專利名稱:一種黑楊花粉二倍體誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黑楊花粉誘導(dǎo)方法，尤其是一種黑楊花粉二倍體(2n)的誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
我國的楊樹栽培與育種實(shí)踐證明，黑楊(section Aigeiros)是我國楊樹人工林重要的造林樹種和育種親本資源，但是以利用種間雜交產(chǎn)生雜種優(yōu)勢為核心的傳統(tǒng)黑楊改良育種方法經(jīng)過了半個多世紀(jì)，單株材積超過對照親本的幅度小于50％(中國楊樹雜交育種研究進(jìn)展.世界林業(yè)研究，李善文等，2004)，已很難有更大的突破。要想進(jìn)一步利用引進(jìn)的黑楊資源，使其能在我國的工業(yè)用材林和環(huán)境保護(hù)林建設(shè)中發(fā)揮更大的作用就必須采用其它育種方法，將傳統(tǒng)育種方法與其它育種方法結(jié)合起來，才有可能產(chǎn)生突破性的進(jìn)展。
Zhang，S.(A report of triploid populus of the section Aigeiros.Silvae Genetica，2004)報(bào)道在我國當(dāng)前推廣的黑楊優(yōu)良無性系中染色體計(jì)數(shù)檢查出有三倍體，這些三倍體當(dāng)年生苗胸徑達(dá)5cm，樹高5m，生長很快。由于我國目前還沒有發(fā)現(xiàn)四倍體，他們推測這些三倍體是通過不減數(shù)的2n配子與正常的1n配子雜交而得到的。多倍體育種已在白楊派樹種的育種中獲得成功，我國選育的毛白楊雜種三倍體8年生時(shí)是當(dāng)?shù)仄胀ǘ扼w毛白楊材積的2-3倍，國外15年生的歐美山楊三倍體是美洲山楊二倍體材積的2倍(毛白楊異源三倍體B301等無性系選育的研究，林業(yè)科學(xué)，朱之悌等，1995)，可見培育多倍體是一條非常有效的途徑。利用不減數(shù)的2n花粉是培育植物多倍體的重要方法。因此，如何誘導(dǎo)出穩(wěn)定且高產(chǎn)的2n花粉是培育黑楊多倍體的關(guān)鍵技術(shù)之一。
有關(guān)黑楊2n花粉的研究報(bào)道很少，前蘇聯(lián)Mashkina(Method of obtaining diploidpollen of woody species.Lesovedenie，1989)曾用高溫誘導(dǎo)過白楊的2n花粉，文獻(xiàn)中提到2n花粉比率高達(dá)94.4％，具體步驟包括在恒溫箱內(nèi)濕度為30-40％的狀態(tài)下，用38-40℃高溫處理幾種楊樹及其雜種(P.balsamifera，P.alba，P.deltoids，P.alba×P.tremula)的雄花枝1.5-2h，之后在溫度18-20℃，空氣濕度為70-80％的條件下水培至花粉成熟。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的前期I，上述處理得到最高達(dá)94.4％的楊樹2n花粉。
但是，文獻(xiàn)中未指明對黑楊進(jìn)行高溫誘導(dǎo)的效果，也沒有說明每花序的產(chǎn)粉量情況。本發(fā)明人在利用此方法對黑楊2n花粉誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅一次處理在粗線期得到90.25％的2n花粉，而且這些花粉粘連在干癟的花藥內(nèi)無法散出，只能將不開裂的花藥人為壓碎才能在顯微鏡下進(jìn)行檢測，檢測中發(fā)現(xiàn)花藥內(nèi)有許多是不正常的連體花粉。由于花芽經(jīng)高溫誘導(dǎo)后不散粉或散粉量極少且所得2n花粉是不正常的連體花粉，所以難以滿足培育多倍體的需要。因此前蘇聯(lián)Mashkina的誘導(dǎo)方法不適用于黑楊2n花粉的誘導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對以上問題提供一種誘導(dǎo)黑楊2n花粉的方法，該方法可獲得高比率且花粉量大的2n花粉，通過用所得2n花粉雜交，得到黑楊多倍體植株。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明方法采取的技術(shù)方案包括以下步驟1)于冬春季采集黑楊長花枝于室溫內(nèi)水培；2)待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的細(xì)線期至終變期階段，向花芽內(nèi)多次注射秋水仙堿溶液；3)繼續(xù)水培花枝，直至花粉散出。
其中，注射的秋水仙堿溶液的濃度為0.2-0.8％，優(yōu)選0.4-0.8％；注射秋水仙堿溶液的次數(shù)為4至5次，相鄰兩次注射間隔時(shí)間2至3小時(shí)。
采集的黑楊花枝長度為75-100cm，在室溫下水培，溫度優(yōu)選15-25℃。特別是水培期間，每兩天將容器內(nèi)的水更換一次，保持花枝下部培養(yǎng)用水清潔。
黑楊種類選自山海關(guān)楊、鉆天楊、歐美楊和群眾楊中的一種。
特別是，黑楊花枝浸入水中的高度一般是30-40cm。
本發(fā)明黑楊2n花粉誘導(dǎo)方法的優(yōu)點(diǎn)是通過誘導(dǎo)，極大地提高了黑楊2n花粉的比率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明采用本發(fā)明方法誘導(dǎo)的黑楊，2n花粉比率達(dá)40％至95％，每花序的花粉產(chǎn)量是對照的0.32至2倍，誘導(dǎo)效果穩(wěn)定。而同期天然的黑楊2n花粉比率一般低于5％。
與前蘇聯(lián)Mashkina(1989)誘導(dǎo)方法相比，本發(fā)明不僅顯著地提高了黑楊2n花粉的比率，而且能夠收到正常散出的花粉，因此更適用于培育多倍體的雜交授粉。
具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明方法。
實(shí)施例一至六為誘導(dǎo)山海關(guān)楊花粉的實(shí)施例。
實(shí)施例一1.于1月20至2月20日采集山海關(guān)楊雄花枝，在溫度為20℃的溫室內(nèi)水培，水培期間，每兩天將容器內(nèi)的水更換一次，保持花枝下部培養(yǎng)用水清潔；2.待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的細(xì)線期，向花芽內(nèi)注射濃度為0.8％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)4次，相鄰兩次注射間隔時(shí)間3小時(shí)。
3.繼續(xù)水培花枝，直至花粉散出。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為87.4％，每花序散粉量是對照的0.41倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
采取以下步驟對2n花粉比率進(jìn)行檢測在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)2000粒花粉中花粉直徑大于40μm的花粉所占比率。直徑大于40μm花粉的DNA含量是直徑小于40μm花粉的2倍。所有花粉均采用這一標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
