一種含有雙報告基因的雙t-dna載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含有雙報告基因的雙T-DNA載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明對傳統(tǒng)的雙T-DNA載體進(jìn)行改進(jìn)，將利用生物安全標(biāo)記基因和剔除轉(zhuǎn)基因植株選擇標(biāo)記基因這兩種方法相結(jié)合，將報告基因GUS基因和選擇標(biāo)記基因連入同一個T-DNA區(qū)域，將GFP基因和目的基因連入另一個T-DNA區(qū)域，得到含有雙報告基因的雙T-DNA載體，通過后代自交分離檢測兩個報告基因，剔除目的基因與選擇標(biāo)記基因發(fā)生共整合的轉(zhuǎn)基因植株，最終得到只有目的基因而無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因安全植株，快速篩選得到含有目的基因和生物安全標(biāo)記GFP的轉(zhuǎn)基因安全植株，這樣大大節(jié)省了人力物力財(cái)力，有效提高了基因整合的效率以及安全轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生。
【專利說明】一種含有雙報告基因的雙T-DNA載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，涉及一種含有雙報告基因的雙T-DNA載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]糧食問題是各個國家的核心問題，由于環(huán)境的惡化，耕地面積的大量減少，人口的不斷增長，我國的糧食問題面臨著越來越大的挑戰(zhàn)，解決好糧食安全問題是保證經(jīng)濟(jì)高效和可持續(xù)發(fā)展的重要前提。實(shí)踐表明，科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與突破是解決糧食問題最重要的途徑之一，利用基因工程技術(shù)改良農(nóng)作物品種，提高農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量具有越來越重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]轉(zhuǎn)基因技術(shù)始于上世紀(jì)八十年代，該技術(shù)從出現(xiàn)即得到廣泛的關(guān)注與應(yīng)用，到現(xiàn)在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)，農(nóng)業(yè)資源利用率，改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境等的有效手段之一。目前，轉(zhuǎn)基因植物主要包括經(jīng)濟(jì)作物、糧食作物、蔬菜、花卉、藥用植物、果樹以及牧草等。從1996年第一批轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化應(yīng)用以來，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積逐年增加，到2012年其種植面積增長了 100倍(ISAAA，2012)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)亦成為近代農(nóng)業(yè)史上發(fā)展利用最快的新技術(shù)之一。但是，隨著該技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們在關(guān)注轉(zhuǎn)基因植物帶來巨大經(jīng)濟(jì)和社會效益的同時，其安全問題也引起了人們普遍的關(guān)注。在植物轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因在植物受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化頻率相當(dāng)?shù)停瑸榱丝焖俜奖愕膹凝嫶蟮氖荏w細(xì)胞群中得到真正的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，特異性的選擇標(biāo)記基因被廣泛的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因過程中。然而，選擇標(biāo)記基因的安全性卻受到人們的 質(zhì)疑，主要表現(xiàn)在:目前被廣泛應(yīng)用的選擇標(biāo)記基因主要是抗生素抗性基因和除草劑抗性基因，這些基因可能會轉(zhuǎn)移到微生物中，使得病原菌獲得抗性，從而導(dǎo)致臨床使用的抗生素失效；此外，可能發(fā)生基因漂流，經(jīng)自然雜交傳遞到野生雜草中，產(chǎn)生抗藥性超級雜草，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境帶來極大的危害；最后，這些基因及其產(chǎn)物可能會對動物和人類健康安全產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，提高轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)記基因的安全性是現(xiàn)今植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要目標(biāo)和迫切任務(wù)。
