核表面形成一個有凹槽的凝膠層，降溫至4~10°C放置10~30分鐘；然后打開模具 取出珍珠核，再放置入模具II中，使上述制得的球形組織工程支架珍珠核的凹口處對準(zhǔn)注 膠孔，再注入步驟（2)制備的組織工程支架液，以使第一次注膠時留下的凹槽填滿組織工程 支架液，室溫下靜置1~24小時使組織工程支架材料交聯(lián)；取出，將注膠孔處的表面磨平，在 凍結(jié)溫度下冷凍成型，然后放入冷凍干燥機(jī)中真空干燥； 當(dāng)支架制備過程中有加入對細(xì)胞有毒的成分時，則需將有毒成分從支架中洗去； 將珍珠核無菌保存?zhèn)溆谩?br>[0013] 本發(fā)明所述的制備方法，具體如下： (1) 在珍珠核表面粘附一層多聚賴氨酸膜：將打磨好的普通珍珠核高壓滅菌處理，放入 0. 01wt%~0.lwt%的多聚賴氨酸溶液中浸泡10~30分鐘，取出，無菌條件下晾干； (2) 無菌條件下配制組織工程支架液：無菌條件下將膠原蛋白配制成濃度為1. 0%~3. 0 wt%的溶液，待膠原蛋白完全溶解后向其中加2. 5vol%的戊二醛溶液作為交聯(lián)劑，使戊二 醛終濃度為0. 01vol%~0. 05vol%，攪拌均勻； (3) 支架制備：將晾干好的珍珠核放置于模具I中，具體方法為，先將珍珠核放入一個 半球中，然后將另一半球合攏，將步驟⑵制備的膠原蛋白液灌注入模具，振蕩搖勻10分鐘， 室溫下靜置6~24小時使膠原蛋白交聯(lián)，降溫至4~10°C處理10~30分鐘使珍珠核脫模，然后 打開模具取出珍珠核，得到有4道凹槽的組織工程支架珍珠核；再將其注膠孔處的支架材 料挖去少量，形成一個連通4道凹槽的凹口，放置入模具II中，使凹口處對準(zhǔn)注膠孔，再注 入步驟⑵制備的膠原蛋白溶液，使第一次注膠時留下的凹槽填滿膠原蛋白溶液，室溫下靜 置2~12小時使膠原蛋白交聯(lián)；取出，將注膠孔處的表面打磨平，在一 20°C條件下放置1~6 小時冷凍成型，然后放入冷凍干燥機(jī)中真空干燥1~24小時，真空度為12~20Pa，凍干溫度 為一 20~ - 70Γ; (4) 將珍珠核浸泡于蒸餾水中洗去殘留的戊二醛，然后真空干燥將珍珠核去除水分后 無菌包裝備用。
[0014] 所述制備珍珠核支架層所用的模具：模具I由兩個結(jié)構(gòu)一樣的中空半球構(gòu)成，使 用時將2個半球合攏即成為一個完整的球體；以球體的注膠孔所處位置為南極，其對側(cè)為 北極，每個半球的內(nèi)側(cè)面有3條南北極方向排列的條狀突起的棱，其中的2條棱分別位于半 球的兩側(cè)邊緣，另一條棱位于半球中間，3條棱的末端在球的南北極處相交，在南極端相交 處的棱切除部分形成凹口作為注膠孔；棱的作用在于支撐珍珠核，使珍珠核放入模具后珍 珠核外的空間的高度就是組織工程支架的厚度；兩個半球合攏成一個球體，棱一端的球面 是封閉的，另一端的球面處留出一小孔作為注膠孔用于灌注組織工程支架材料；模具I用 于完成珍珠核組織支架制備的第一步，得到表面有凹槽的組織工程支架珍珠核；模具II由 兩個中空的半球組成，其內(nèi)側(cè)表面無突起，半球內(nèi)徑為珍珠核直徑和模具I棱高度的2倍 之和，兩半球合攏后留有一注膠孔用于灌注組織工程支架材料，利用模具II完成凹槽的填 補(bǔ)，最后得到支架層厚度相同的球形組織工程支架珍珠核。