采用以下公式計(jì)算相對花粉量相對花粉產(chǎn)量＝各種誘導(dǎo)處理后的每序花粉產(chǎn)量/對照的每序花粉產(chǎn)量。
對照花粉是同時(shí)同批在溫室水培的花枝上采集的，與誘導(dǎo)處理花枝的唯一區(qū)別就是沒有進(jìn)行秋水仙堿溶液誘導(dǎo)。
每花序散粉量的檢測方法是每處理收集25個花序的花粉稱重，除以花序數(shù)。
實(shí)施例二除了待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的粗線期向花芽內(nèi)注射秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為59.15％，每花序散粉量是對照的0.62倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例三除了待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期，向花芽內(nèi)注射秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為50.20％，每花序散粉量是對照的0.38倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例四除了待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期，向花芽內(nèi)注射濃度為0.6％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)5次，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為40.53％，每花序散粉量是對照的0.37倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例五除了待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期，向花芽內(nèi)注射濃度為0.4％的秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為40.22％，每花序散粉量是對照的0.44倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例六除了待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期，向花芽內(nèi)注射濃度為0.4％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為43.15％，每花序散粉量是對照的0.36倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例七至十二為誘導(dǎo)鉆天楊花粉的實(shí)施例實(shí)施例七除了采集鉆天楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期，向花芽內(nèi)注射濃度為0.2％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為55.67％，每花序散粉量是對照的0.32倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例八除了采集鉆天楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為40.73％，每花序散粉量是對照的0.35倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例九除了采集鉆天楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為40.61％，每花序散粉量是對照的0.32倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十除了采集鉆天楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射濃度為0.6％的秋水仙堿溶液外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為40.23％，每花序散粉量是對照的0.53倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十一除了采集鉆天楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射濃度為0.6％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為40.47％，每花序散粉量是對照的0.48倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十二除了采集鉆天楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射濃度為0.4％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為42.44％，每花序散粉量是對照的0.41倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十三至十九為誘導(dǎo)歐美楊花粉的實(shí)施例實(shí)施例十三除了采集歐美楊花枝，向花芽內(nèi)注射濃度為0.5％的秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為4小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為62.02％，每花序散粉量是對照的1.00倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十四除了采集歐美楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的粗線期向花芽內(nèi)注射濃度為0.5％的秋水仙堿溶液外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為41.80％，每花序散粉量是對照的0.67倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十五除了采集歐美楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為57.94％，每花序散粉量是對照的0.62倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十六除了采集歐美楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射濃度為0.5％的秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為66.41％，每花序散粉量是對照的1.63倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十七除了采集歐美楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射濃度為0.4％的秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為48.61％，每花序散粉量是對照的1.02倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十八除了采集歐美楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射濃度為0.4％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為52.38％，每花序散粉量是對照的0.55倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例十九除了采集歐美楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽內(nèi)注射濃度為0.2％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為95％，每花序散粉量是對照的2倍，對照花粉中檢測到4.91％的2n花粉。
