一種印楝愈傷組織誘導(dǎo)不定根的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物的不定根組織培養(yǎng)及生產(chǎn)方法，特別是涉及一種印楝愈傷組 織不定根的誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 印楝屬于楝科楝屬，主要分布在印巴次大陸干旱地區(qū)的一種熱帶植物，可作為重 要的植物源農(nóng)藥樹(shù)種。從印楝中提取到的活性成分具有抑菌殺毒、抗腫瘤、抗癌、避孕、抗衰 老等特性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品以及生態(tài)環(huán)境改良等多種領(lǐng)域。印楝素是其主 要活性物質(zhì)，存在于根、莖、葉和種子等各個(gè)部位，種子中含量最高，以其為主要成分制成的 農(nóng)藥是目前藥效最高，效果最好的產(chǎn)品，具有人畜無(wú)害、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)。但 是，印楝種子為一年生且產(chǎn)籽低，不同地區(qū)不同樹(shù)的種子中印楝素含量不同，收集過(guò)程中損 失較大，化學(xué)合成也不經(jīng)濟(jì)，不能夠滿足工農(nóng)業(yè)日益增長(zhǎng)的需求。
[0003] 近年來(lái)，用農(nóng)桿菌感染印楝外植體產(chǎn)生的發(fā)根生長(zhǎng)迅速，其印楝素的含量比自然 生長(zhǎng)的印楝種子中高出很多倍，且在誘導(dǎo)的過(guò)程中涉及到外源基因的插入，在使用的過(guò)程 中對(duì)于害蟲的抗藥性存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 目前，關(guān)于印楝愈傷組織誘導(dǎo)不定根的文獻(xiàn)報(bào)道極少，因此，有必要提供一種簡(jiǎn)單 新型的印楝愈傷誘導(dǎo)不定根的培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用印楝愈傷組織誘導(dǎo)不定根的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概括如下：
[0007] -種印楝愈傷組織誘導(dǎo)不定根的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)印楝愈傷組織的誘導(dǎo)：采集印楝葉滅菌后，切成小片段接種于固體培養(yǎng)基上， 在無(wú)菌、溫度為25-27Γ及黑暗條件下培養(yǎng)3-5周，得到愈傷組織，并繼代培養(yǎng)3-5次；
[0009] (2)印楝不定根的誘導(dǎo)：將愈傷組織接種到印楝不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在無(wú) 菌、溫度為25-27Γ、黑暗條件下培養(yǎng)3-5周，得到印楝不定根。
[0010]印楝愈傷誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和 瓊脂，使吲哚乙酸的終濃度為2-3mg/L、6-芐氨基嘌呤的終濃度為l-2mg/L、蔗糖終濃度為 30-40g/L、瓊脂終濃度為 6-7g/L，pH = 5. 8-6. 0。
[0011] 印楝愈傷不定根誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基中加入萘乙酸、蔗糖和瓊脂， 使萘乙酸終濃度為0. 05-0. 3mg/L、蔗糖終濃度為30-40g/L瓊脂終濃度為6-7g/L，pH = 5. 8~6. 0〇
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0013] 本發(fā)明利用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)印楝愈傷誘導(dǎo)不定根，其生長(zhǎng)速度比自然生長(zhǎng)較 快，培養(yǎng)物較均一，且比農(nóng)桿菌浸染印楝外植體產(chǎn)生發(fā)根誘導(dǎo)率高，不受外界地域條件的限 制，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，重復(fù)性好。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0015] 不定根誘導(dǎo)率=(愈傷組織不定根生根數(shù)/總接種愈傷組織數(shù)）X 100%。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和瓊脂，使 吲哚乙酸的終濃度為2mg/L，6-芐氨基嘌呤的終濃度為lmg/L，蔗糖終濃度為40g/L，瓊脂終 濃度為6g/L，調(diào)pH = 5.8,在121°C，0.1 Mpa壓力的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0018] 實(shí)施例2
[0019] 固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和瓊脂，使 吲哚乙酸的終濃度為3mg/L，6-芐氨基嘌呤的終濃度為lmg/L，蔗糖終濃度為30g/L，瓊脂終 濃度為7g/L，調(diào)pH = 5.9,在121°C，0.1 Mpa壓力的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0020] 實(shí)施例3
[0021 ] 固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、6-芐氨基嘌呤、蔗糖和瓊脂，使 吲哚乙酸的終濃度為2mg/L，6-芐氨基嘌呤的終濃度為2mg/L，蔗糖終濃度為35g/L，瓊脂終 濃度為7g/L，調(diào)pH = 6.0,在121°C，0.1 Mpa壓力的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0022] 實(shí)施例4