[0015] 所述的膠原蛋白采用來自于脊椎動物的膠原蛋白或來自于無脊椎動物的膠原蛋 白或經(jīng)過基因工程加工改造過的膠原蛋白。
[0016] 具體地說，本發(fā)明將珍珠核表面處理成適合組織工程支架材料粘附的狀態(tài)。優(yōu)選 的是在珍珠核表面粘附一層多聚賴氨酸膜，或膠原蛋白膜。此步驟非必須。
[0017] 配制組織工程支架液：組織工程支架材料可采用生物可降解天然高分子材料，如 膠原蛋白、明膠、纖維蛋白、瓊脂糖、殼聚糖、透明質(zhì)酸等或它們與其他材料組成的復(fù)合物； 也可采用可降解的合成高分子材料，如聚乳酸（PLA)、聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共 聚物（PLGA)、聚己內(nèi)酯（PCL)、聚乙烯醇（PVA)等。對于珍珠的培育來說，組織工程支架 不需要有很高的機(jī)械強(qiáng)度，但需要在體內(nèi)較快降解，優(yōu)選的支架材料是生物體內(nèi)可較快降 解的天然高分子材料，如膠原蛋白、明膠、透明質(zhì)酸等及其與其他生物可降解高分子材料組 成的復(fù)合物(例如膠原蛋白與殼聚糖的復(fù)合物）等，最優(yōu)選的是膠原蛋白和明膠，其中優(yōu)選 的膠原蛋白和明膠濃度為1. 〇wt%~3.Owt% ;以及生物體內(nèi)易于降解的合成高分子材料，例 如聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA)等。為了維持組織工程支架在液體環(huán) 境中的相對穩(wěn)定性，有時需要對天然高分子材料進(jìn)行交聯(lián)處理，有必要時加入交聯(lián)劑使支 架材料交聯(lián)。對于膠原蛋白、明膠及其復(fù)合物的交聯(lián)來說，適宜的化學(xué)交聯(lián)劑為戊二醛、原 花青素、京尼平、碳化二亞胺等，優(yōu)選的是戊二醛、原花青素，或采用紫外輻射、重度脫水等 物理處理方法。對于以戊二醛為交聯(lián)劑來說，濃度過低不利于交聯(lián)，濃度過高會對細(xì)胞產(chǎn)生 毒性，優(yōu)選的戊二醛終濃度在0. 〇l~〇. 2v〇l%之間。在無菌條件下將支架材料溶于相應(yīng)溶劑 中，加入交聯(lián)劑，混勻。為了使細(xì)胞在支架中更好的生長分裂，也可在支架液中加入適量的 有利于細(xì)胞生長分裂的細(xì)胞因子，或蚌血清，使這些成分交聯(lián)在支架中。
[0018] 制備組織工程支架：將組織工程支架材料包裹在步驟1處理好的珍珠核外面，優(yōu) 選的是將組織工程支架材料厚度均勻地包裹在步驟1處理好的珍珠核表面，使支架層各部 位厚度基本一致；支架厚度一般為〇. 2~2. 0_，優(yōu)選的是0. 6~1. 2 _。包裹后靜置一段時間 使其呈凝膠狀態(tài)，優(yōu)選的靜置時間為1~24小時。然后置于凍結(jié)溫度下成型，對于以水作為 溶劑的組織支架材料來說，優(yōu)選的凍結(jié)溫度在〇~ -20 °C之間。再通過真空冷凍干燥處理 脫去溶劑，形成表面具有多孔三維網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)的組織工程支架珍珠核。
