一種利用誘導(dǎo)子提高反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根中有效物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，為一種利用誘導(dǎo)子提高反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根中有效物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]東北刺人參(Oplopanax elatus Nakai)又名刺參,五加科刺參屬，多年生落葉灌木，是我國長白山特有的植物資源之一。東北刺人參藥用價值極高，其根、根莖和莖是名貴的中藥材，富含皂苷、多糖、黃酮、揮發(fā)油、蒽醌、脂肪酸等多種藥用成分，可用于治療神經(jīng)衰弱、低血壓、陽萎、精神分裂、糖尿病等疾病，并具有抗真菌、抗抑郁、解熱、鎮(zhèn)痛和抗衰老的作用。近年來又發(fā)現(xiàn)葉中含有的一些成分與根和莖相近，所以葉也具有藥用價值。由于其療效顯著，且無任何毒副作用，在長白山區(qū)被稱作“木本人參”。目前，對東北刺人參化學(xué)成分及藥理作用的研究較多，但臨床應(yīng)用研究則較少，因此開發(fā)及研制東北刺人參高效藥物，對東北刺人參資源的利用具有重要意義。由于其藥用價值很高，人們過度采挖導(dǎo)致其野生資源短缺，人工栽培方面，有性繁殖，結(jié)實率低，移栽成活率低；無性繁殖出現(xiàn)假死現(xiàn)象，且恢復(fù)期生長期長，繁殖材料來源短缺，在栽培過程中易受氣候和化學(xué)農(nóng)藥的影響，產(chǎn)量不能保持穩(wěn)定，具有較大風(fēng)險，因此尋找一種可以替代野生及人工栽培東北刺人參的方法已迫在眉睫，而利用植物組織培養(yǎng)進行中藥資源繁殖并大規(guī)模生產(chǎn)已成為一條有效可行的發(fā)展途徑，植物組織培養(yǎng)包括細(xì)胞培養(yǎng)，組織和器官培養(yǎng)，但藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的弊端之一是有效成分含量不穩(wěn)定，這主要是由于大多數(shù)有效成分均為次生代謝產(chǎn)物，其合成在細(xì)胞階段表現(xiàn)不強而造成，而根培養(yǎng)可以解決這一問題。
[0003]不定根培養(yǎng)的優(yōu)勢在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成能力，根培養(yǎng)中細(xì)胞的高度分化使得次生代謝產(chǎn)物的合成能力明顯提高，同時表現(xiàn)出明顯的代謝穩(wěn)定性和活力穩(wěn)定性，加之與生物反應(yīng)器的結(jié)合利用，使得東北刺人參不定根的大量生產(chǎn)得到了有效的保證，進而為東北刺人參野生資源的保護及開發(fā)提供了一條有效可行的方法。由于生產(chǎn)黃酮及多糖含量高且穩(wěn)定的東北刺人參不定根在藥物開發(fā)中極為重要，近年來，利用誘導(dǎo)子進行目標(biāo)產(chǎn)物調(diào)控及生物合成已得到越來越多的國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，也是大幅度提高培養(yǎng)物中代謝產(chǎn)物的重要方法之一。
[0004]誘導(dǎo)子包括生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子兩大類，它具有專一性、快速性、濃度效應(yīng)、時間效應(yīng)以及協(xié)同效應(yīng)，同一植物對不同誘導(dǎo)子的反應(yīng)不同，因而刺激合成的代謝產(chǎn)物及其含量也有所不同，因此，在實際應(yīng)用中應(yīng)綜合考慮與靈活運用，使誘導(dǎo)子在藥用植物培養(yǎng)過程中發(fā)揮最佳促進作用。本發(fā)明選用三種非生物誘導(dǎo)子(茉莉酸甲酯、水楊酸、普魯蘭多糖)處理反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根，發(fā)現(xiàn)三種誘導(dǎo)子對東北刺人參不定根中黃酮含量均有大幅度提高，茉莉酸甲酯和普魯蘭多糖誘導(dǎo)子對不定根中多糖含量的積累也有明顯促進作用，這對東北刺人參資源的開發(fā)利用有十分重要意義。
[0005]本發(fā)明利用氣球型氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根，當(dāng)不定根生物量達到最大時(培養(yǎng)30?40d)加入三種誘導(dǎo)子，處理10d，發(fā)現(xiàn)這三種誘導(dǎo)子處理后對不定根生物量影響不大，且促進不定根中黃酮的合成，使其含量得到顯著提高；同時，利用茉莉酸甲酯和普魯蘭多糖作為誘導(dǎo)子可以提高東北刺人參不定根中多糖含量及生產(chǎn)量。該方法通過對反應(yīng)器內(nèi)不定根培養(yǎng)可在短時間內(nèi)獲得較高含量的東北刺人參黃酮及多糖，獲得的高效代謝產(chǎn)物東北刺人參不定根對珍稀東北刺人參的資源利用與開發(fā)保護意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種利用誘導(dǎo)子提高反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根中有效物質(zhì)的方法。以反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根為材料，用茉莉酸甲酯、水楊酸及普魯蘭多糖對不定根進行處理，通過對三種誘導(dǎo)子濃度的篩選，制定提高東北刺人參中黃酮及多糖含量的具體方案，為珍稀東北刺人參資源的保護和開發(fā)利用提供一種新方法。
