一種離子束注入誘變選育蛹蟲草菌株的方法和所育菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食用菌培育領(lǐng)域，具體涉及一種離子束注入誘變選育蛹蟲草菌株的方 法和所育菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛹蟲草（Cordyceps militaris)，又名北冬蟲夏草，是我國(guó)傳統(tǒng)的重要食藥用菌之 一，也是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的新資源食品，現(xiàn)在稱為食品新原料，允許作為食品直接食用。蟲草素 是蛹蟲草生物活性成分中最重要的一種，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、治療白血病 等作用。蟲草素價(jià)格昂貴，化學(xué)合成目前在實(shí)驗(yàn)室能夠?qū)崿F(xiàn)，但是由于條件限制不能實(shí)現(xiàn)生 產(chǎn)，所以目前市場(chǎng)上銷售的蟲草素主要從蛹蟲草培養(yǎng)物中提取分離得到，因此選育高產(chǎn)蟲 草素蛹蟲草菌株能夠大大提高蟲草素產(chǎn)量，對(duì)降低蟲草素的價(jià)格以及擴(kuò)大臨床應(yīng)用具有重 要意義。
[0003] 離子束注入誘變技術(shù)應(yīng)用于生物誘變育種領(lǐng)域起源于20世紀(jì)80年代，起初主要 用于選育水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物，后逐漸應(yīng)用到微生物菌株選育中，專利文獻(xiàn)"低能N +注 入誘變選育靈芝菌株的方法及所選育的菌株"（專利號(hào)：ZL 201010550775.8)采用氮離子 束誘變選育靈芝，獲得產(chǎn)量提高15. 9%的菌株。專利文獻(xiàn)"銀耳菌株離子束注入誘變選育 方法及所育的一個(gè)銀耳菌株"（專利號(hào)：ZL201310228604. 7)采用氮離子束誘變選育銀耳菌 株，得到產(chǎn)量提高13. 5%的菌株。雖然離子束注入誘變是本領(lǐng)域的一種已知的技術(shù)，已經(jīng)有 文獻(xiàn)報(bào)道采用離子束注入誘變選育真菌菌株，但是不同種類的微生物對(duì)離子束注入誘變能 量及劑量的承受能力不同，即使同一菌種的不同菌株之間也仍然存在較大差異，因此對(duì)于 每一個(gè)菌株都有一個(gè)最佳誘變劑量范圍，在此條件下菌株突變率最高，經(jīng)過反復(fù)誘變才能 夠獲得更多的正突變菌株，這個(gè)最佳條件的獲得對(duì)菌株誘變選育意義重大，而且由于微生 物菌株的個(gè)體差異是不能照搬應(yīng)用的，必須經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化才能得到。
[0004] 因此有必要找到一種適合特定蛹蟲草出發(fā)菌株（蛹蟲草菌株CM-3)的氮離子束注 入誘變最佳條件，從而篩選得到一種高產(chǎn)蟲草素及菌絲體的蛹蟲草菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供蛹蟲草菌株選育的新途徑，從而獲得高產(chǎn)蟲草素及菌絲體的 蛹蟲草菌株資源。
[0006] 本發(fā)明提供了一種N+離子束注入誘變選育蛹蟲草菌株的方法及所育的一株生長(zhǎng) 速度快、菌絲體產(chǎn)量高且高產(chǎn)蟲草素的蛹蟲草菌株。
[0007] 本發(fā)明首先提供一種離子束注入誘變選育蛹蟲草菌株的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)蛹蟲草菌株離子束注入誘變前樣品的處理方法優(yōu)化：
[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人以北京市輻射中心微生物實(shí)驗(yàn)室保存的蛹蟲草菌株CM-3為出發(fā) 菌株，進(jìn)行氮離子束注入誘變。由于離子束注入誘變是在真空狀態(tài)下完成的，因此要保證注 入前蛹蟲草孢子存活率最高才能保證注入誘變效果最佳。首先要研宄合適的孢子培養(yǎng)時(shí) 間，保證孢子活力最強(qiáng)；其次研宄合適的溶劑保護(hù)孢子在干燥時(shí)受到最少的損傷，保證孢子 的存活率最高；然后研宄孢子懸液稀釋濃度對(duì)涂布單層菌膜的影響，保證涂布到金屬培養(yǎng) 皿上的孢子是單層的，能夠均勻的接受帶電離子的注入；最后研宄干燥時(shí)間對(duì)涂布的孢子 存活率的影響。通過對(duì)上述條件的優(yōu)化找到樣品制備的最優(yōu)條件，保證離子束注入誘變前 樣品的存活率最尚。