[0004]目前，提高轉(zhuǎn)基因植物中選擇標(biāo)記基因安全性的策略主要有:使用無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；利用無爭議的生物安全標(biāo)記基因；剔除已獲得轉(zhuǎn)基因植株的選擇標(biāo)記基因。使用無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，轉(zhuǎn)基因陽性植株篩選的工作量巨大，費(fèi)時費(fèi)力；利用無爭議的生物安全標(biāo)記基因操作簡單，是目前最為常用的方法；而剔除標(biāo)記基因則可以完全避免選擇標(biāo)記基因所帶來的安全隱患，并有利于多基因轉(zhuǎn)化。因此，利用無爭議的生物安全標(biāo)記基因和剔除轉(zhuǎn)基因植株選擇標(biāo)記基因成為當(dāng)前轉(zhuǎn)基因研究的主要手段。
[0005]報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，即一種表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。GUS基因(β-D-葡萄糖苷酸酶基因)是目前常用的一種報告基因，其表達(dá)產(chǎn)物β -葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β -葡萄糖苷酸，將5-溴-4氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸脂(X-Gluc)分解為藍(lán)色物質(zhì)，其檢測方法簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定，且背景活性低。另一種常用的報告基因是綠色熒光蛋白(GFP)基因，GFP是一類存在于水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白，在受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時，GFP發(fā)射綠色熒光，其檢測方便，只需激發(fā)光源，不需任何底物或輔助因子，且材料可活體觀測，同時，GFP生色基團(tuán)的形成無種屬特異性，在原核真核細(xì)胞中都能表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞基本沒有毒害作用，并且不影響細(xì)胞的正常生長和功能。GFP基因是近年來發(fā)現(xiàn)的生物安全標(biāo)記基因之
O
[0006]剔除轉(zhuǎn)基因植株選擇標(biāo)記基因的方法主要有位點(diǎn)特異性重組、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)以及共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其中，共轉(zhuǎn)化法是研究比較多，應(yīng)用比較成熟的方法，它具有操作簡便，適用范圍廣，基因轉(zhuǎn)化效率較高等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于水稻、煙草、油菜、大豆、玉米等植物中。共轉(zhuǎn)化法是將選擇標(biāo)記基因和目的基因分別構(gòu)建在2個不同的載體上，共同轉(zhuǎn)化植物受體細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因共整合的植株，再經(jīng)過轉(zhuǎn)化植株有性階段的遺傳重組，使選擇標(biāo)記基因與目的基因分離，得到剔除了選擇標(biāo)記基因的陽性轉(zhuǎn)化植株。但是，由于不同植物轉(zhuǎn)基因載體的基因共整合效率有差異，而且易整合在受體基因組的同一位置，使其應(yīng)用受到了限制。為了解決這個問題，研究者又構(gòu)建了含有兩個T-DNA的超級雙元載體，即選擇標(biāo)記基因和目的基因分別插入到同一質(zhì)粒而又相互獨(dú)立的T-DNA區(qū)內(nèi)，這有效提高了共整合效率，但是在得到的共整合轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，有大部分雙T-DNA整合在了基因組的同一位點(diǎn)，使得在后代遺傳中，雙T-DNA載體上的基因不能分離，無法得到無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因陽性植株，如何在轉(zhuǎn)基因后代中簡單快速剔除含選擇標(biāo)記基因的共整合植株是提高共轉(zhuǎn)化效率和培育無選擇標(biāo)記基因安全轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的第一個目的在于提供一種簡單快速構(gòu)建雙T-DNA載體的方法，通過簡單的PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn)后只需要一次連接轉(zhuǎn)化就能得到雙T-DNA載體。利用該載體可以通過轉(zhuǎn)基因陽性后代植株自交分離得到無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因安全植株。
[0008]本發(fā)明的第二個目的在于提供一種含有雙報告基因的雙T-DNA載體及其應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第三個目的在于提供構(gòu)建含有雙報告基因的雙T-DNA載體的方法。
[0010]首先，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建雙T-DNA載體pTRIDT313的方法，包括以下步驟:
[0011](1)以 pCMBIA1302 載體為模板，以 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 與 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示核苷酸序列為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到T-DNA左右邊界LB和RB，LB引入酶切位點(diǎn)SphI和BglII，RB引入酶切位點(diǎn)SacI和SphI ；
