：NaCl2g，蛋白胨2g，酵母膏l(xiāng)g，蒸餾水200mL。溶解后用1MNaOH 調(diào)節(jié)pH為7. 0,高壓蒸汽滅菌。
[0024] 3.藥材： 六味地黃丸，十全大補(bǔ)湯，七寶美髯丹，還少丹，生脈散，秦椒丸，天麻丸，二陳丸均購自 蘭州惠仁堂大藥房。
[0025] 4.儀器： 高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠） 單人單面超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠） 生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠） 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司） 連續(xù)變倍體視顯微鏡（上海一恒科學(xué)儀器有限公司） 離心機(jī)（CT15E，日立） 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司） 實(shí)施例1試劑盒的裝配 本發(fā)明所述的一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，該試劑盒包括以下試劑： ① 、試劑A:秀麗隱桿線蟲； ② 、試劑B:NGM培養(yǎng)基； ③ 、試劑C:大腸桿菌0P50 ; ④ 、試劑D:氟脲苷； ⑤ 、試劑E:無菌水。
[0026] 其中，所述試劑C為含有大腸桿菌0P50活菌的凍干粉或菌液。
[0027] 所述秀麗隱桿線蟲的濃度為100條/20ul，大腸桿菌0P50的濃度為10mg/ml，氟脲 苷的濃度為50μM,無菌水的體積為50-100μL。
[0028] 所述試劑盒還含有秀麗隱桿線蟲專用培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿皿蓋為環(huán)形鏤空形狀，鏤空 部位覆蓋有封口膜，培養(yǎng)皿中加有NGM培養(yǎng)基。
[0029] 將以上試劑和秀麗隱桿線蟲專用培養(yǎng)皿分裝于合適的容器中，放置到外包試劑盒 中。
[0030] 本實(shí)驗(yàn)中，選取正常株系秀麗隱桿線蟲Ν2,用于篩選對正常株系作用的抗衰老藥 物，選取早衰模型株系秀麗隱桿線蟲ΤΚ22,用于篩選對早衰模型株系作用的抗衰老藥物。
[0031] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體研究內(nèi)容，選用類似株系，而不局限于本發(fā)明實(shí)施例 中所述的秀麗隱桿線蟲株系。
[0032] 實(shí)施例2秀麗隱桿線蟲的同步化 秀麗隱桿線蟲同步化的步驟如下：用M9緩沖液將平板上的秀麗隱桿線蟲沖下來，將 沖洗液吸入離心管；4000rpm/min離心3min，去除上清；加入裂解液，終濃度：3. 2%NaCIO 和1MNaOH;在潤旋儀上震蕩7min，使秀麗隱桿線蟲的蟲體破裂釋放卵；4000rpm/min離心 3min，去除上清，收集沉淀獲得大量的秀麗隱桿線蟲卵；M9緩沖液沖洗兩次，加入lmlM9緩 沖液，置于20°C培養(yǎng)箱中孵化48小時(shí)。
[0033] 實(shí)施例3試劑盒的使用 (1) 將含有待測藥物的溶液與NGM培養(yǎng)基混勻，倒入秀麗隱桿線蟲專用培養(yǎng)皿中，制板 待用，NGM培養(yǎng)基中含有濃度為50μΜ的氟脲苷，其中，空白組使用等量無菌水替換含有待 測藥物的溶液； (2) 將L4期同步化的秀麗隱桿線蟲，用鉬絲挑針轉(zhuǎn)移到各藥物組和空白組的秀麗隱桿 線蟲專用培養(yǎng)皿中，藥物組為含有不同濃度待測藥物的NGM培養(yǎng)基，每個(gè)藥物濃度三個(gè)平 行，每平行板25~30條秀麗隱桿線蟲，置于20°C培養(yǎng)，每天觀察并計(jì)數(shù)秀麗隱桿線蟲存活 數(shù)和死亡數(shù)； (3) -周后培養(yǎng)皿開始干燥，秀麗隱桿線蟲開始出現(xiàn)皮膚略顯皺縮、狀態(tài)不活躍、行動(dòng) 略緩，菌斑鏡下觀察已接近無菌等缺水、缺大腸桿菌0Ρ50表現(xiàn)，此時(shí)在無菌超凈臺(tái)中打開 皿蓋，用移液器加入定量無菌水50-100μL和大腸桿菌0Ρ50 20-50μL，10mg/mL;加完后靜 置，待水和菌皆滲入NGM培養(yǎng)基中將培養(yǎng)基正置，用封口膜封皿，重置20°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)； 約一周又出現(xiàn)干燥和缺菌狀態(tài)，重復(fù)上述補(bǔ)充水分和菌的操作，補(bǔ)充無菌水需持續(xù)到整個(gè) 壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)束，而補(bǔ)充大腸桿菌0P50視具體情況，25-30條秀麗隱桿線蟲約需補(bǔ)充2次； (4) 用挑針輕觸，秀麗隱桿線蟲無反應(yīng)則判定為死亡；爬到培養(yǎng)皿邊緣或皿蓋干死、鉆 到瓊脂里面的秀麗隱桿線蟲從實(shí)驗(yàn)中排除； (5) 采用相關(guān)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析，計(jì)算出秀麗隱桿線蟲的平均壽命，平均 壽命顯著高于空白組則證明藥物具有抗衰老活性，平均壽命低于或等于空白組則證藥物不 具有抗衰老活性，以此評價(jià)藥物的抗衰老活性。