[0019] 一種將組織工程支架材料包裹到珍珠核表面的方案是： 1.制備一種模具，其制備和使用方法為：模具由兩個結(jié)構(gòu)相同的中半球構(gòu)成，每個半 球的內(nèi)側(cè)面伸出3根與半球平面垂直的細(xì)柱，彼此相隔120°，細(xì)柱的作用在于支撐珍珠 核，目的在于使放入模具后的珍珠核周圍的空間高度一樣，從而使組織工程支架厚度盡量 均勻，與半球的平面垂直可使脫模取出珍珠核時不損傷組織工程支架層。細(xì)柱的長度在 0. 02~2_左右，優(yōu)選的是0. 8~1. 2_。兩個半球合攏后在球面的一端留有一小孔用于灌注 組織工程支架溶液。脫模時支架中會留下支撐柱造成的小孔，但由于支架材料在蚌體內(nèi)會 逐漸降解，細(xì)胞也會自動迀移，這些小孔不會影響將來植核后外套膜表皮細(xì)胞在珍珠核周 圍的均勻分布。
[0020] 2.將方法一處理過的普通珍珠核放置于模具中，將方法二制備的組織工程支架 液灌注入模具，振蕩搖勻10~30分鐘，室溫下靜置1~24小時使組織工程支架材料交聯(lián)，在珍 珠核表面形成一個凝膠層，降溫至4~10°C處理10分鐘左右，使珍珠核脫模，取出珍珠核，在 凍結(jié)溫度下冷凍成型，然后放入冷凍干燥機(jī)中真空干燥去除溶劑。
[0021] -種優(yōu)選的將組織工程支架材料厚度均勻地包裹到珍珠核表面的方案是： 制備珍珠核支架層所用的模具：模具I由兩個結(jié)構(gòu)一樣的中空半球構(gòu)成，使用時將2 個半球合攏即成為一個完整的球體。每個半球的內(nèi)側(cè)面有3條南北極（以注膠孔所處位置 為南極，其對側(cè)為北極）方向排列的條狀突起（以下簡稱棱)，其中的2條棱分別位于半球 的兩側(cè)邊緣，另一條棱位于半球中間，優(yōu)選的是位于半球的正中間，棱的長度為球體周長的 1/2,因此3條棱的末端在球的南北極處相交，南極端相交處的棱切除部分形成凹口作為注 膠孔；棱的高度〇· 〇2~2mm左右，優(yōu)選的是1mm左右，中間棱寬度2~4mm，邊緣棱寬度為中間 棱寬度的一半；棱的作用在于支撐珍珠核，使珍珠核放入模具后珍珠核外的空間高度一致， 其高度就是組織工程支架的厚度。使用時，先將珍珠核放入一個半球中，然后將另一半球合 攏，兩個半球的邊緣棱在兩半球合攏后其側(cè)面拼接在一起，合為一條寬度與中間棱寬度一 樣的棱，兩個半球合攏成一個球體，棱一端的球面是封閉的，另一端球面處留出一小孔作為 注膠孔用于灌注組織工程支架材料，此端的棱略短，留出孔道使支架材料能同時灌注到模 具中被棱隔開的4個空間中。模具I用于完成珍珠核組織支架制備的第一步，得到表面有 凹槽的組織支架珍珠核。模具II由兩個中空的半球組成，其內(nèi)側(cè)表面無突起結(jié)構(gòu)，半球內(nèi)徑 為珍珠核直徑和模具I棱高度的2倍之和，兩半球合攏后留有一注膠孔用于灌注組織工程 支架材料，利用模具II完成凹槽的填補(bǔ)，最后得到支架層厚度相同的球形組織工程支架珍 珠核。
[0022] 支架制備：先將方法一處理過的普通珍珠核放置于模具I中，將方法二制備的組 織工程支架液灌注入模具I，振蕩搖勻10~30分鐘，室溫下靜置1~24小時使組織工程支架 材料交聯(lián)，在珍珠核表面形成一個有凹槽的凝膠層，降溫至4~10°C10分鐘左右使珍珠核脫 模；然后打開模具取出珍珠