實(shí)施例二十至二十四為誘導(dǎo)群眾樣花粉的實(shí)施例實(shí)施例二十除了采集群眾楊花枝，向花芽內(nèi)注射濃度為0.6％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次，相鄰兩次注射的間隔時(shí)間為4小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為41.28％，每花序散粉量是對照的0.32倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例二十一除了采集群眾楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽向花芽內(nèi)注射秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為70.62％，每花序散粉量是對照的0.39倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例二十二除了采集群眾楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽向花芽內(nèi)注射濃度為0.6％的秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為62.10％，每花序散粉量是對照的0.86倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例二十三除了采集群眾楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽向花芽內(nèi)注射濃度為0.4％的秋水仙堿溶液，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2小時(shí)外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為42.36％，每花序散粉量是對照的0.58倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
實(shí)施例二十四除了采集群眾楊花枝，待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的終變期向花芽向花芽內(nèi)注射濃度為0.4％的秋水仙堿溶液，注射次數(shù)為5次外，其余均與實(shí)施例一相同。
誘導(dǎo)效果是2n花粉比率為43.95％，每花序散粉量是對照的0.32倍，對照花粉中沒有檢測到2n花粉。
盡管各實(shí)施例中的溫室溫度設(shè)為20℃，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解該溫度可取15-25℃范圍內(nèi)的任意值。
權(quán)利要求
1.一種黑楊花粉二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于包括以下步驟1)于冬春季采集黑楊長花枝于室溫內(nèi)水培；2)待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的細(xì)線期至終變期階段，向花芽內(nèi)多次注射秋水仙堿溶液；3)繼續(xù)水培花枝，直至花粉散出。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中使用的秋水仙堿溶液的濃度為0.2-0.8％。
3.如權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所述秋水仙堿溶液的濃度為0.4-0.8％。
4.如權(quán)利要求
1至3任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中注射秋水仙堿溶液的次數(shù)為4-5次。
5.如權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于所述次數(shù)為5次。
6.如權(quán)利要求
1至3任一所述的方法，其特征在于相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2-3小時(shí)。
7.如權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2-3小時(shí)。
8.如權(quán)利要求
1至3任一所述的方法，其特征在于所述黑楊種類選自山海關(guān)楊、鉆天楊、歐美楊和群眾楊中的一種。
9.如權(quán)利要求
1至3任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中使用的黑楊浸入水中的高度是30-40cm。
10.如權(quán)利要求
1至3任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中采集花枝的時(shí)間為1-2月，所述的室溫為20±5℃。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種黑楊花粉二倍體的誘導(dǎo)方法，包括以下步驟1)于冬春季采集黑楊長花枝于室溫內(nèi)水培；2)待花枝上的雄花芽發(fā)育至減數(shù)分裂的細(xì)線期至終變期階段，向花芽內(nèi)多次注射秋水仙堿溶液；3)繼續(xù)水培花枝，直至花粉散出，其中注射的秋水仙堿溶液的濃度為0.2－0.8％，注射次數(shù)為4－5次，相鄰兩次注射間隔時(shí)間為2－3小時(shí)。通過本發(fā)明的誘導(dǎo)方法，極大地提高了黑楊2n花粉的比率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明采用本發(fā)明方法誘導(dǎo)的黑楊，2n花粉比率達(dá)40％至95％，每花序的花粉產(chǎn)量是對照的0.32至2倍，誘導(dǎo)效果穩(wěn)定。
文檔編號A01G1/00GK1994066SQ200610169680
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月27日
發(fā)明者張金鳳, 續(xù)九如, 衛(wèi)尊征, 王麗華, 康向陽, 陳曉陽, 張志毅, 李云, 胡冬梅 申請人:北京林業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan