開放式培養(yǎng)馬鈴薯組培苗的霉菌抑菌劑及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種開放式培養(yǎng)馬鈴薯組培苗的霉菌抑菌劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯脫毒試管苗的快速繁殖是馬鈴薯原原種生產(chǎn)的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，在相對短的時間 內(nèi)保證和提高試管苗快繁的質(zhì)量對馬鈴薯種薯生產(chǎn)具有重要意義。然而，馬鈴薯脫毒試管 苗快繁過程中經(jīng)常由于各種原因出現(xiàn)不同菌類的污染，如細菌、霉菌、酵母菌、放線菌等，這 些微生物生長速度快。細菌、酵母菌、放線菌污染經(jīng)過2~3次轉(zhuǎn)接后可以去掉污染。而霉 菌污染可直接侵入到試管苗組織內(nèi)部，用一般的消毒方法很難處理，孢子的擴散會造成大 面積的污染，擴展速度很快，且擴散后繼代苗仍全部表現(xiàn)為污染。霉菌污染后的試管苗生長 緩慢，長勢弱，生根少或不生根，污染苗移栽成活率低，嚴重影響試管苗的生長，給生產(chǎn)帶來 損失。為了解決馬鈴薯快繁過程中污染的問題，針對馬鈴薯脫毒試管苗快繁中控制污染發(fā) 生的研究工作，已有了一些報道。
[0003] 陳亞蘭（2012)以不同濃度的醫(yī)用抗生素、防腐劑、化學(xué)農(nóng)藥為抑菌劑，培養(yǎng)基經(jīng)高 溫滅菌后直接用注射器注入抑菌物質(zhì)，研究馬鈴薯組培苗擴繁中的抑菌效果以及對組培苗 生長及生根的影響。試驗結(jié)果表明，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和50%多菌靈可濕性粉劑 對馬鈴薯組培苗生產(chǎn)中最常見的青霉菌、細菌和酵母菌3種菌都具有較好抑制作用，并且 對馬鈴薯試管苗的生長以及生根產(chǎn)生的負影響最小。
[0004] 彭廣霖等（2012)在MS培養(yǎng)基中分別加入5、10、20、30和40 mg / L次氯酸鈉，以 馬鈴薯組培苗為試驗材料，分析對組培苗枯草桿菌(細菌)污染的防治效果。結(jié)果表明，經(jīng)過 2~3次轉(zhuǎn)接后，5和10 mg / L次氯酸鈉對馬鈴薯組培苗枯草桿菌的抑菌效果較好，該濃 度處理組的組培苗未出現(xiàn)污染，且苗木生長較好，但隨著濃度的升高防治效果明顯下降。
[0005] 宿飛飛等（2012)采用平板生長抑制法，用苦參、中草藥和黑農(nóng)一號3種植物源殺 菌劑，對植物組織培養(yǎng)中青霉菌抑菌效果進行研究。分別配制成不同濃度梯度的藥液，對照 為不加植物源殺菌劑的培養(yǎng)基，經(jīng)高溫高壓滅菌后，準確量取一定量的藥液加入到熱的培 養(yǎng)基中。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入黑農(nóng)一號抑菌劑抑制青霉菌的效果最好，濃度在2. 0% 時，抑菌率達100. 0%。
[0006] 宿飛飛等（2010)在培養(yǎng)基中加入卡那霉素、青霉素、鏈霉素及青霉素和鏈霉素配 合使用的抗生素，研究抑菌劑在馬鈴薯快繁過程中的抑制細菌的效果。結(jié)果表明：在培養(yǎng)基 中加入卡那霉素、青霉素 G鈉、青霉素和鏈霉素的混合物都能抑制細菌的污染，但青霉素各 處理不僅能抑制細菌污染，而且對試管苗的生長有明顯的促進作用，其中青霉素60 mg · L- 的效果最好，同時抑菌劑的抑菌作用具有時效性。
[0007] 王春（2004)在馬鈴薯組織培養(yǎng)中試驗了 4種抗生素的抑菌效果。結(jié)果表明，培養(yǎng) 基添加20mg / L氨芐西林鈉或硫酸鏈霉素時，能有效抑制品種大西洋試管苗的細菌性 浸染。