[0010] 在本發(fā)明中，所述蛹蟲草菌株離子束注入誘變前樣品的處理方法為：蛹蟲草孢子 由液體培養(yǎng)獲得，將固體菌種在25°c恒溫條件下以150r/min的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)7d獲得液體 培養(yǎng)物，用200目細(xì)胞篩過濾所述液體培養(yǎng)物得到孢子懸液，以液體培養(yǎng)基為稀釋劑稀釋 100倍獲得濃度為3. 6 X IO5個(gè)/mL的孢子懸液，吸取0.1 mL所述稀釋后的孢子懸液涂布到 金屬培養(yǎng)皿上，無(wú)菌風(fēng)吹干后在2-8h內(nèi)做離子束注入誘變；本發(fā)明的發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)經(jīng)過此條件下能保證蛹蟲草孢子的存活率最高。
[0011] 2)在真空度為KT3Pa條件下，采用連續(xù)注入方式對(duì)金屬培養(yǎng)皿上的蛹蟲草孢子進(jìn) 行N+離子束注入誘變，能量為30kev，劑量為3 X 10 14ions/cm2-6 X 1014ions/cm2,獲得誘變后 的蛹蟲草孢子。
[0012] 3)培養(yǎng)誘變后的蛹蟲草孢子，通過平板初篩篩選得到菌絲生長(zhǎng)速度快、菌絲密度 大、色素顏色深、菌落較規(guī)則等特征的蛹蟲草菌株；
[0013] 4)將步驟3)篩選到的蛹蟲草菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，然后采用高效液相色譜法 測(cè)定發(fā)酵液中蟲草素含量，篩選得到正突變菌株；
[0014] 5)將篩選得到的正突變菌株采用優(yōu)化后的培養(yǎng)工藝液體培養(yǎng)，然后恒溫靜置培 養(yǎng)，得到蟲草素產(chǎn)量高的蛹蟲草發(fā)酵液。
[0015] 本發(fā)明還提供了采用本發(fā)明的離子束注入誘變選育蛹蟲草菌株的方法選育的一 株蛹蟲草菌株（Cordyc印s militaris)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 9818,于2014年10月22日 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵政編碼：100101。
[0016] 蛹蟲草菌株CGMCC No. 9818的菌學(xué)特性：
[0017] 本發(fā)明所提供的蛹蟲草菌株具有優(yōu)異的蟲草素生產(chǎn)性能，其蟲草素產(chǎn)量比出發(fā)菌 株提高8. 85倍。菌株固體培養(yǎng)形態(tài)：固體PDA平板上菌落生長(zhǎng)旺盛，菌絲濃密，菌落背面顏 色明顯比出發(fā)菌株變深，菌絲密度明顯大于出發(fā)菌株，菌落背面顏色為橘紅色，顏色比出發(fā) 菌株深。菌株液體培養(yǎng)形態(tài)：液體培養(yǎng)基中布滿直徑大小約為2-3mm的白色菌絲球，液體透 明澄清。顯微鏡觀察形態(tài)：突變菌株無(wú)性階段分生孢子為球形，大小為2-4 ym，萌發(fā)后為橢 圓形及棒狀，菌絲有少量分枝。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述蛹蟲草菌株CGMCC No. 9818在液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素及菌絲體 中的應(yīng)用。
[0019] 其中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分包括：蔗糖10_30g/L，蛋白胨10-30g/L，磷酸 二氫鉀0.5-2. Og/L，硫酸鎂0.5-1. Og/L，pH自然；配制時(shí)將各原料加熱溶解，121°C，滅菌 30min ；
[0020] 液體發(fā)酵的培養(yǎng)條件包括：首先在25-28°C的恒溫條件下，以150-180r/min的轉(zhuǎn) 速搖床培養(yǎng)5-7d，然后于25°C光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20-30d獲得含蟲草素的培養(yǎng)液，吸取 培養(yǎng)液用〇. 22 y m無(wú)菌濾膜過濾后HPLC方法測(cè)定蟲草素含量。
