使用線性dna載體的質(zhì)體轉(zhuǎn)化的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 依據(jù)35U.S.C. § 119(e)，本申請要求2012年10月24日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?61/718,095的利益，其內(nèi)容通過引用完全結(jié)合在本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本申請包含序列表，該序列表通過EFS-Web以ASCII格式提交，并且通過引用完 全結(jié)合在本文中。所述ASCII副本在2013年3月12日產(chǎn)生，命名為034186-077150-PCT_ SL. txt，并且大小為20, 932字節(jié)。
[0005] 政府利益聲明
[0006] 本發(fā)明是在美國農(nóng)業(yè)部授予的合同號(hào)為2008-39211-19557的政府支持下進(jìn)行 的。政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0007] 本公開內(nèi)容涉及質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，使用該方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物 (transplastomic plant)和植物部分，以及所述轉(zhuǎn)質(zhì)體植物和植物部分的后代。
[0008] 相關(guān)領(lǐng)域描述
[0009] 與核轉(zhuǎn)化相比，質(zhì)體轉(zhuǎn)化具有多種優(yōu)點(diǎn)。其允許高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，在單次轉(zhuǎn)化 事件中的多基因改造，和通過母體遺傳的轉(zhuǎn)基因遏制（transgene containment)。另外，由 于有毒轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞區(qū)室化（subcellular compartmentalization)，質(zhì)體轉(zhuǎn)化缺少 多效效應(yīng)。此外，這種技術(shù)避免與核轉(zhuǎn)基因表達(dá)相關(guān)的其他問題，諸如由于轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn) 導(dǎo)致的基因沉默和位置影響。盡管存在它的優(yōu)點(diǎn)，質(zhì)體轉(zhuǎn)化局限于特定的雙子葉植物。已 經(jīng)證明單子葉植物，如玉蜀黍（maize)，小麥，和水稻，不受該技術(shù)影響。
[0010] 概述
[0011] 本文所述的方法和組合物涉及在任意植物中提供高效的質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體和轉(zhuǎn)化 流程。在一些實(shí)施方案中，所述植物可以是曾經(jīng)不受質(zhì)體轉(zhuǎn)化影響的單子葉植物。
[0012] 在一方面中，本公開內(nèi)容提供質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，所述方法包括：向植物組織的質(zhì)體 中引入線性DNA載體，其中（i)所述質(zhì)體包含基本上不降解的質(zhì)體DNA，（ii)所述線性DNA 載體包含：（1)質(zhì)體DNA靶向序列，和（2)目的轉(zhuǎn)基因。
[0013] 在某些實(shí)施方案中，所述植物是谷物農(nóng)作物。
[0014] 所述目的轉(zhuǎn)基因可以選自由下述組成的組：編碼治療性或預(yù)防性多肽的基因，提 供或增強(qiáng)除草劑抗性、昆蟲抗性、真菌抗性、細(xì)菌抗性和脅迫耐受性的基因，以及提高氮固 定、礦物質(zhì)營養(yǎng)、植物產(chǎn)量、淀粉累積、脂肪酸累積、蛋白累積和光合作用的基因。
[0015] 在某些實(shí)施方案中，所述線性DNA載體還包括編碼選擇標(biāo)記的基因，諸如提供針 對壯觀霉素、鏈霉素、卡那霉素、潮霉素、氯霉素、草甘膦或雙丙氨膦（bialaphos)抗性的基 因，提供甘露糖代謝機(jī)制的基因或編碼熒光蛋白的基因。
[0016] 在某些實(shí)施方案中，所述質(zhì)體DNA靶向序列包含質(zhì)體染色體DNA分子的末端序列。 例如，所述質(zhì)體末端序列與SEQ ID NO :1，8,15, 21，29, 35,41或47的一部分至少90%相同， 所述部分至少30個(gè)核苷酸長。