[0012](2)將左右邊界LB和RB分別連到pMD19-T載體，與骨架載體pCAMBIA1302分別進(jìn)行酶切，再用T4連接酶進(jìn)行三片段連接，得到含兩套T-DNA邊界的雙T-DNA載體PTRIDT313。
[0013]其中，步驟⑴中獲得的左右邊界LB和RB的核苷酸序列分別如SEQID N0.5,SEQID N0.6 所示。
[0014]進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種含有雙報告基因的雙T-DNA載體，該載體具有兩個T-DNA區(qū)域，一 個T-DNA區(qū)域含有報告基因⑶S和選擇基因，另一個T-DNA區(qū)域含有報告基因GFP和目的基因。
[0015]本發(fā)明提供的一種含有雙報告基因的雙T-DNA載體中，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)、氯霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt II )、除草劑抗性Bar基因。
[0016]在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所用的選擇基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因。
[0017]更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的含有雙報告基因的雙T-DNA載體為pTRIDT314。其結(jié)構(gòu)圖譜見圖8。
[0018]本發(fā)明還提供了含有雙報告基因的雙T-DNA載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0019](I)雙T-DNA載體的構(gòu)建，包括:
[0020]I)以 pCMBIA1302 載體為模板，以 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2 與 SEQ ID N0.3,SEQID N0.4所示核苷酸序列為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到T-DNA左右邊界LB和RB，LB引入酶切位點(diǎn)SphI和BglII，RB引入酶切位點(diǎn)SacI和SphI ；
[0021]2)將左右邊界LB和RB分別連到pMD19_T載體，與骨架載體pCAMBIA1302分別進(jìn)行酶切，再用T4連接酶進(jìn)行三片段連接，得到含兩套T-DNA邊界的雙T-DNA載體pTRIDT313 ；
[0022](2)含GUS基因的中間載體的構(gòu)建，包括PCR擴(kuò)增得到GUS基因，將其連接到PMD19-T載體，通過限制性酶切位點(diǎn)將pTRIDT313載體潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因替換成GUS基因，得到含⑶S基因的中間載體pTRIDT313-GUS ；
[0023](3)將中間載體pTRIDT313-GUS和連接選擇標(biāo)記基因的T載體經(jīng)SacI和EcoRI酶切后連接，選擇 標(biāo)記基因插入中間載體PTRIDT313-GUS后，即得到含有雙報告基因的雙T-DNA載體。
[0024]上述構(gòu)建方法中，步驟⑵中PCR擴(kuò)增得到⑶S基因使用的引物序列如SEQ IDN0.7 和 SEQ ID N0.8 所示。
[0025]其中，步驟(2)中所述限制性酶切位點(diǎn)為XhoI。
[0026]優(yōu)選地，步驟(3)中選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因。
[0027]在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，步驟(3)中選擇標(biāo)記基因?yàn)榘瑔幼雍徒K止子的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其以PCMBIA1302載體為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得，所用引物如SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.11所示，其中引物中分別引入SacI和EcoRI酶切位點(diǎn)。
[0028]本發(fā)明提供了含有雙T-DNA載體pTRIDT314的宿主細(xì)胞。
[0029]本發(fā)明提供了上述含有雙報告基因的雙T-DNA載體在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
[0030]本發(fā)明提供了上述含有雙報告基因的雙T-DNA載體在篩選無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0031]本發(fā)明提供了上述含有雙報告基因的雙T-DNA載體在檢測轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0032]目前，檢測轉(zhuǎn)基因植株的方法主要是PCR擴(kuò)增和Southern雜交，PCR擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)是快速，能夠大量檢測，但結(jié)果往往存在假陽性，而Southern雜交結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但方法復(fù)雜，成本高，效率低。本發(fā)明構(gòu)建的含雙報告基因⑶S和GFP的轉(zhuǎn)基因載體，可通過直接檢測報告基因，能快速、準(zhǔn)確又簡單的檢測轉(zhuǎn)基因后代植株。
