一種云斑尖塘鱧精子超低溫冷凍保存及復蘇方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于水產養(yǎng)殖學領域，涉及魚類種質保存技術，具體涉及一種云斑尖塘鱧精子超低溫冷凍保存及復蘇方法。
【背景技術】
[0002]目前，魚類種質保存主要以精液保存為主。精子的保存可分為常溫保存、低溫保存以及超低溫冷凍保存三種。精子的壽命隨其能量的消耗殆盡而結束。其能量消耗主要在兩個方面:一個是運動(擺尾游動)；第二是調節(jié)細胞內外滲透壓平衡(非主動運輸耗能)。因此，減緩精子的能量消耗，就可以將之壽命延長。常溫保存是根據精子的生理特性，配制一定濃度的稀釋液，從而減少精子用來調節(jié)滲透壓平衡時的能量消耗進而延長精子的壽命，通常能夠延長幾十分鐘至幾小時之久。低溫保存的原理是:低溫能降低精子代謝活動(低溫酶類效率降低)，通常能夠延長幾天至幾十天。超低溫保存則是讓精子在超低溫(-1960C )條件下，其運動和代謝幾乎完全停止，精子處于類假死狀態(tài)，生命以接近靜止狀態(tài)保存下來。精子在理想狀態(tài)下能夠無限期的保存，解凍后又會“復活”。
[0003]云斑尖塘體(Oxyeleotrismarmorata)是我國引種并養(yǎng)殖的名貴淡水魚品種，由于其體形似筍殼，故俗名為筍殼魚。該魚原產于東南亞泰國一帶，最大個體可達5?6公斤，其肉質細嫩、營養(yǎng)價值高、味道鮮美且刺少，是一種名貴食用魚，在東南亞各國和港澳、臺灣等地區(qū)及日本深受消費者歡迎，是這些東南亞國家大宗出口的主要淡水魚產品。由于產地國筍殼魚仍停留在依靠自然資源捕獲養(yǎng)殖的水平上，無法滿足市場強勁的消費需求，導致目前該商品魚市場批發(fā)價上漲到160?200元/kg。由此可見，云斑尖塘鱧的市場前景好，是一種新興的、高產值、高效益的水產養(yǎng)殖新品種。為了能進一步開展云斑尖塘鱧的新品種選育、人工繁殖以及種質保存，為市場提供更加優(yōu)質的云斑尖塘鱧新品種和苗種，需要進行云斑尖塘鱧精子超低溫保存和人工繁殖。然而，無論是精子的超低溫保存，還是進行人工繁殖，都需要一種稀釋液對云斑尖塘鱧鮮精進行稀釋，而且需要一種激活液對鮮精或凍精(經超低溫保存后的精子再解凍)進行激活。
[0004]云斑尖塘鱧精液中所含精子的密度很高，一般可以達到1.8X 19個/mL以上，當對云斑尖塘鱧精子進行超低溫保存時，含高密度精子的精原液是不能直接進行超低溫冷凍保存的，這是因為在冷凍過程中，當溫度降到O V?-20 V區(qū)間時，被保存的精液中會形成冰晶，冰晶像鋒利的刀一樣刺向四周的精子，將精子刺破，精液中的精子密度越高，精子被刺破的概率也越高，這種在冷凍過程中冰晶對精子的物理損傷將直接導致精子超低溫冷凍保存的失敗。因此，冷凍前必須要對精子進行稀釋。而在進行云斑尖塘鱧人工繁殖時，由于精液中含精子密度很高，若不稀釋就用，不僅對該魚精液是一種浪費，而且鮮精黏稠度大，使精子不易與卵子混合均勻，從而導致授精效果也不好。如果對精液進行稀釋后，再用來進行人工授精，可大大降低人工授精的成本，同時還能起到很好的授精效果，獲得較高的受精率。因此，云斑尖塘鱧精子稀釋液的作用就是在不激活精子的前提下，對精子進行稀釋，使精子盡可能的保持其原有的生物學特性。
[0005]當精子被超低溫保存時，為了提高精子的抗凍能力，除了對精液進行稀釋外，還需要在稀釋的精液中添加一定量的抗凍劑，如二甲亞砜(DMSO)等。由于抗凍劑具有很強的吸水性，當被添加到精液中后，可以使精子細胞內的一部分水被吸出。精子細胞的水分流失導致精子細胞內的細胞液濃度升高，精子的冰點也隨之升高，從而提升了精子的抗凍能力。也正是由于精子細胞內的細胞液濃度升高，精子的滲透壓也會隨之升高。這樣，凍精的滲透壓與鮮精相比會高出30?40 %。含如此高內部滲透壓的凍精，如果直接用淡水激活進行人工授精，在巨大的滲透壓差作用下，其凍精一遇見水就可能破裂，從而使人工授精失敗。解決這一問題的辦法就是用具有一定滲透壓的精子激活液來替代淡水對云斑尖塘鱧凍精進行激活，以減少這種滲透壓差。因此，云斑尖塘鱧精子激活液的作用就是減少這種滲透壓差，使得云斑尖塘鱧凍精在激活時不會破裂，順利實現(xiàn)用凍精進行該魚的人工授精。另外，精子激活液除了減少凍精與激活液間的滲透壓差，保護凍精在激活過程中不破裂的作用外，對一般云斑尖塘鱧鮮精也有使精子活力優(yōu)化的作用。這是因為激活液是由不同離子或大分子物質組成的，這些離子和大分子物質對精子的運動可以起到一定的優(yōu)化作用。