[0017] 在某些實(shí)施方案中，所述質(zhì)體末端序列包含：當(dāng)所述植物組織是玉蜀黍組織時(shí)，包 含 SEQ ID NO :2,9,16, 22, 27, 28, 30, 36,42,48, 53, 54, 55, 56 或 57 的至少 30 個(gè)連續(xù)的核 苷酸，當(dāng)所述植物組織是小麥組織時(shí)，包含SEQ ID NO :3,10,17, 23, 31，37,43或49的至少 30個(gè)連續(xù)的核苷酸，當(dāng)所述植物組織是水稻組織時(shí)，包含SEQ ID NO :4, 5,11，12,18,19, 24， 25, 32, 33, 38, 39,44,45, 50或51的至少30個(gè)連續(xù)的核苷酸，當(dāng)所述植物組織是煙草組織 時(shí)，包含SEQ ID NO :6,13, 20, 26, 34,40或52的至少30個(gè)連續(xù)的核苷酸，或當(dāng)所述植物組 織是苔類植物組織時(shí)，包含SEQ ID NO :7或46的至少30個(gè)連續(xù)的核苷酸。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，所述線性DNA載體包含在Y端或:V端的單鏈突出端，可以 或可以不共價(jià)連接所述線性DNA載體的兩條DNA鏈的單鏈環(huán)，或不是與5'端或3'端共價(jià) 連接的核苷酸的分子。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述植物組織是非綠色組織，諸如成熟胚的一部分，暗處生長 的幼苗的一部分，種子或種子的一部分。
[0020] 在某些實(shí)施方案中，所述質(zhì)體是前質(zhì)體、黃化質(zhì)體或其他非綠色質(zhì)體。
[0021] 在某些實(shí)施方案中，通過用由所述線性DNA載體包被的微粒生物彈道轟擊植物組 織進(jìn)行步驟（a)。
[0022] 在某些實(shí)施方案中，質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法還包括（b)避光培養(yǎng)來自步驟（a)的植物組 織。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法還包括（c)由步驟（a)或步驟（b)的植物組 織再生轉(zhuǎn)質(zhì)體植物。
[0024] 在某些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)質(zhì)體植物是同質(zhì)的。
[0025] 在另一方面中，本公開內(nèi)容提供由本文公開的方法得到的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物或植物部 分。
[0026] 在相關(guān)的方面中，本公開內(nèi)容提供由本文公開的方法得到的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的植物或 或植物部分的后代。
[0027] 在另一方面中，本文公開內(nèi)容提供用于植物中質(zhì)體轉(zhuǎn)化的線性DNA載體，所述載 體包含：（1)質(zhì)體DNA革E向序列，其包含質(zhì)體末端序列（plastid terminal sequence)，（2) 表達(dá)盒，其包含：(a)任選地，在要轉(zhuǎn)化的植物的質(zhì)體中有活性的啟動(dòng)子，（b)用于接納目的 轉(zhuǎn)基因的DNA插入位點(diǎn)，（c)任選地，一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，（d)任選地，編碼在要轉(zhuǎn)化的植 物的質(zhì)體中有活性的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的DNA序列。
[0028] 在某些實(shí)施方案中，所述線性DNA載體還包括在DNA插入位點(diǎn)插入的目的轉(zhuǎn)基因。
[0029] 附圖簡述
[0030] 圖1A-1F圖示苔類植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體和轉(zhuǎn)基因整合。圖IA圖示載體pCS31的示意 圖。圖IB圖示通過SacI消化線性化的載體LpCS31的示意圖。圖IC圖示通過Notl/SacII 消化線性化的載體TCpCS31的示意圖。aadA/RBS片段產(chǎn)生陽性轉(zhuǎn)化體。圖ID圖示通過同 源重組整合到質(zhì)體基因組中的示意圖。圖IE圖示通過末端連接整合的示意圖。圖IF圖示 通過鏈侵入（strand invasion)整合的示意圖。LBS :左邊界序列，RBS :右邊界序列，aadA: 具有PEP啟動(dòng)子、5' -UTR和:V -UTR的轉(zhuǎn)基因，P1，P4-P6:側(cè)翼連接邊界序列的PCR引 物，P2, P3 :在轉(zhuǎn)基因盒內(nèi)的PCR引物，aL，aR :用于aadA轉(zhuǎn)基因的PCR引物。