[0033]本發(fā)明改進(jìn)了傳統(tǒng)的雙T-DNA載體，將利用生物安全標(biāo)記基因和剔除轉(zhuǎn)基因植株選擇標(biāo)記基因這兩種方法相結(jié)合，將報告基因GUS基因和篩選基因抗潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因連入同一個T-DNA區(qū)域，將GFP基因和目的基因連入另一個T-DNA區(qū)域，得到含有雙報告基因的雙T-DNA載體，由于GUS和GFP基因分別存在于兩個T-DNA中，同時檢測兩種報告基因，就可從轉(zhuǎn)基因后代植株中準(zhǔn)確快速的篩選出目的基因與選擇標(biāo)記基因發(fā)生分離的植株，從而得到只有目的基因而無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因安全植株，即通過檢測兩個報告基因快速篩選得到含有目的基因和生物安全標(biāo)記GFP的轉(zhuǎn)基因安全植株，這樣大大節(jié)省了人力物力財(cái)力，有效提高了基因整合的效率以及安全轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為片段LB和RB的PCR擴(kuò)增圖，其中泳道1.Marker I ;泳道2_5為目的片段LB ;泳道6-9為目的片段RB。
[0035]圖2為片段⑶S和Hygromycin的PCR擴(kuò)增圖，其中泳道LMarker III ;2_5.目的片段⑶S ；6-9.目的片段Hygromycin。
[0036]圖3為載體？111^^313的酶切驗(yàn)證圖，其中泳道1.1&^1?^ III ；2.酶切樣品；3.質(zhì)粒 PTIRDT313。
[0037]圖4為中間載體pTIRDT313-GUS的酶切驗(yàn)證圖，其中泳道l.Marker III ；2.質(zhì)粒PTIRDT313-GUS ；3.酶切樣品。
[0038]圖5為載體pTIRDT314的酶切驗(yàn)證圖，其中泳道1.Marker D15000 ；2.酶切樣品；
3.質(zhì)粒 pTIRDT314。
[0039]圖6為植物表達(dá)雙T-DNA載體pTIRDT313圖譜。 [0040]圖7為中間載體pTIRDT313-GUS圖譜。
[0041]圖8為植物表達(dá)雙報告基因雙T-DNA載體pTIRDT314圖譜。
[0042]圖9為轉(zhuǎn)煙草Tl代GUS基因檢測圖，其中A圖為PCR檢測電泳圖，泳道l.MarkerII，泳道2-8為轉(zhuǎn)基因再生植株，9為野生型煙草陰性對照，10為質(zhì)粒陽性對照，11為H2O陰性對照；B圖為GUS染色為陽性植株圖。
[0043]圖10為轉(zhuǎn)煙草Tl代GFP基因PCR檢測圖，泳道I為Marker II，泳道2_15為實(shí)施例3獲得的轉(zhuǎn)基因再生植株，其中4、5、6、10、11、12、13、15檢測為陽性的植株，16 SH2O陰性對照，17為野生型煙草陰性對照，18為質(zhì)粒陽性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0044]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0045]若未特別指明，實(shí)施例中所用的引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成，測序工作由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成，PMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司，感受態(tài)DH5a購自天根生化科技有限公司，限制性內(nèi)切酶購自NEB (北京)有限公司。其他生化試劑非特別注明外均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0046]本發(fā)明試劑配方:
[0047]X-GLUC 染色液:50mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH = 7.0) ； IOmmoI/LNa2EDTA (pH=8.0) ；0.5mmol/L K3 [Fe (CN)6] ；0.5mmol/L K4 [Fe (CN)6] ；0.1 % Triton-XlOO ；0.8g/LX-Gluc。
[0048]實(shí)施例1雙T-DNA載體pTRIDT313的構(gòu)建
[0049]步驟1:設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增T-DNA左右邊界
[0050]根據(jù)已公布的pCMBIA1302載體的序列(GenBank:AF234298.1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增T-DNA左邊界(LB)的引物，引物中包括限制性酶切位點(diǎn)SphI和Bglll，序列見SEQ ID N0.1, SEQID N0.2;設(shè)計(jì)擴(kuò)增T-DNA右邊界(RB)的引物，引物中包括限制性酶切位點(diǎn)SacI和SphI，序列見SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.4。引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成，所述引物序列如下:
[0051]SEQ ID N0.1:GGTGCATGCGGACTGATGGGCTGCCTG
[0052]SEQ ID N0.2:TAAAGATCTCAGTACATTAAAAACGTC
[0053]SEQ ID N0.3:GAGCTCCACGAGGTGCCACCATGTTGGTTAAA
[0054]CTATCAGTGTTTG
[0055]SEQ ID N0.4:TTGGCATGCACATACAAATGGACG