[0006]目前，由于環(huán)境惡化、近親繁殖等引起的物種滅絕、種質退化、品質下降以及病害頻發(fā)等現(xiàn)象日趨嚴重，超低溫冷凍保存技術作為基因長期保存的有效工具逐漸成為解決這些問題的首選。此外，超低溫保存技術還可以為遺傳育種研宄長期不斷的提供精子材料，這在雌雄核發(fā)育、性別控制及以精子作為載體生產轉基因生物等方面均有應用價值。
[0007]迄今對塘鱧科魚類精子保存及復蘇方法報道很少，未見對云斑尖塘鱧精子超低溫冷凍保存及復蘇方法的報道。由于云斑尖塘鱧屬于熱帶魚類，其原始祖先來自海洋，后來移居淡水生活，其精子保存及復蘇方法既不同于淡水魚類也不同于海水魚類，按照已公開的淡水魚類或海水魚類精子保存及復蘇方法對云斑尖塘鱧精子超低溫冷凍保存及復蘇均不成功；有待于進一步研宄。

【發(fā)明內容】

[0008]一種云斑尖塘鱧精子超低溫冷凍保存及復蘇方法的
【發(fā)明內容】
包括云斑尖塘鱧精子超低溫保存和復蘇方法兩大部分，其具體
【發(fā)明內容】
如下:
[0009]一種云斑尖塘鱧精子超低溫保存的方法，其步驟是:
[0010](I)云斑尖塘鱧精子的采集:選擇性腺發(fā)育成熟的云斑尖塘鱧雄魚，用干毛巾擦干生殖孔周圍及腹部的水。用手輕輕擠壓雄魚腹部，待能擠出精液后，用干燥的滴管吸取精液，開始3-5滴精液不要采集，然后將精液擠入干燥的容器中，混勻。
[0011](2)精子活力檢測:在10X20倍的顯微鏡下進行鏡檢，計算機輔助檢測鮮精平均活率達到90%以上，平均曲線運動速度(VCL)達到35微米/秒以上，平均直線運動速度達到20微米/秒以上，該精子便可用于超低溫冷凍保存。將鏡檢合格的精子放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0012](3)精子的稀釋:準確量取需要被冷凍的云斑尖塘鱧精液，加入精液約3倍體積(為了分裝方便，稀釋液的量可適當增減一點，增減的量一般不超過總量的10%)的精子稀釋液，使精液與稀釋液的稀釋比達到約1: 3。精液與稀釋液混勻，備用。
[0013]所述的精子稀釋液為云斑尖塘鱧特有的精子稀釋液，其配方為:7.0g/L氯化鈉(NaCl)，lg/L氯化鉀(KCl)，15g/L葡萄糖(C6H12O6)。該稀釋液鹽度7.3，pH為7.5。放置在4 °C冰箱保存，備用。
[0014](4)精液的凍前平衡:將稀釋后的精液放入4°C冰箱，進行凍前平衡。云斑尖塘鱧精液的凍前平衡時間為15?45分鐘。15分鐘為最少平衡時間，如果平衡時間不到15分鐘，則冷凍效果會下降。45分鐘為最長平衡時間，15分鐘到45分鐘以內，冷凍效果沒有差異，超過45分鐘，則冷凍效果隨著時間的延長逐漸降低。
[0015](5)加抗凍劑及分裝:在平衡好的云斑尖塘鱧精液中直接加入抗凍劑，使抗凍劑在精液中的終濃度達到10%。抗凍劑加入后，立即混勻，分裝至0.5mL麥管，6支麥管裝入I個麥管套中，I個冷凍架上可放2個麥管套。注意所有的管內不能留有氣泡，分裝過程必須在冰面完成，分裝完成的管子在沒有進入程序降溫儀前，應全部埋在冰里，確保管內的精液不會升溫。
[0016]所述的抗凍劑為二甲亞砜(DMSO)，無需配制，直接用原液。抗凍劑是利用其吸水作用，使精子中的部分水脫出，細胞質濃度升高，從而達到降低精子冰點的目的，防止精子在冷凍過程中精子內部形成冰晶。放置在4°C冰箱保存，備用。
[0017](6)程序降溫:降溫是在程序降溫儀中進行，程序降溫儀由計算機控制，當計算機被輸入自行設計的降溫程序后，程序降溫儀會按照設計好的程序開始降溫。將分裝好的精液以最快的速度放入程序降溫儀的冷凍室中。云斑尖塘鱧的降溫程序從0°c開始，以5°C /分鐘的速度降至-15°C，在-15°C停留5分鐘，然后再以25°C /分鐘速度從_15°C降至-85°C，最后在_85°C處平衡10分鐘。
[0018]所述的降溫程序為:從0°C開始，以5°C /分鐘的速度降至-15°C，在-15°C停留5分鐘，然后再以25°C /分鐘速度從-15°C降至_85°C，最后在_85°C處平衡10分鐘。
[0019](7)進入液氮:降溫完成后，直接將裝有精液的麥管或冷凍管連同冷凍支架一起從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在-196°C溫度中保存。
[0020]一種云斑尖塘鱧精子超低溫保存的復蘇方法，其步驟是:
[0021](I)從液氮罐中取出凍精:首先在液氮表面平衡15分鐘，然后用長鑷子從液氮罐中冷凍支架上取下I支麥管套的凍精(I支麥管套內裝6支麥管，每支麥管裝有0.5mL凍精，共3mL凍精)。在液氮罐口放置30?60秒后，從麥管套中取出麥管，準備解凍。
[0022](2)解凍:將麥管直接放入30°C水