一種骨組織工程支架材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程材料，特別涉及一種骨組織工程支架材料及其制備方法，屬于高新材料制造技術(shù)領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]骨缺損的治療一直以來(lái)是骨科臨床上的難題之一。全球每年骨折和骨缺損的患者數(shù)以千萬(wàn)計(jì)，傳統(tǒng)的治療方法主要有自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨移植，然而這些方法都存在較大的缺陷。自體骨移植作為骨移植技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，存在造成新的病損、來(lái)源有限、引起骨區(qū)感染、疼痛、手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)等缺陷；同種異體骨移植存在易被人體吸收，易感染，免疫排斥反應(yīng)嚴(yán)重等；人工骨移植存在來(lái)源有限，成骨困難，原料孔隙率變異大等缺陷。由于現(xiàn)行骨缺損修復(fù)方法的種種缺陷，目前研宄者們將修復(fù)骨缺損目標(biāo)轉(zhuǎn)向骨組織工程。
[0004]骨組織工程是采用組織工程學(xué)的原理和方法，研制具有修復(fù)骨缺損能力的骨替代物的一門科學(xué)，基本原理是在體外構(gòu)筑支架材料-種子細(xì)胞-生長(zhǎng)因子復(fù)合物，然后移植到骨缺損處，經(jīng)過(guò)材料的吸收和組織的增生，實(shí)現(xiàn)自身骨組織代替組織工程骨，最終實(shí)現(xiàn)骨的形態(tài)和功能上的修復(fù)。骨組織工程的研宄和應(yīng)用將會(huì)克服現(xiàn)有骨缺損修復(fù)中自體骨移植來(lái)源少、異體骨移植存在排斥反應(yīng)的問(wèn)題和不足。因此通過(guò)研宄骨組織工程來(lái)修復(fù)骨缺損，不僅對(duì)我國(guó)骨治療領(lǐng)域具有重要意義，而且對(duì)我國(guó)骨組織工程的發(fā)展具有推動(dòng)作用。
[0005]骨組織工程研宄的中心環(huán)節(jié)是研制能夠作為細(xì)胞移植與引導(dǎo)新骨生長(zhǎng)的支架材料，以作為細(xì)胞外基質(zhì)的替代物。目前支架材料主要有人工合成支架材料和天然支架材料。人工合成支架材料即用物理化學(xué)的方法合成的細(xì)胞外基質(zhì)替代物，主要的無(wú)機(jī)材料有羥基磷灰石、磷酸三鈣；有機(jī)高分子材料有聚乳酸、聚羥基乙酸等。Zhao等采用仿生礦化的方法，使PLGA網(wǎng)孔內(nèi)壁沉積磷灰石礦化層，該法顯著提高了 PLGA對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的早期黏附，或能在臨床上縮短患者的治療時(shí)間。周立偉等將羥基磷灰石與聚酰胺(n-HA/PA66)復(fù)合成人工骨，并成功修復(fù)兔顱骨的缺損，試驗(yàn)中復(fù)合材料表現(xiàn)了良好的生物相容性，未對(duì)顱內(nèi)代謝產(chǎn)生不良影響，植入12周后材料和顱骨之間界線模糊，顯示復(fù)合材料的骨引導(dǎo)作用。
[0006]天然支架材料主要有天然高分子材料(殼聚糖、甲殼素、透明質(zhì)酸、膠原等)和天然無(wú)機(jī)材料(天然珊瑚、人或動(dòng)物的脫蛋白骨等)。曹罡等用珊瑚羥基磷灰石體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在體外細(xì)胞能繼續(xù)增殖并表達(dá)成骨活性，Amaral等將鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞種植到殼聚糖膜上進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可以大量黏附、擴(kuò)增并有成骨傾向。Liu等用珊瑚支架復(fù)合自體脂肪干細(xì)胞，成功修復(fù)犬眶壁的重度全層缺損。但是CHA機(jī)械性能差，不能用于承重部位，難以塑形，植入后有一定體積喪失，大塊植骨時(shí)吸收速度過(guò)慢，降解速度難以調(diào)控等缺陷也不能忽視。