[0021] 本發(fā)明還提供了所述蛹蟲草菌株CGMCC No. 9818在固體培養(yǎng)生產(chǎn)蟲草素中的應(yīng) 用。本發(fā)明所提供的方法還包括通過固體培養(yǎng)蛹蟲草菌株CGMCC No. 9818生產(chǎn)核苷類物質(zhì)， 所述核苷類物質(zhì)包括腺苷、尿苷、鳥苷。
[0022] 其中，固體培養(yǎng)基配方為：所述固體培養(yǎng)中所使用的固體培養(yǎng)基由培養(yǎng)基質(zhì)和營(yíng) 養(yǎng)液組成。
[0023] 其中，培養(yǎng)基質(zhì)選自燕麥、大米、大麥、小麥、小米和高粱中的至少一種，優(yōu)選為燕 麥。
[0024] 營(yíng)養(yǎng)液的組成成分包括：葡萄糖5-30g/L，蛋白胨l-30g/L，酵母粉l-10g/L，磷酸 二氫鉀 0. 5-2g/L，硫酸鎂 0. 5-1. Og/L。
[0025] 其中，相對(duì)于100g的培養(yǎng)基質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)液的用量為120mL-140mL。
[0026] 所述營(yíng)養(yǎng)液的配制方法包括將各組分按比例混合并加熱溶解于蒸餾水中，在 121°C，滅菌30min，pH值自然。
[0027]固體培養(yǎng)條件為：滅菌的固體培養(yǎng)基冷卻后，接入液體種子液，均勻的灑在固體培 養(yǎng)基表面。20-25°C恒溫避光培養(yǎng)，3-7d菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，在超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌鑷子將培 養(yǎng)基上層的菌絲及米粒打散成小顆粒，平鋪在培養(yǎng)瓶中。放入18_25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 設(shè)定白天為8h，溫度為22-23°C，光照強(qiáng)度為12001u X，黑夜為16h，溫度為18-20°C，關(guān)閉光 照，1-2天后菌絲變?yōu)殚偕缓笤絹?lái)越深，最后菌絲全部長(zhǎng)滿，再繼續(xù)培養(yǎng)20-30d。將固體 培養(yǎng)物取出50 °C烘干后粉碎。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所提供的離子束注入誘變選育蛹蟲草菌株的方法， 得到了針對(duì)蛹蟲草菌株的N +離子束注入誘變的最佳劑量范圍，以本發(fā)明所提供的方法誘 變選育蛹蟲草菌株，可以使得誘變后的蛹蟲草孢子保持較高的突變率，突變率可以達(dá)到 15. 1%-21. 3%，能夠篩選得到更多高產(chǎn)蟲草素的蛹蟲草突變菌株，更大的開發(fā)了蛹蟲草菌 株資源。
[0029]蛹蟲草菌株（Cordyceps militaris)，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 9818,于 2014年 10 月 22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵政編碼：100101。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為不同注入劑量對(duì)蛹蟲草菌株存活率的影響
[0031] 其中：橫坐標(biāo)數(shù)字1-14分別代表不同的離子束注入劑量，1-14的注入劑量分別 為：I X 1012i〇ns/cm2、5 X 1012i〇ns/cm2、I X 1013i〇ns/cm2、5 X 1013i〇ns/cm2、I X 1014i〇ns/cm2、 2X 1014i〇ns/cm2、3 X 1014i〇ns/cm2、4 X 1014i〇ns/cm2、5 X 1014i〇ns/cm2、6 X 1014i〇ns/cm2、 7 X 1014i〇ns/cm2、8 X 1014i〇ns/cm2、9 X 1014i〇ns/cm2、I X 1015i〇ns/cm2〇
[0032] 圖2為離子束注入誘變蛹蟲草菌株突變率
[0033] 其中：橫坐標(biāo)數(shù)字1-14分別代表不同的離子束注入劑量，1-14的注入劑量分