[0034] 實(shí)施例4試劑盒效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 本試劑盒對所選傳統(tǒng)中藥復(fù)方進(jìn)行了抗衰老藥效篩選的效果驗(yàn)證。
[0035] 實(shí)驗(yàn)步驟： 1.含有待測藥物溶液的制備 六味地黃丸，十全大補(bǔ)湯，七寶美髯丹，還少丹，生脈散，秦椒丸，天麻丸，二陳丸 將上述中藥用無菌水溶解，濾去雜質(zhì)，將濾液稀釋至各濃度梯度待用。本領(lǐng)域研究人員 可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，自行調(diào)整濃度范圍。
[0036] 2.中藥復(fù)方的壽命分析實(shí)驗(yàn) 具體實(shí)驗(yàn)步驟參照實(shí)施例3,壽命分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。
[0037] 表1所選中藥復(fù)方對早衰模型株系秀麗隱桿線蟲TK22壽命的影響
表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所篩選的八個(gè)中藥復(fù)方對早衰模型株系秀麗隱桿線蟲TK22平 均壽命的影響，相對于空白組，生脈散延壽41.0%，天麻丸延壽26.0%，六味地黃丸延壽 23. 3%，秦椒丸延壽18. 6%，七寶美髯丹延壽15. 8%，十全大補(bǔ)湯延壽13. 1%，還少丹延壽 10. 4 %，具有顯著性差異（P〈0. 05)。
[0038] 中藥復(fù)方處理正常株系秀麗隱桿線蟲N2的壽命分析實(shí)驗(yàn)中選取的藥物濃度是表 1實(shí)驗(yàn)結(jié)果中具有最佳延長早衰模型株系秀麗隱桿線蟲TK22壽命的濃度。表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，相對于空白組，生脈散延壽47. 3%、還少丹延壽38. 3%、二陳丸延壽21. 8%、十全大補(bǔ)湯 延壽14. 5%、六味地黃丸延壽12. 7%，具有顯著性差異(/^0. 05)。
[0039] 由表1和表2的數(shù)據(jù)結(jié)果可以得出，使用本發(fā)明公開的試劑盒對中藥復(fù)方進(jìn)行檢 測，其抗衰老效果的預(yù)計(jì)結(jié)果與古方結(jié)論一致。由此證明本發(fā)明的試劑盒可以被用于篩選 抗衰老藥物，且結(jié)果準(zhǔn)確，使用方法簡便，易于掌握。
[0040] 綜上所述，本發(fā)明所述篩選抗衰老藥物的試劑盒能夠用于篩選抗衰老藥物。此外， 該試劑盒還省去了秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)過程中因?yàn)镹GM培養(yǎng)基損耗帶來的轉(zhuǎn)板過程，避免因 為頻繁轉(zhuǎn)板使秀麗隱桿線蟲受到機(jī)械損傷造成非自然死亡，進(jìn)而影響壽命分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 的問題，減少培養(yǎng)過程大腸桿菌0P50和無菌水的添加頻率，簡化培養(yǎng)過程，節(jié)約成本，方便 操作，適合在篩選抗衰老藥物領(lǐng)域大規(guī)模推廣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括以下試劑： ① 、試劑A:秀麗隱桿線蟲； ② 、試劑B:NGM培養(yǎng)基； ③ 、試劑C:大腸桿菌0P50 ; ④ 、試劑D:氟脲苷； ⑤ 、試劑E:無菌水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，其特征在于，所述秀麗隱桿 線蟲的濃度為100條/20ul，大腸桿菌0P50的濃度為10mg/ml，氟脲苷的濃度為50μM，無菌 水的體積為50-100μL。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，其特征在于，所述秀麗隱 桿線蟲為同步化線蟲，秀麗隱桿線蟲同步化的步驟如下：用Μ9緩沖液將平板上的秀麗隱 桿線蟲沖下來，將沖洗液吸入離心管；4000rpm/min離心3min，去除上清；加入裂解液，終 濃度：3. 