[0023] 固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入萘乙酸、蔗糖和瓊脂，使萘乙酸的終濃度 為0. 3mg/L，蔗糖終濃度為40g/L，瓊脂終濃度為6g/L，調(diào)pH = 5. 8,在121°C，0.1 Mpa壓力 的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0024] 實(shí)施例5
[0025] 固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入萘乙酸、蔗糖和瓊脂，使萘乙酸的終濃度 為0· 05mg/L，蔗糖終濃度為30g/L，瓊脂終濃度為7g/L，調(diào)pH = 5. 9,在121°C，0· IMpa壓力 的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0026] 實(shí)施例6
[0027] 固體培養(yǎng)基的制備：在MS培養(yǎng)基中加入萘乙酸、蔗糖和瓊脂，使萘乙酸的終濃度 為0· 2mg/L，蔗糖終濃度為35g/L，瓊脂終濃度為7g/L，調(diào)pH = 6. 0,在121°C，0· IMpa壓力 的條件下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0028] MS培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1
[0029] 表1MS培養(yǎng)基配方表
[0030]
[0031] 實(shí)施例7
[0032] 一種印楝愈傷組織不定根誘導(dǎo)的方法，包括以下步驟：
[0033] (1)印楝愈傷組織的誘導(dǎo)：采集印楝葉滅菌后，切成小片段接種于實(shí)施例1的固體 培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、黑暗及25°C的條件下培養(yǎng)4周后，得到愈傷組織，并繼代3-4次。
[0034] (2)印楝愈傷組織不定根的誘導(dǎo)：將愈傷組織接種到實(shí)施例4的固體培養(yǎng)基上，在 無(wú)菌、黑暗及25 °C的條件下培養(yǎng)4周，得到不定根。
[0035] 實(shí)施例8
[0036] 本發(fā)明獲得的印楝愈傷組織誘導(dǎo)的不定根的誘導(dǎo)率實(shí)施例4到實(shí)施例6分別為： 33. 4%、13. 3%、20. 0%。平均每塊愈傷組織的不定根數(shù)差異采用T檢驗(yàn)，p < 0. 01。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種印楝愈傷組織誘導(dǎo)不定根的方法，其特征在于包括以下步驟： 首先，印楝愈傷組織的誘導(dǎo)：將滅菌過(guò)的印楝葉作為外植體切成0. 5X0. 5cm2的片段后 接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在無(wú)菌、溫度為25-27Γ、避光條件下培養(yǎng)3-5周，得到 愈傷組織，并繼代培養(yǎng)3-5次；其次，印楝不定根的誘導(dǎo)：將愈傷組織接種到印楝不定根誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在無(wú)菌、溫度為25-27°C、避光條件下培養(yǎng)3-5周，得到印楝不定根。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種印楝愈傷組織不定根的誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述第一步，所述的印楝愈傷組織培養(yǎng)基為在1L的MS培養(yǎng)基中加入吲哚丁酸、6-芐氨 基嘌呤、蔗糖和瓊脂，使吲哚丁酸的終濃度為2-3mg/L、6-芐氨基嘌呤的終濃度為l-2mg/L、 蔗糖終濃度為30-40g/L、瓊脂終濃度為6-7g/L，pH = 5. 8-6. 0。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的印楝愈傷誘導(dǎo)不定根的方法，其特征在于，所述第二步，所述 的愈傷組織生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1LMS培養(yǎng)基中含有萘乙酸，蔗糖和瓊脂，使萘乙酸的終濃度 為 0· 05-0. 3mg/L、蔗糖終濃度為 30-40g/L、瓊脂終濃度為 6-7g/L，pH = 5. 8-6. 0。
【專利摘要】一種印楝愈傷組織誘導(dǎo)不定根的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明利用了植物細(xì)胞的全能性和植物組織培養(yǎng)技術(shù)，將滅菌后的印楝葉作為外植體切成0.5×0.5cm2的片段，置于誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，使其脫分化形成愈傷組織，從而在愈傷組織誘導(dǎo)不定根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3-5周天后誘導(dǎo)出不定根，誘導(dǎo)率較高。本發(fā)明過(guò)程簡(jiǎn)單，能在短期內(nèi)快速有效地將印楝葉誘導(dǎo)出愈傷組織，并將此愈傷組織誘導(dǎo)出不定根，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，同時(shí)為印楝植物中活性物質(zhì)印楝素的制備提供新的技術(shù)方案。
【IPC分類】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105284611
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510631153
【發(fā)明人】李興林, 汪珊英, 別振宇
【申請(qǐng)人】天津科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年9月25日