)、生物學(xué)性質(zhì)檢測及顯微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)較長時間保存(12月)的羊膜無污染，將其應(yīng)用于人結(jié)膜修補術(shù)中，術(shù)后發(fā)現(xiàn)羊膜植片能存活2周-2月，并能促進結(jié)膜上皮在其表面生長，遠期效果理想；(2)細胞穩(wěn)定劑具有減輕羊膜組織損傷、保持細胞活性的作用，顯著提高保存效果；(3)細胞營養(yǎng)成分有促進細胞增殖、保持羊膜細胞活性的作用，羊膜水腫較輕、皺褶較少、透明度較高，上皮和基質(zhì)活性成份極高，細胞表型和基底膜完整破壞少，與DMEM/甘油(I: I)保存的羊膜效果相當；(4)由于沒有加入血清，減少了病毒傳播，也避免羊膜細胞在保存期間分化；(5)本發(fā)明不僅有利于優(yōu)化羊膜保存條件，同時將為羊膜產(chǎn)業(yè)化保存提供重要的技術(shù)支持。
本發(fā)明羊膜長期保存液用于新鮮羊膜的長期保存，能被廣大患者接受并應(yīng)用于臨床。


圖1為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液4°C保存60天的羊膜HE染色照片(200X)；
圖2為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液_20°C保存12月的羊膜HE染色照片(200X)；
圖3為經(jīng)過DMEM和甘油混合液(I: 1)_80°C保存12月的羊膜HE染色照片(200X)；[0020]圖4為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液4°C保存60天的羊膜Laminin5染色照片(200X)；
圖5為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液-20°C保存12月的羊膜Laminin5染色照片(200X)；
圖6為經(jīng)過DMEM和甘油混合液(I: I) _80°C保存12月的羊膜Laminin5染色照片(200X)；
圖7為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液4°C保存60天的羊膜Collagen IV染色照片(200X)；
圖8為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液_20°C保存12月的羊膜Collagen IV染色照片(200X)；
圖9為經(jīng)過DMEM和甘油混合液(I: I) _80°C保存12月的羊膜Collagen IV染色照片(200 X)；
圖10為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液4°C保存60天的羊膜β -catenin染色照片(200X)；
圖11為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液_20°C保存12月的羊膜β -catenin染色照片(200X)；
圖12為經(jīng)過DMEM和甘油混合液(I: I) _80°C保存12月的羊膜β -catenin染色照片(200 X)；
圖13為經(jīng)過本發(fā) 明羊膜長期保存液4 °C保存60天的羊膜MUC16染色照片(200X)；
圖14為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液_20°C保存12月的羊膜MUC16染色照片(200X)；
圖15為經(jīng)過DMEM和甘油混合液(I: I) _80°C保存12月的羊膜MUC16染色照片(200X)；
圖16為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液_20°C保存12月的羊膜片兔角膜層間植入后I月的裂隙燈照片；
圖17為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液_20°C保存12月的羊膜片兔角膜層間植入后I月的HE照片；
圖18為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液-20°C保存12月的羊膜片兔前房內(nèi)植入后I月的裂隙燈照片；
圖19為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液-20°C保存12月的羊膜片兔前房內(nèi)植入后I月的HE照片；
圖20為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液_20°C保存12月的羊膜片兔羊膜-結(jié)膜修補術(shù)后2周的裂隙燈照片；
圖21為經(jīng)過本發(fā)明羊膜長期保存液_20°C保存12月的羊膜片兔羊膜-結(jié)膜修補術(shù)后2周的手術(shù)區(qū)結(jié)膜K19染色照片。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。[0039]具體實施方式
實施例1