[0008] 楊晨（2012)試驗觀察了不同濃度的苯甲酸鈉和山梨酸鉀在馬鈴薯脫毒試管苗快 繁中的抑菌效果。結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基中加入山梨酸鉀有明顯的抑菌效果，且對試管苗 的生長有明顯的促進作用，其中以20 mg / L的用量效果最好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是：提供一種開放式培養(yǎng)馬鈴薯組培苗的霉菌抑菌劑及其使用方 法，它能降低馬鈴薯試管苗中霉菌的污染，降低污染率和生產(chǎn)成本。
[0010] 本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案：開放式培養(yǎng)馬鈴薯組培苗的霉菌抑菌 劑，以次氯酸鈉作為唯一成分。
[0011] 開放式培養(yǎng)馬鈴薯組培苗的霉菌抑菌劑的使用方法，將次氯酸鈉加入開放式培養(yǎng) 馬鈴薯組培苗的培養(yǎng)基中，使其占培養(yǎng)基總質(zhì)量的0. 5%。
[0012] 在進行開放式培養(yǎng)前，先采用次氯酸鈉溶液對開放式培養(yǎng)的器具進行清洗，再用 冷開水洗滌器具，再按流程進行開放式培養(yǎng)。
[0013] 為了驗證本發(fā)明的技術(shù)效果，發(fā)明人進行了如下實驗： 1試驗材料 1. 1霉困 試驗用的霉菌菌種是從污染的組培苗中分離獲得。
[0014] 1.2抑菌類試劑 大蒜素：Solarbio, Ig進口分裝，培養(yǎng)基燒開融化或滅菌稍冷時加入，由于價高，僅用 于試驗2。
[0015] 新鮮大蒜：市場購買。稱取50g新鮮大蒜，水果攪拌機打碎，用50ml無菌水溶 解，3層紗布過濾，再用進口的無菌過濾器過濾。大蒜素在高溫下易被破壞，而失去殺菌作 用，因此培養(yǎng)基燒開融化或滅菌稍冷時加入，用于試驗3。按大蒜約含1%的大蒜素計算 (資料來源：網(wǎng)訊），50g大蒜中含有0.5g (即500mg)大蒜素。通過過濾獲得的溶液體積為 64ml, Iml的新鮮大蒜液中含有大蒜素7. 8mg,試驗3的新鮮大蒜液用量為5ml,即含大蒜素 大約 40mg/L。
[0016] 次氯酸鈉：天津富宇精細化工有限公司生產(chǎn)，有效氯成分為彡10%，500ml裝。
[0017] 植培靈：上海宇涵生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號為141218, 100ml。
[0018] 益培?。荷虾Ｓ詈锟萍加邢薰?，產(chǎn)品批號141015, 10g。
[0019] 多菌靈 a :Aladdin, C9H9N3O2, Mff=191. 19,分析純（％) lg，價高，僅用于試驗 1。
[0020] 多菌靈b :加拿大凱姆科爾生化科學(xué)(集團)有限公司生產(chǎn)，進口 400g裝，80%WP，用 于試驗2和試驗3。
[0021] 1.3培養(yǎng)基 菌類和馬鈴薯試管苗生長培養(yǎng)基均為購買的MS培養(yǎng)基(恒因公司購買)。
[0022] 1.4馬鈴薯組培苗 本試驗采用"費烏瑞它"突變選育5-6代穩(wěn)定的株系37A、以及在西藏引進的紅皮黃肉 的馬鈴薯"西紅"組培苗為試驗材料，以未加抑菌劑的原株系為對照。
[0023] 試驗方法與結(jié)果 2. 1試驗1 2. I. 1試驗日期與地點：2015年2月10日，貴州省生物技術(shù)研究所實驗室。
[0024] 2. I. 2試驗處理設(shè)置 1) 次氯酸鈉（C):濃度梯度為0. 0%(CK)，0. 005%，0. 01%，0. 02%，0. 03%;每瓶接種馬鈴薯 組培苗8株，每個處理5瓶（以下處理均同）； 2) 多菌靈 a(DJ) :0%(CK)，15mg/L, 30mg/L, 45mg/L, 60mg/L, 75mg/L; 3) 益培?。╕) : 0. 0% (CK)，0. 3% (廠家推薦濃度）； 4) 植培靈（Z) :0·0%(□()，2.5ml/L (廠家推薦濃度)。