[0031] 圖2A-2C圖示用于煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體。圖2A圖示環(huán)形載體pPRVlllA的示意圖， 所述載體包含煙草PtDNA LBS和RBS，側(cè)翼連接煙草psbA啟動(dòng)子/psbA 5' -UTR和psbA 3' -UTR的用于壯觀霉素選擇的aadA基因。具有限制性位點(diǎn)的多接頭位于LBS與啟動(dòng)子 區(qū)之間。轉(zhuǎn)基因盒是登記號(hào)U12812。箭頭表示16SrRNA和trnV基因的位置。圖2B圖示 通過EcoRV消化pPRVlllA產(chǎn)生的線性載體LpPRVlllA的示意圖。圖2C圖示通過SacI消 化pPRVlllA產(chǎn)生的線性載體TCpPRVlllA的示意圖。
[0032] 圖3A-3G圖示用于玉蜀黍質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體。圖3A和3C圖示環(huán)形載體pZMCP150和 PZMCP152的示意圖，所述載體包含玉蜀黍ptDNALBS和RBS以及側(cè)翼連接玉蜀黍16S rRNA 啟動(dòng)子/psbA 5' -UTR和 psbA3< -UTR 的 gfp 基因。箭頭表示 16S rRNA、0RF85 和 trnV 基 因以及PCR引物的位置。在RBS中，End5分別對應(yīng)IRb、pZMCP150和pZMCP152的Y和:V 端。圖3B和3D圖示通過Pstl/PvuII/Sfil消化產(chǎn)生的線性載體TCpZMCP150和TCpZMCP152 的示意圖。包括PvuII酶以減少線性載體片段重新環(huán)化的機(jī)會(huì)。通過限制性消化產(chǎn)生另外 三種線性載體：圖3E圖示TC2pZMCP152的示意圖，其包括具有End5的完整的LBS和最小的 RBS (27bp)區(qū)；圖3F圖示TC3pZMCP152的示意圖，其包括完整的RBS和最小的LBS (172bp)， 沒有End5 ;圖3G圖示TC4pZMCP152的示意圖，其包括完整的LBS和RBS區(qū)，但是末端序列 由來自克隆質(zhì)粒的113和205bp構(gòu)成。
[0033] 圖4A-4B圖示用質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體轟擊的玉蜀黍胚組織的圖像。對來源于用環(huán)形載體 PZMCP150粒子轟擊后的成熟胚的單片愈傷組織成像：對于每對圖像，白光在左側(cè)，GFP在右 偵k在4A和4B中都可以看到植物細(xì)胞壁的自體熒光。圖4A圖示質(zhì)體中沒有GFP表達(dá)的 組織區(qū)域。圖4B圖示質(zhì)體中具有GFP表達(dá)的組織區(qū)域。
[0034] 圖5A-5D圖示用質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體轟擊的玉蜀黍胚組織的圖像。對來源于粒子轟擊后 的成熟胚的單片愈傷組織成像：對于每對圖像，白光在左側(cè)，GFP在右側(cè)。圖5A圖示沒有DNA 的組織，圖5B圖示具有線性載體TCpZMCP150的組織，圖5C圖示具有環(huán)形載體pZMCP152的 組織，圖圖示具有線性載體TCpZMCP152的組織。用GFP濾光片可以觀察到植物細(xì)胞壁 的自體熒光。
[0035] 圖 6A-6B 圖示 SEQ ID NOS :1-14 ;-部分玉蜀黍 End5(SEQ ID NOS :2 和 9)與來 自小麥（SEQ ID NOS :3 和 10)、水稻（SEQ ID NOS :4,5,11 和 12)、煙草（SEQ ID NOS :6 和 13)和苔類植物（SEQ ID NO :7和14)的ptDNA的ptDNA序列比對。共有序列以SEQ ID NOS :1和8顯示。在五個(gè)測序的質(zhì)體基因組中評(píng)估線性ptDNA的末端序列的同源性，該 末端序列本圖中和在圖3中指定為End5,在表6中指定為Endl/5,所述五個(gè)測序的質(zhì)體 基因組為：小麥（Ta，小麥（Triticum aestivum)，NC_02782)，水稻（Osj，日本水稻（Oryza 8已1：；[￥3]_3卩011；^3)，父15901;〇8；[，印度水稻（(^5^3 831：；[￥3；[11(1；^3)，六￥522329)，煙草（財(cái)， 煙草（Nicotiana tabacum)，NC_00189)，和苔類植物（Mp，地錢（Marchantia polymorpha)， X04665)。完整Endl/5序列比對跨越對應(yīng)玉蜀黍質(zhì)體基因組X86563的nt 94920 :96198(圖 11)的1278bp區(qū)域。數(shù)據(jù)最佳適配位于IRb中nt 96976±60和IRa中127767±60的末端 (見表6)。圖6A圖示End5序列的5'端120bp(nt 94976至nt 95095)與其他植物ptDNAs 的比較。圖6B圖示End5序列的Y端120bp(nt 94857至nt 94976)與其他植物ptDNAs 的比較。點(diǎn)表示每種植物中相同的核苷酸（A/G/C/T)，大寫字母表示高度同源性區(qū)域內(nèi)的堿 基改變，小寫字母表示在高度同源區(qū)域外的非同源性。