[0007]可以說(shuō)迄今為止開發(fā)的各類支架都存在著問(wèn)題。人工合成的支架材料其最大優(yōu)點(diǎn)是品種多，可選擇范圍廣，生物降解速度可調(diào)。此外，合成材料還有力學(xué)性能和加工性能好，價(jià)格便宜，重現(xiàn)性好，利于大規(guī)模生產(chǎn)。缺點(diǎn)是生物相容性和細(xì)胞的親和性比天然材料差。
[0008]天然支架材料一般具有細(xì)胞信號(hào)識(shí)別能力，能促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖和分化，大都無(wú)毒副作用，具有良好的生物相容性及良好的生物降解性，顯示出人工合成材料無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。但其加工性、重現(xiàn)性、降解速度可調(diào)性不甚理想。部分天然-合成材料克服了一些問(wèn)題，但是在成型、降解方面存在的問(wèn)題也困擾著組織工程研宄人員。特別如人體軟組織用的支架，對(duì)隨模具成型性、強(qiáng)力、伸長(zhǎng)度、彈性、柔韌性，以及與細(xì)胞生長(zhǎng)相匹配的降解性能等要求甚高。
[0009]因此，開發(fā)一種具有誘導(dǎo)骨細(xì)胞長(zhǎng)入、降解也可調(diào)控、具有優(yōu)秀力學(xué)性能且生物相容性的骨組織組織工程支架是亟需解決的問(wèn)題。
[0010]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種骨組織工程支架材料，該組織工程支架材料具有力學(xué)性能優(yōu)異，生物相容性好，與骨細(xì)胞生長(zhǎng)性匹配的降解性，成型性好，以及能誘導(dǎo)骨細(xì)胞長(zhǎng)入材料的優(yōu)點(diǎn)，該支架材料加快骨細(xì)胞長(zhǎng)入的生理過(guò)程，具有促骨生長(zhǎng)性，能縮短病人的康復(fù)時(shí)間，加快臨床治療的過(guò)程，降低病人的痛苦。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種所述的骨組織工程支架材料的制備方法，該制備方法具有反應(yīng)條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，適于放大生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
[0013]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采用了以下技術(shù)方案:
一種骨組織工程支架材料制備方法，步驟如下，
O溶液的準(zhǔn)備:
將絲素蛋白粉末溶解于去離子水中，配成濃度為8-15mg/ml的絲素蛋白溶液；
將磷酸溶液用去離子水稀釋，配成濃度為0.01-0.lmol/L的磷酸溶液；
將氫氧化鈣粉末溶于去離子水中，配成濃度為0.01-0.05mol/L的氫氧化鈣溶液； 將絲膠蛋白粉末溶解于去離子水中，配成濃度為4%-8% (W/V)的絲膠蛋白溶液； 將殼聚糖溶解于稀酸溶液中，配成濃度為2-3%(W/V)的殼聚糖溶液；
將甘油磷酸鈉溶解于去離子水中，配成濃度為50-60% (W/V)的甘油磷酸鈉溶液；
2)制備絲素/羥基磷灰石粉末:將第I)步準(zhǔn)備的絲素蛋白溶液與磷酸溶液均勻混合；然后在60-80°C恒溫水浴中，將絲素蛋白與磷酸的混合液以40-60滴/min的速度緩慢的滴入到氫氧化鈣溶液中，加完后，以150-220r/min攪拌2_3h，攪拌結(jié)束后調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH值為9-10，在反應(yīng)溫度水浴中沉化24-48h，真空抽濾，用去離子水漂洗至少三次，即得到絲素/羥基磷灰石粉末；其中，絲素蛋白溶液與磷酸溶液、氫氧化鈣溶液的體積比為1: (1.5-2):(10-15)；