[0025] 2. 1. 3培養(yǎng)基處理及數(shù)據(jù)統(tǒng)計：全部培養(yǎng)基用滅菌鍋滅菌處理。隨機抽取3瓶20 株觀察株高和生根情況。
[0026] 2. 1. 4試驗結(jié)果 1)C 處理的株高（5.99cm)明顯高于對照（5. 19 cm)、DJ (3.87cm)、Y(3. 58cm)、 Z(3. 65cm)處理。DJ處理的植株高度（3. 87cm)與對照（2. 51cm)相比略高于對照(表1)。
[0027] 2) C處理隨處理濃度加大植株高度逐漸增加；DJ處理的植株高度在45mg/L濃度 范圍內(nèi)隨濃度的加大而增加，超過這個濃度，株高隨濃度加大而降低(表1 )。
[0028] 3)據(jù)觀察，與CK相比，DJ、Y、Z 3個處理的根明顯生長不良，95%以上植株的根為 0-2條，而且較短（0. 3-0. 5cm)。而C處理的根為3-8條，長度為3-5cm，與CK相近。
[0029] 2. L 5第1次試驗結(jié)果總結(jié) 1) 試驗采用的濃度對處理間植株高度的影響差異不明顯； 2) DJ、Y、Z 3個處理的根生長受抑制； 3) 全部試驗沒有污染。
[0030] 根據(jù)第1次試驗結(jié)果，調(diào)整試驗設(shè)計，加大處理間的濃度梯度，在開放條件下接種 霉囷試驗。
[0031] 試驗 2 2. 2. 1試驗日期與地點：2015年2月11日，貴州省生物技術(shù)研究所實驗室。
[0032] 2. 2. 2試驗設(shè)置 1)次氯酸鈉（C):濃度處理為 0· 0% (CK)，0· 01% (C1)，0· 05% (C2)，0· 1% (C3)，0· 5% (C4)， I. 0%(C5);每個處理滅菌接種組培苗5瓶，每瓶15株；開放性接種霉菌，每個濃度接種培養(yǎng) 皿3個，每個接種霉菌菌塊1塊（2-3mm，見圖1 )，對照是不加抑菌劑并在相同條件下開放相 同時間的處理； 2) 多菌靈b (DJ):濃度處理為O mg/L (CK)JOmgA(DJ1), 40mg/L(DJ2)，60mg/L(DJ3), 80mg/L (DJ4)，100mg/L (DJ5)，每瓶10株，每個處理滅菌接種組培苗5瓶，每瓶15株；開放性 接種霉菌，每個濃度接種培養(yǎng)皿3個，每個接種霉菌菌塊1塊（2-3mm，見圖1)，對照是不加 抑菌劑并在相同條件下開放相同時間的處理； 3) 益培?。╕):濃度處理為 0· 0% (CK)，0· 1% (Y1)，0· 2% (Y2)，0· 3% (Y3，廠家推薦濃 度)，0. 4% (Y4)，0. 5% (Y5);每瓶10株，每個處理滅菌接種組培苗5瓶，每瓶15株；開放性接 種霉菌，每個濃度接種培養(yǎng)皿3個，每個接種霉菌菌塊1塊（2-3mm，見圖1)，對照是不加抑 菌劑并在相同條件下開放相同時間的處理； 4) 植培靈（Z):濃度處理為 O.Oml/L (CK)，LSmVL(Z1)，2. OmVL(Z2)，2. 5ml/L (廠家推薦濃度）（Z3)，3. 0ml/L(Z4)，3. 5ml/L (Z5)，每個處理滅菌接種組培苗5瓶，每瓶15 株；開放性接種霉菌，每個濃度接種培養(yǎng)皿3個，每個接種霉菌菌塊1塊（2-3mm，見圖1)，對 照是不加抑菌劑并在相同條件下開放相同時間的處理； 5 )大蒜素（DS):濃度處理為 0% (CK)，lmg/L (DS1)，2mg/L (DS2)，3mg/L (DS3)，4mg/ L (DS4)，5mg/L (DS5)，每個處理滅菌接種組培苗5瓶，每瓶15株；開放性接種霉菌，每個濃 度接種培養(yǎng)皿3個，每個接種霉菌菌塊1塊（2-3mm，見圖1)，對照是不加抑菌劑并在相同條 件下開放相同時間的處理； 2. 2. 3培養(yǎng)基及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 1)接種組培苗處理的培養(yǎng)基全部滅菌鍋滅菌，接種霉菌的培養(yǎng)皿僅將培養(yǎng)基燒開，在 開放條件下(實驗室