本發(fā)明羊膜長期保存液，以IOOOml保存液計，包括羥乙基淀粉20g、硫酸軟骨素25g和低分子右旋糖酐10g，IOOmM非必需氨基酸10ml、IOOmM丙酮酸鈉10ml、500mM抗壞血酸 10ml、lMHEPES25ml、10%妥布霉素 10ml，DMEM/F12 培養(yǎng)液 935ml。pH 值為 7.2 7.4，滲透壓為 350 380m0sm/L。
制備方法1:將25g硫酸軟骨素、IOg低分子右旋糖酐、20g羥乙基淀粉加入到含IOOmM 非必需氨基酸 10ml、IOOmM 丙酮酸鈉 10ml、500mM 抗壞血酸 10ml、IM HEPES25mlU0%妥布霉素IOml及935ml DMEM/F12培養(yǎng)液中混合均勻，調(diào)pH值為7.2 7.4，滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌IOOml分裝后4°C保存即得本保存液。
制備方法2:將IOOmM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸鈉10ml、IM HEPES25ml、500mM抗壞血酸10ml、10%妥布霉素IOml及435ml DMEM/F12培養(yǎng)液中混合，然后將25g硫酸軟骨素、20g羥乙基淀粉和IOg低分子右旋糖酐加入混合液中，然后繼續(xù)加500mlDMEM/F12培養(yǎng)液混合均勻，調(diào)pH值為7.2 7.4，滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，IOOml分裝后4°C保存即得本保存液。
實施例2
本發(fā)明羊膜長期保存液，以IOOOml保存液計，包括羥乙基淀粉20g、硫酸軟骨素25g和低分子右旋糖酐10g，IOOmM非必需氨基酸10ml、IOOmM丙酮酸鈉10ml、500mM抗壞血酸 10ml、IM HEPES25ml、10%妥布霉素 10ml，KSFM 培養(yǎng)液為 935ml。pH 值為 7.2 7.4，滲透壓為 350 380m0sm/L。
制備方法1:將25g硫酸軟骨素、IOg低分子右旋糖酐、20g羥乙基淀粉加入到含IOOmM 非必需氨基酸 10ml、IOOmM 丙酮酸鈉 10ml、500mM 抗壞血酸 10ml、IM HEPES25mlU0%妥布霉素IOml及935mlKSFM培養(yǎng)液中混`合均勻，調(diào)pH值為7.2 7.4，滲透壓為350 380m0sm/L,經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌IOOml分裝后4°C保存即得本保存液。
制備方法2:將IOOmM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸鈉10ml、IM HEPES25ml、500mM抗壞血酸10ml、10%妥布霉素IOml及435ml DMEM/F12培養(yǎng)液中混合，然后將25g硫酸軟骨素、20g羥乙基淀粉和IOg低分子右旋糖酐加入混合液中，然后繼續(xù)加500mlKSFM培養(yǎng)液混合均勻，調(diào)PH值為7.2 7.4，滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，IOOml分裝后4°C保存即得本保存液。
實施例3
本發(fā)明羊膜長期保存液，以IOOOml保存液計，包括羥乙基淀粉20g、硫酸軟骨素25g和低分子右旋糖酐10g，IOOmM非必需氨基酸10ml、IOOmM丙酮酸鈉10ml、500mM抗壞血酸 10ml、IM HEPES25ml、10% 妥布霉素 10ml，1640 培養(yǎng)液 935ml。pH 值為 7.2 7.4，滲透壓為 350 380m0sm/L。
制備方法1:將25g硫酸軟骨素、IOg低分子右旋糖酐、20g羥乙基淀粉加入到含IOOmM 非必需氨基酸 10ml、IOOmM 丙酮酸鈉 10ml、500mM 抗壞血酸 10ml、IM HEPES25mlU0%妥布霉素IOml及935mll640培養(yǎng)液中混合均勻，調(diào)pH值為7.2 7.4，滲透壓為350 380m0sm/L,經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌IOOml分裝后4°C保存即得本保存液。
制備方法2:將IOOmM非必需氨基酸10ml、100mM丙酮酸鈉10ml、IM HEPES25ml、500mM抗壞血酸10ml、10%妥布霉素IOml及435ml DMEM/F12培養(yǎng)液中混合，然后將25g硫酸軟骨素、20g羥乙基淀粉和IOg低分子右旋糖酐加入混合液中，然后繼續(xù)加500mll640培養(yǎng)液混合均勻，調(diào)PH值為7.2 7.4，滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)0.2 μ m膜過濾除菌，IOOml分裝后4°C保存即得本保存液。