[0056]以pCAMBIA1302 為模板，以 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 LB,即SEQ ID N0.5，目的片段約為168bp(圖1)。以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增RB，即SEQ ID N06,目的片段約為156bp (圖1)。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，連接PMD19-T載體，16°C連接過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，篩選陽性克隆。測序并命名為T-LB和T-RB。
[0057]步驟2:含兩對邊界的雙T-DNA載體pTRIDT313的構(gòu)建
[0058]將經(jīng)過測序驗(yàn)證的含有目的片段SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6的質(zhì)粒T-LB和T-RB分別在37°C下經(jīng)SphI，BglII和SacI，SphI雙酶切4h，然后將酶切產(chǎn)物跑膠分別回收168bp和156bp的片段；同時，將骨架載體pCMBIA1302在37°C下經(jīng)SacI和BglII雙酶切4h后跑膠回收IOkb左右的載體片段。兩條目的片段和一條載體片段在T4連接酶的作用下22°C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，以SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3為引物進(jìn)行PCR鑒定，若LB和RB連入載體，則擴(kuò)增出309bp的片段，然后將陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒，用BglII和SacI雙酶切得到一條與預(yù)期大小一致的片段。最后進(jìn)行測序驗(yàn)證，將測序正確的載體命名pTRIDT313(見圖6)，此即為含有兩個T-DNA邊界區(qū)適合農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化的植物轉(zhuǎn)基因載體。由于RB的右端和LB的左端分別設(shè)計(jì)了相同酶切位點(diǎn)SphI，這樣可以同時將兩個片段連入載體，減少了載體構(gòu)建的步驟和時間。雖然載體也含有SphI酶切位點(diǎn)，但通過此方法載體不需要進(jìn)行SphI酶切，這樣在載體構(gòu)建中增加了限制性酶切位點(diǎn)的選擇空間。
[0059]實(shí)施例2含有兩個報告基因雙T-DNA載體的構(gòu)建
[0060]步驟1:含β -葡萄糖醛酸糖苷酶基因(OTS)的中間載體構(gòu)建
[0061]I)⑶S基因的克隆:根據(jù)已知⑶S基因序列(GenBank:AF527487.1)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增⑶S基因全長，且在兩條引物中都引入酶切位點(diǎn)Xhol。所述引物SEQ ID N0.7和SEQ IDN0.8序列如下，下劃線部分為酶切位點(diǎn)序列:
[0062]SEQ ID N0.7:TGACTCGAGATGGTCCGTCCTGTAGAA
[0063]SEQ ID N0.8:CAACTCGAGTTCATTGTTTGCCTCCCT
[0064]以PAL156載體為模板，SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8為引物PCR擴(kuò)增⑶S基因，即SEQ ID N0.9， 目的片段約為2048+6+6bp (圖3)。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、連接pMD19_T，轉(zhuǎn)化鑒定陽性克隆后測序，測序正確的質(zhì)粒命名為T-GUS。
[0065]2)⑶S基因的插入
[0066]將載體pTRIDT313進(jìn)行XhoI單酶切4h后，用去磷酸化酶37°C去磷酸化15min，80°C水浴20min ;與同樣經(jīng)過XhoI酶切的質(zhì)粒T-⑶S跑膠，分別回收IOkb左右的載體和2000bb左右的⑶S基因片段，然后在T4連接酶作用下22°C連接過夜。以SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8為引物進(jìn)行PCR鑒定，若⑶S基因連入載體，則擴(kuò)增出2054bp的片段，通過XhoI酶切出一條2000bp左右的片段(圖4)。由于本發(fā)明采用的是單酶切，因而需要通過測序確定連入⑶S基因的方向，將測序方向正確的質(zhì)粒命名為pTRIDT313-GUS(圖譜見圖7)。
[0067]步驟2:含有兩個報告基因的雙T-DNA載體的構(gòu)建
[0068]I)包含啟動子和終止子的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因克隆:根據(jù)已公布的PCAMBIA1302載體序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含啟動子、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和終止子的引物，且在引物中分別引入SacI和EcoRI酶切位點(diǎn)，引物序列如下:
[0069]SEQ ID NOlO:TACGAGCTCATGGTGGAGCACGACA
[0070]SEQ ID NOl1:CTCGAATTCTAATTCGGGG GATCTG
[0071]以pCAMBIA1302 為模板，以 SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11 為引物 PCR 擴(kuò)增，SPSEQ ID N0.12,目的片段約為2066+6+6bp (圖3)。對產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，連接pMD19_T，轉(zhuǎn)化鑒定，測序正確的質(zhì)粒命名為T-Hygromycin。
[0072]2)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的插入
[0073]將中間載體pTRIDT313-GUS和T-Hygromycin經(jīng)SacI和EcoRI酶切膠回收后，在T4連接酶作用下22 °C連接過夜。以SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11為引物進(jìn)行PCR鑒定，若潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因連 入載體，則擴(kuò)增出2072bp的片段，經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒為含有兩個報告基因的雙T-DNA載體，且兩個T-DNA區(qū)域分別包括一個報告基因，命名pTRIDT314(圖 8)。
[0074]實(shí)施例3pTRIDT314載體的遺傳轉(zhuǎn)化及后代植株陽性篩選
[0075]含有雙報告基因的雙T-DNA載體pTRIDT314載體葉盤法轉(zhuǎn)化煙草
[0076]I)本發(fā)明采用熱擊轉(zhuǎn)化法(方法參考分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊)，將重組質(zhì)粒PTRIDT314導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選鑒定為陽性的重組子命名為LBA4404-pTRIDT314。
[0077]2)采用葉盤法將重組子轉(zhuǎn)化煙草，具體操作步驟如下:
[0078]a.取幼嫩健康的葉片，用蒸餾水沖洗一遍，70%乙醇洗45s，10%次氯酸鈉消毒6 — 8min,無菌水沖洗5次,無菌濾紙吸干水分。
[0079]b.挑取一個單菌落根癌農(nóng)桿菌，接種到20ml含利福平和卡那霉素抗生素的YEB培養(yǎng)液中，在28°C、180rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)到OD值為0.6-0.8。取以上培養(yǎng)物按1%的比例，轉(zhuǎn)入新鮮的無抗菌素的YEB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)8-12小時，當(dāng)OD值為0.4-0.6時即可用于轉(zhuǎn)化。
[0080]c.在超凈工作臺上，將菌液倒入無菌小培養(yǎng)皿，添加終濃度為120ym/L的乙酰丁香酮，將無菌葉片剪成0.5cmX0.5cm的小塊，放入菌液中泡6_8分鐘。取出外植體在無菌濾紙上吸去附著的菌液。然后接種在MS培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2天。
[0081]d.將經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到含1.0mg/L6-BA, 0.lmg/LNAA, 40mg/L潮霉素和150mg/L Timentin的MS培養(yǎng)基上。在光照的條件下，25°C進(jìn)行選擇培養(yǎng)。
[0082]e.選擇培養(yǎng)2-3周后,待不定芽長到Icm左右時,切下不定芽并轉(zhuǎn)移到含有40mg/L潮霉素和150mg/L Timentin的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0083]f.兩周左右長出不定根，然后移栽到土壤中。[0084]3)轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株的檢測
[0085]以上得到的具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因煙草植株有三種情況，一種為只有選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入植株；第二種為選擇標(biāo)記基因和GFP基因共整合到染色體同一位置；第三種為選擇標(biāo)記基因和GFP基因共整合到染色體的的不同位置，這種是可以通過后代自交分離得到無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS染色和GFP檢測可以篩選到第二種和第三種情況的轉(zhuǎn)基因植株。具體方法如下:
[0086]a.GUS 染色
[0087]取再生植株的葉片進(jìn)行⑶S染色，將準(zhǔn)備好的葉片放入EP管中，加入X-GLUC染色液浸沒葉片，封好蓋子；放入37°C培養(yǎng)箱溫浴l_12h ;倒掉侵染液加入70%乙醇脫色2-3次，去除葉綠素至陰性對照為白色為止，觀察葉片顏色。陽性植株葉片被染成藍(lán)色，非陽性植株葉片褪色后為白色或淡黃色。
[0088]b.GFP 檢測[0089]取再生植株的葉片或根尖制作切片；使用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡在488nm波長的藍(lán)光激發(fā)下，觀察GFP的表達(dá)。在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下，陽性植株葉片被激發(fā)出綠色熒光，非陽性植株葉片無熒光。
[0090]本發(fā)明通過葉盤法將質(zhì)粒pTRIDT314轉(zhuǎn)化煙草，得到轉(zhuǎn)基因植株，取再生植株的葉片分別進(jìn)行GUS染色和GFP檢測。陽性植株包括三種情況，一種是植株葉片只能被GUS染液染成藍(lán)色，觀察不到綠色熒光；另一種是植株葉片不能被GUS染液染成藍(lán)色，但能觀察到綠色熒光；最后一種是植株葉片既能被GUS染液染成藍(lán)色，又能觀察到綠色熒光。
[0091]4)無選擇標(biāo)記基因植株的獲得