[0007]本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0008]一種利用誘導(dǎo)子提高反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根中有效物質(zhì)的方法。
[0009]①東北刺人參不定根誘導(dǎo)和反應(yīng)器培養(yǎng)
[0010]將東北刺人參無菌苗側(cè)根誘導(dǎo)的不定根進行增殖，增殖獲得的不定根稱取20g(Fff)接種于含有4L液體培養(yǎng)基的5L氣球型氣升式生物反應(yīng)器中，通氣量為300mL/min，溫度為25°C條件下暗培養(yǎng)。
[0011]②誘導(dǎo)子處理
[0012]當(dāng)反應(yīng)器培養(yǎng)30?40d不定根生物量達到最大時(120?150g/L鮮物重)，收獲反應(yīng)器內(nèi)不定根并收集培養(yǎng)液，稱取log不定根接種于含有100mL上述培養(yǎng)基的的三角瓶中，同時添加三種不同濃度的誘導(dǎo)子進行處理，10d后收獲不定根，然后測定其生物量。
[0013]③東北刺人參不定根中黃酮含量及生產(chǎn)量的測定
[0014]將誘導(dǎo)子處理的東北刺人參不定根烘干并研磨成粉末，利用硝酸鋁染色法，通過紫外分光光度計(UV-2600，上海天河環(huán)境技術(shù)有限公司，中國)測定其黃酮含量并計算其生產(chǎn)量，生產(chǎn)量(mg/L)=含量X干物重。
[0015]④東北刺人參不定根中多糖含量及生產(chǎn)量的測定
[0016]將誘導(dǎo)子處理的東北刺人參不定根烘干并研磨成粉末后，利用苯酚硫酸法，通過紫外分光光度計測定多糖含量并計算其生產(chǎn)量。
[0017]本發(fā)明整體考察了不同誘導(dǎo)子及其處理濃度對東北刺人參不定根中黃酮及多糖的作用效果，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化并篩選出了合理的誘導(dǎo)子處理濃度，形成了一套完整的增加?xùn)|北刺人參不定根中黃酮和多糖含量及生產(chǎn)量的途徑。本發(fā)明可顯著提高東北刺人參不定根的黃酮及多糖生產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0018]圖1 a:插頭b:氣泵c:空氣流量計d:過濾膜e:多孔噴嘴(孔徑15ym)f:出氣口*箭頭表示空氣流動方向
[0019]圖2茉莉酸甲酯濃度對東北刺人參不定根中黃酮含量及生產(chǎn)量的影響
[0020]圖3水楊酸濃度對東北刺人參不定根中黃酮含量及生產(chǎn)量的影響
[0021]圖4普魯蘭多糖濃度對東北刺人參不定根中黃酮含量及生產(chǎn)量的影響
[0022]圖5茉莉酸甲酯濃度對東北刺人參不定根中多糖含量及生產(chǎn)量的影響
[0023]圖6水楊酸濃度對東北刺人參不定根中多糖含量及生產(chǎn)量的影響
[0024]圖7普魯蘭多糖濃度對東北刺人參不定根中多糖含量及生產(chǎn)量的影響
【具體實施方式】
[0025](一 )材料與方法
[0026]①東北刺人參不定根誘導(dǎo)及反應(yīng)器培養(yǎng)
[0027]將打破休眠的東北刺人參種子播種于蛭石中，待子葉展開長出新植株后，將植株進行消毒，在無菌條件下接種于含有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(OXh = 90X15mm)中形成根，將側(cè)根切成1cm大小后接入含有25mL培養(yǎng)基(MS+IBA 3.0mg/L+白糖50g/L+倍力凝8g/L，pH5.8)的培養(yǎng)皿中進行不定根的誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)的不定根接種于上述培養(yǎng)基中，每隔25?30d繼代培養(yǎng)一次，然后將繼代培養(yǎng)獲得的不定根稱取20g (Fff)，并切成1cm大小接種于含有4L液體培養(yǎng)基的5L氣球型氣升式生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)基:MS+IBA3mg/L+白糖50g/L，pH 5.8，在通氣量為300mL/min，溫度為25°C條件下暗培養(yǎng)。
[0028]②誘導(dǎo)子處理
[0029]當(dāng)反應(yīng)器培養(yǎng)30?40d不定根生物量達到最大時(120?150g/L鮮物重)，收獲反應(yīng)器內(nèi)不定根并收集培養(yǎng)液，稱取log不定根接種于含有100mL上述培養(yǎng)基的的三角瓶中，同時添加三種不同濃度的誘導(dǎo)子，將茉莉酸甲酯濃度設(shè)定為50、100、150、200和250 μ moL/L ;水楊酸濃度設(shè)定為25、50、75、100和125ymoL/L ;普魯蘭多糖濃度設(shè)定為100、200、300、400和500mg/L。以未加入誘導(dǎo)子為對照。在轉(zhuǎn)速為121r/min的振蕩器(GTCS-2013B，金壇市科析儀器有限公司，中國)上進行暗培養(yǎng)，1