2%NaCIO和1MNaOH;在渦旋儀上震蕩7min，使秀麗隱桿線蟲的蟲體破裂釋放卵； 4000rpm/min離心3min，去除上清，收集沉淀獲得大量的秀麗隱桿線蟲卵；M9緩沖液沖洗兩 次，加入lmlM9緩沖液，置于20°C培養(yǎng)箱中孵化48小時(shí)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還 含有秀麗隱桿線蟲專用培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)皿皿蓋為環(huán)形鏤空形狀，鏤空部位覆蓋有封口膜，培 養(yǎng)皿中加有NGM培養(yǎng)基。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，其特征在于：所述試劑C為 含有大腸桿菌0P50活菌的凍干粉或菌液。6. -種篩選抗衰老藥物的試劑盒的使用方法，其特征在于，如權(quán)利要求1所述的試劑 盒的使用方法如下： (1) 將含有待測藥物的溶液與NGM培養(yǎng)基混勻，倒入秀麗隱桿線蟲專用培養(yǎng)皿中，制板 待用，NGM培養(yǎng)基中含有濃度為50μΜ的氟脲苷，其中，空白組使用等量無菌水替換含有待 測藥物的溶液； (2) 將L4期同步化的秀麗隱桿線蟲，用鉬絲挑針轉(zhuǎn)移到各藥物組和空白組的秀麗隱桿 線蟲專用培養(yǎng)皿中，藥物組為含有不同濃度待測藥物的NGM培養(yǎng)基，每個(gè)藥物濃度三個(gè)平 行，每平行板25~30條秀麗隱桿線蟲，置于20°C培養(yǎng)，每天觀察并計(jì)數(shù)秀麗隱桿線蟲存活 數(shù)和死亡數(shù)； (3) -周后培養(yǎng)皿開始干燥，秀麗隱桿線蟲開始出現(xiàn)皮膚略顯皺縮、狀態(tài)不活躍、行動(dòng) 略緩，菌斑鏡下觀察已接近無菌等缺水、缺大腸桿菌0Ρ50表現(xiàn)，此時(shí)在無菌超凈臺(tái)中打開 皿蓋，用移液器加入定量無菌水50-100μL和大腸桿菌0Ρ50 20-50μL，10mg/mL;加完后靜 置，待水和菌皆滲入NGM培養(yǎng)基中將培養(yǎng)基正置，用封口膜封皿，重置20°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)； 約一周又出現(xiàn)干燥和缺菌狀態(tài)，重復(fù)上述補(bǔ)充水分和菌的操作，補(bǔ)充無菌水需持續(xù)到整個(gè) 壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)束，而補(bǔ)充大腸桿菌0P50視具體情況，25-30條秀麗隱桿線蟲約需補(bǔ)充2次； (4) 用挑針輕觸，秀麗隱桿線蟲無反應(yīng)則判定為死亡；爬到培養(yǎng)皿邊緣或皿蓋干死、鉆 到瓊脂里面的秀麗隱桿線蟲從實(shí)驗(yàn)中排除； (5) 采用相關(guān)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析，計(jì)算出秀麗隱桿線蟲的平均壽命，平均 壽命顯著高于空白組則證明藥物具有抗衰老活性，平均壽命低于或等于空白組則證藥物不 具有抗衰老活性，以此評價(jià)藥物的抗衰老活性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種篩選抗衰老藥物的試劑盒及其使用方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的篩選抗衰老藥物的試劑盒包括秀麗隱桿線蟲、NGM培養(yǎng)基、大腸桿菌OP50、氟脲苷、無菌水，能夠用于篩選抗衰老藥物。此外，本發(fā)明使用特殊結(jié)構(gòu)的秀麗隱桿線蟲專用培養(yǎng)皿，省去了秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)過程中因?yàn)镹GM培養(yǎng)基損耗帶來的轉(zhuǎn)板過程，避免因?yàn)轭l繁轉(zhuǎn)板使秀麗隱桿線蟲受到機(jī)械損傷造成非自然死亡，進(jìn)而影響壽命分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問題。同時(shí)，減少培養(yǎng)過程中大腸桿菌OP50和無菌水的添加頻率，簡化培養(yǎng)過程，節(jié)約成本，方便操作，適合在篩選抗衰老藥物的領(lǐng)域大規(guī)模推廣。
【IPC分類】A01K67/033
【公開號】CN105309387
【申請?zhí)枴緾N201410244083
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】蘭州紅菌生物技術(shù)有限責(zé)任公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年6月4日