3)將步驟2)中得到的絲素/羥基磷灰石粉末添加到步驟I)準(zhǔn)備的絲膠蛋白溶液中攪拌混合均勻，得到的絲膠/(絲素/羥基磷灰石)懸濁液，其中絲膠蛋白與絲素/羥基磷灰石粉末的質(zhì)量比為1:0.5-1 ；
4)將步驟3)得到的絲膠/(絲素/羥基磷灰石)懸濁液，緩慢地加入到殼聚糖溶液中，攪拌均勻，調(diào)整體系的溫度為1-1o°c，再逐滴加入步驟I)準(zhǔn)備的甘油磷酸鈉溶液攪拌30min，得到混合溶液；其中絲膠/(絲素/羥基磷灰石)懸濁液、殼聚糖溶液、甘油磷酸鈉溶液的體積比為(0.67-1): (5-6):1;
5)將第4)步得到的混合溶液倒入模具中，將模具放入37-38?恒溫水浴中，使混合溶液完成溶-凝膠轉(zhuǎn)化，將凝膠材料先放在-10—20°C的溫度下預(yù)冷凍2-5h，解凍l-3h，然后轉(zhuǎn)到-70—80°C的冰箱中冷凍6-10h，然后放入冷凍干燥機(jī)干燥24h以上，真空度控制在10-50 Kpa，即得骨組織工程支架材料。
[0014]步驟I)中所述絲素蛋白粉末的制備方法為:采用鹽溶酶解工藝，將廢次繭殼或繭絲依次經(jīng)醚類、醇類有機(jī)溶劑浸泡以除去其中的蠟質(zhì)物、碳水化合物及灰分雜質(zhì)，再經(jīng)水煮沸脫膠鹽溶后冷凍干燥即得到微米級(jí)絲素蛋白粉末。
[0015]步驟I)中絲膠蛋白粉末的制備方法為:將繭殼經(jīng)醚類、醇類依次分別浸泡24-48h，用蒸餾水洗凈、干燥，以除去蠟質(zhì)和部分有機(jī)物和雜質(zhì)；再將繭殼用蒸餾水煮沸至少6h，將絲膠蛋白溶于蒸餾水中，抽濾得到絲膠蛋白溶液，然后將絲膠蛋白溶液濃縮、冷凍干燥即得絲膠蛋白粉末。
[0016]步驟I)中的稀酸為稀鹽酸或稀醋酸，濃度為0.05-0.2mol/Lo
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)根據(jù)仿生原理將羥基磷灰石沉聚于絲素蛋白上，合成了絲素/羥基磷灰石，將絲素/羥基磷灰石引入到絲膠/殼聚糖/甘油磷酸鈉凝膠體系中，制備出骨組織工程支架材料，同時(shí)賦予該支架材料誘導(dǎo)骨細(xì)胞長(zhǎng)入的功能，該支架材料的骨誘導(dǎo)性源于仿生人體中膠原/羥基磷灰石，因此誘骨生長(zhǎng)性更優(yōu)。
[0018](2)本發(fā)明所得的絲膠蛋白(絲素/羥基磷灰石)/殼聚糖/甘油磷酸鈉組織工程支架材料，具備良好的生物相容性，降解可調(diào)控性及較好的成型性，可以作為用于治療骨缺損的組織工程支架材料。
[0019](3)本發(fā)明所得的絲膠蛋白(絲素/羥基磷灰石)/殼聚糖/甘油磷酸鈉組織工程支架材料在任意模具中從溶液轉(zhuǎn)化成凝膠，經(jīng)預(yù)冷凍、解凍、再冷凍，以及最終的冷凍干燥，在這個(gè)過(guò)程中，形成力學(xué)性能優(yōu)異的組織工程支架材料。并且其力學(xué)性能可通過(guò)調(diào)整加入絲素/羥基磷灰石的量和絲膠蛋白溶液、殼聚糖溶液和甘油磷酸鈉溶液之間的比例進(jìn)行調(diào)控。
[0020](4)本發(fā)明的制備方法反應(yīng)條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，原料成本低廉，適于放大生產(chǎn)；而且可根據(jù)需要調(diào)節(jié)物料配比從而調(diào)解材料力學(xué)性能和降解時(shí)間等，得到滿足相應(yīng)性能的組織工程支架材料。
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【附圖說(shuō)明】
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