[0036] 圖 7A-7B 圖示 SEQ ID NOS :15-26 ;-部分玉蜀黍End2(SEQ ID NOS :16 和 22)與圖 6中相同的植物ptDNAs的ptDNA序列比對。圖7A圖示End2序列的Y端120bp(nt 94143 至nt 94262)與其他植物ptDNAs的比較。圖7B圖示End2序列的3'端120bp(nt 94924 至nt 94143)與其他植物ptDNAs的比較。對于Mp沒有發(fā)現(xiàn)相似的序列。
[0037] 圖8A-8B圖示SEQ ID NOS :27和28 ;-部分玉蜀黍End3的5'末端序列（SEQ ID NO :27和28)與圖6中相同的植物ptDNAs進(jìn)行比較，盡管對于其他五種ptDNA序列中的任 一種都沒有發(fā)現(xiàn)相似的序列。圖8A圖示End3序列Y端120bp(nt 87402至nt 87521)。 圖 8B 圖示 End3 序列 3'端 120bp (nt 87283 至 nt 87402)。
[0038] 圖9A-9B. SEQ ID NOS :29-40 ;-部分玉蜀黍End4(SEQ ID NO :30和36)與圖6A-6B 中相同的植物PtDNAs的ptDNA序列比對。圖9A圖示End4序列的Y端120bp(nt 84555 至nt 84674)與其他植物ptDNAs的比較。圖9B圖示End4序列的Υ端120bp(nt 84436 至nt 84555)與其他植物ptDNAs的比較。對于Mp沒有發(fā)現(xiàn)相似的序列。
[0039] 圖 10A-10B 圖示SEQ ID NOS :41-52 ;-部分玉蜀黍End6(SEQ ID NOS :42和48)與 圖6A-6B中相同的植物ptDNAs的ptDNA序列比對。圖IOA圖示End6序列的Y端120bp (nt 93863至nt 93982)與其他植物ptDNAs的比較。對于Nt沒有發(fā)現(xiàn)相似的序列。圖IOB圖 示End6序列的Y端120bp(nt 93744至nt 93863)與其他植物ptDNAs的比較。對于Mp 沒有發(fā)現(xiàn)相似的序列。
[0040] 圖11圖示SEQ ID NO :53 ;完整的Endl/5序列是利用測序數(shù)據(jù)由ClustalW比對確 定的。將在所有個(gè)體測序輸出中發(fā)現(xiàn)最大重疊程度的第一個(gè)核苷酸指定為"真正的末端"。
[0041] 圖12圖示SEQ ID NO :54 ;完整的End2序列是利用測序數(shù)據(jù)由ClustalW比對確 定的。將在所有個(gè)體測序輸出中發(fā)現(xiàn)最大重疊程度的第一個(gè)核苷酸指定為"真正的末端"。
[0042] 圖13圖示SEQ ID NO :55 ;完整的End3序列是利用測序數(shù)據(jù)由ClustalW比對確 定的。將在所有個(gè)體測序輸出中發(fā)現(xiàn)最大重疊程度的第一個(gè)核苷酸指定為"真正的末端"。
[0043] 圖14圖示SEQ ID NO :56 ;完整的End4序列是利用測序數(shù)據(jù)由ClustalW比對確 定的。將在所有個(gè)體測序輸出中發(fā)現(xiàn)最大重疊程度的第一個(gè)核苷酸指定為"真正的末端"。
[0044] 圖15圖示SEQ ID NO :57 ;完整的End6序列是利用測序數(shù)據(jù)由ClustalW比對確 定的。將在所有個(gè)體測序輸出中發(fā)現(xiàn)最大重疊程度的第一個(gè)核苷酸指定為"真正的末端"。
[0045] 詳述
[0046] 本公開內(nèi)容提供質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，用于所述方法的線性DNA載體，通過所述方法 得到的轉(zhuǎn)質(zhì)體植物或植物部分，以及這些植物和植物部分的后代。
[0047] 標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法使用環(huán)形載體，使用在光照下生長的綠色植物組織通過同源 重組發(fā)生轉(zhuǎn)基因向質(zhì)體基因組中的整合。僅在某些雙子葉物種中觀察到使用所述方法成功 獲得了質(zhì)體轉(zhuǎn)化，而在谷類植物（單子葉植物），如玉蜀黍（maize)、小麥和水