[0092]采用GUS染色、GFP觀察以及PCR擴(kuò)增的方法，對經(jīng)潮霉素篩選存活的70株煙草再生植株進(jìn)行檢測，結(jié)果如下:通過PCR擴(kuò)增⑶S基因和葉片⑶S染色，得到17株陽性再生煙草苗(圖9);通過PCR擴(kuò)增GFP基因和熒光顯微鏡GFP觀察，得到13株陽性再生煙草苗(圖10);其中，能檢測到GFP基因的13株再生煙草苗都能檢測到GUS基因，而有5株再生煙草苗只能檢測到GUS基因。得到的這13株同時有GUS基因和GFP基因的再生煙草苗可以通過T2-Tn代用上述方法篩選剔除含選擇標(biāo)記基因的共整合植株，得到只有GFP基因而不攜帶選擇標(biāo)記基因的安全植株。如果將目的基因連入GFP報告基因所在的T - DNA區(qū)域，通過此方法篩選得到只觀察到綠色熒光而不能被GUS染液染成藍(lán)色的植株為不帶選擇標(biāo)記基因的安全植株。此結(jié)果說明本發(fā)明所構(gòu)建的雙報告基因雙T-DNA載體可用于獲得無標(biāo)記基因的安全植株。
[0093]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建雙T-DNA載體的方法，其特征在于，所述雙T-DNA載體為pTRIDT313，包括以下步驟:
(1)以pCMBIA1302 載體為模板，以 SEQ ID N0.USEQ ID N0.2 與 SEQ ID N0.3,SEQ IDN0.4所示核苷酸序列為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到T-DNA左右邊界LB和RB，LB引入酶切位點(diǎn)SphI和BglII，RB引入酶切位點(diǎn)SacI和SphI ； (2)將左右邊界LB和RB分別連到pMD19-T載體，與骨架載體pCAMBIA1302分別進(jìn)行酶切，再用T4連接酶進(jìn)行三片段連接，得到含兩套T-DNA邊界的雙T-DNA載體pTRIDT313。
2.含有雙報告基因的雙T-DNA載體，其特征在于，該載體具有兩個T-DNA區(qū)域，一個T-DNA區(qū)域含有報告基因GUS和選擇基因，另一個T-DNA區(qū)域含有報告基因GFP和目的基因。
3.如權(quán)利要 求2所述的含有雙報告基因的雙T-DNA載體，其特征在于，所述選擇基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因hpt、氯霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因cat、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因npt I1、除草劑抗性Bar基因。
4.如權(quán)利要求2或3所述的含有雙報告基因的雙T-DNA載體，其特征在于，其為PTRIDT314。
5.如權(quán)利要求2或3所述含有雙報告基因的雙T-DNA載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雙T-DNA載體的構(gòu)建，包括:
1)以pCMBIA1302 載體為模板，以 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 與 SEQ ID N0.3、SEQ IDN0.4所示核苷酸序列為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到T-DNA左右邊界LB和RB，LB引入酶切位點(diǎn)SphI和BglII，RB引入酶切位點(diǎn)SacI和SphI ； 2)將左右邊界LB和RB分別連到pMD19-T載體，與骨架載體pCAMBIA1302分別進(jìn)行酶切，再用T4連接酶進(jìn)行三片段連接，得到含兩套T-DNA邊界的雙T-DNA載體pTRIDT313 ； (2)含GUS基因的中間載體的構(gòu)建，包括PCR擴(kuò)增得到⑶S基因，將其連接到pMD19-T載體，通過限制性酶切位點(diǎn)將PTRIDT313載體潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因替換成GUS基因，得到含⑶S基因的中間載體pTRIDT313-GUS ； (3)將中間載體pTRIDT313-GUS和連接選擇標(biāo)記基因的T載體經(jīng)SacI和EcoRI酶切后連接，選擇標(biāo)記基因插入中間載體PTRIDT313-GUS后，即得到含有雙報告基因的雙T-DNA載體。
6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中PCR擴(kuò)增得到GUS基因使用的引物序列如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
7.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中所述限制性酶切位點(diǎn)為XhoI。
8.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)中選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因。
9.如權(quán)利要求2~4任一所述的含有雙報告基因的雙T-DNA載體在篩選無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求2~4任一所述的含有雙報告基因的雙T-DNA載體在檢測轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/63GK103952426SQ201410175961
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】江千濤, 趙珊, 王際睿, 陳國躍, 祁鵬飛, 劉亞西, 蒲至恩, 李偉, 魏育明, 鄭有良 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)