參見圖1 15，使用目前常用的DMEM/甘油(I: I)羊膜保存液，保存6月可維持羊膜部分活性；加上在美國等國家很多臨床應(yīng)用的產(chǎn)婦羊膜需要在保存6個月后再次進行檢測，這段保存期可容許工作人員對供體羊膜進行詳細的檢查，以排除惡性腫瘤、傳染性疾病，從而為臨床提供健康、優(yōu)質(zhì)的羊膜片。但這種羊膜長期保存液需要在_80°C保存，很多基層醫(yī)院沒有這種條件實施，不適合在我國推廣使用。本發(fā)明所述的羊膜長期保存液的配制方便，成本較低，4°C保存60d及-20°C保存12月后經(jīng)HE染色(圖1，2)及各種熒光染色(圖4，5，7，8，10，11，13，14)檢查證實其保存的效果(保存時間、活性成分及基底膜)與相應(yīng)天數(shù)的DMEM/甘油(I: I)羊膜保存液(圖3，6，9，12，15)相當。經(jīng)過本發(fā)明保存的羊膜，具有以下特點:羊膜上皮細胞完整(MUC16染色)，膠原排列整齊破壞少(Collagen IV染色)，細胞連接存在(β-catenin染色)，基底膜破壞少(Laminin5)等,使其在形態(tài)學(xué),活性成分保持，基底膜存留及生物學(xué)方面更接近于自然的新鮮羊膜。
圖16，17是經(jīng)過本發(fā)明所述羊膜長期保存液的羊膜片在臨床應(yīng)用上的一個具體實施例。經(jīng)過本發(fā)明-20°C保存12月的羊膜應(yīng)用于兔角膜層間植入后經(jīng)過I個月的觀察，羊膜片尚未完全溶解，植片透明，無明顯的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。
圖18，19是經(jīng)過本發(fā)明所述羊膜長期保存液的羊膜片在臨床應(yīng)用上的另一個具體實施例。經(jīng)過本發(fā)明_20°C保存12月的羊膜應(yīng)用于兔前房內(nèi)植入后經(jīng)過I個月的觀察，發(fā)現(xiàn)其羊膜部分溶解，體積變小，但基底膜尚完整，植片變白，但無明顯的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。
圖20，21是經(jīng)過本發(fā)明所述羊膜長期保存液的羊膜片在臨床應(yīng)用上的另一個具體實施例。經(jīng)過本發(fā)明_20°C保存12月的羊膜應(yīng)用于兔羊膜-結(jié)膜修補術(shù)后2周的觀察，發(fā)現(xiàn)其羊膜基底膜尚完整，羊膜上有兔結(jié)膜上皮長入，無明顯的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，說明其能作為結(jié)膜上皮的細胞基·底膜用于結(jié)膜重建。
權(quán)利要求
1.一種羊膜長期保存液，其特征在于:以IOOOml保存液計，組分為硫酸軟骨素和低分子右旋糖酐IOg 200g,輕乙基淀粉IOg 50g,氨基酸5ml 20ml,妥布霉素5ml 20ml,HEPESlOml 50ml，抗壞血酸5ml 30ml，丙酮酸鈉5ml 20ml，培養(yǎng)液860ml_970ml。
2.如權(quán)利要求
1所述的一種羊膜長期保存液，其特征在于:以IOOOml保存液計，組分為硫酸軟骨素和低分子右旋糖酐20g IOOg,輕乙基淀粉15g 35g,氨基酸IOml 15ml,妥布霉素IOml 15ml, HEPES25mI 35ml,抗壞血酸15ml 20ml,丙麗酸納IOml 15ml,培養(yǎng)液 900ml-930ml。
3.如權(quán)利要求
1、2所述的一種羊膜長期保存液，其特征在于:所述氨基酸為非必需氨基酸，非必需氨基酸為除8種必需氨基酸外的多種氨基酸，包括甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和組氨酸中的至少一種。
4.如權(quán)利要求
1、2所述的一種羊膜長期保存液的制備方法，其特征在于:按體積百分t匕，將硫酸軟骨素、低分子右旋糖酐、氨基酸、妥布霉素、羥乙基淀粉、抗壞血酸、丙酮酸鈉加入培養(yǎng)液混合均勻，用HEPES調(diào)pH值為7.2 7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350 380m0sm/L,經(jīng)膜過濾 除菌，即得羊膜長期保存液。
專利摘要
一種羊膜長期保存液，以1000ml保存液計，組分為硫酸軟骨素和低分子右旋糖酐10g～200g，羥乙基淀粉10g～50g，氨基酸5ml～20ml，妥布霉素5ml～20ml，HEPES10ml～50ml，抗壞血酸5ml～30ml，丙酮酸鈉5ml～20ml，培養(yǎng)液860ml-970ml。其制造方法為，將硫酸軟骨素、低分子右旋糖酐、氨基酸、妥布霉素、羥乙基淀粉、抗壞血酸、丙酮酸鈉加入培養(yǎng)液混合均勻，用HEPES調(diào)pH值為7.2～7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350～380mOsm/L，經(jīng)膜過濾除菌，即得羊膜長期保存液。
文檔編號A01N1/02GKCN102132697 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010113972
公開日2013年8月21日 申請日期2010年1月21日
發(fā)明者周海華 申請人:周海華導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),