一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，以三七植株幼嫩的莖、葉、花或花藥作為外植體，經(jīng)過滅菌、接種、及誘導培養(yǎng)，得到三七胚性愈傷組織；所述的誘導培養(yǎng)基為MS+0.1～2mg/L 2,4?D+0.1～2mg/L BA+0.002～2mg/L TDZ。本發(fā)明通過對光照時間、培養(yǎng)基、濕度、溫度等條件控制，培養(yǎng)出誘導率較高的胚性愈傷組織。本發(fā)明通過光照的控制有效的促進胚性愈傷組織的形成，并在培養(yǎng)基中加入TDZ及與其他植物激素的搭配，使三七胚性愈傷組織的誘導率明顯提高，并有助于愈傷組織的生長。
【專利說明】
一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物領域，具體涉及一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 三七為五加科人參屬植物，有"金不換"、"南國神草"、"參中之王"等美譽，是云南 特有的名貴中藥材，也是我國中醫(yī)藥中一顆璀璨的明珠。
[0003] 根據(jù)組織學觀察、外觀特征及其再生性、再生方式等，愈傷組織分成兩大類:胚性 愈傷組織和非胚性愈傷組織。一般胚性愈傷組織質(zhì)地較堅實，顏色有乳白色或黃色，表面具 球形顆粒，其生長緩慢;從細胞學來看，胚性愈傷組織由等直徑細胞組成，細胞較小，原生質(zhì) 濃厚，無液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性強。胚性愈傷組織更有利于在后續(xù)組培工作 中，在分化培養(yǎng)基上再生完整植株。
[0004] 因此，誘導培養(yǎng)胚性愈傷組織是利用組培技術培養(yǎng)三七植株的技術關鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是根據(jù)提供一種通過組織培養(yǎng)手段培養(yǎng)出三七胚性愈傷組織，為分 化為三七完整植株提供基礎。
[0006] 本發(fā)明提供的技術方案：
[0007] 一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，以三七植株幼嫩的莖、葉、花或花藥作為外 植體，經(jīng)過滅菌、接種、及誘導培養(yǎng)，得到三七胚性愈傷組織;所述的誘導培養(yǎng)基為MS+0.1~ 2mg/L 2,4-D+0.1 ~2mg/L M+0.002~2mg/L TDZ(即：在每一升的MS培養(yǎng)基中添加0.1 ~ 211^2,4-0、0.1~211^8八和0.002~111^丁02)。
[0008] 所述MS為MS培養(yǎng)基，2，4-D為2，4-二氯苯氧乙酸，BA為芐氨基腺嘌呤，TDZ為噻苯 隆。
[0009] 優(yōu)選的，所述誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.008mg/L TDZ(即在每一升的MS培養(yǎng)基中添加0.5mg 2,4-D、0.1mg BA和0.008mg TDZ)。
[0010] 進一步的，所述誘導培養(yǎng)的光照控制為10~15小時光照、10~15小時黑暗，交替進 行。
[0011] 優(yōu)選的，所述的光照控制的光強度為1500-20001x。
[0012]進一步的，所述的誘導培養(yǎng)的環(huán)境控制為溫度：22°C - 25°C;空氣相對濕度：50- 80% 〇
[0013] 進一步的，所述三七莖、葉、花作為外植體的滅菌方法為:選取健康的三七植株幼 嫩的莖、葉、花為外植體，用清水沖洗5~6次，將沖洗后的外植體置于濃度為0.1 %的升汞 中，浸泡滅菌后用無菌去離子水沖洗6~8次。
[0014] 進一步的，所述三七莖、葉、花作為外植體的接種方法為：在無菌環(huán)境中將經(jīng)過滅 菌的莖、葉、花切割大小為0.5cm2的塊狀外植體;在無菌的條件下進行接種，每瓶培養(yǎng)基接 種3~5塊外植體。
[0015] 進一步的，所述三七莖、葉、花作為外植體的誘導培養(yǎng)的周期為4~5周。
[0016] 進一步的，所述三七花藥作為外植體的接種方法為:在無菌濾紙上剝?nèi)』ㄋ?在無 菌的條件下進行接種，將花藥接種到組培瓶中，每瓶15~20粒；
[0017] 進一步的，所述三七花藥作為外植體的誘導培養(yǎng)的周期為6~7周。
[0018]本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明通過對光照時間、培養(yǎng)基、濕度、溫度等條件控制，培養(yǎng)出誘導率較高的胚 性愈傷組織。本發(fā)明通過光照的控制有效的促進胚性愈傷組織的形成，并在培養(yǎng)基中加入 TDZ及與其他植物激素的搭配，使三七胚性愈傷組織的誘導率明顯提高，并有助于愈傷組織 的生長。
[0020] 本發(fā)明利用組織培養(yǎng)繁殖效率高、生長周期短的優(yōu)點，建立適合三七胚性愈傷組 織生長的組培條件，從而提供大量的優(yōu)質(zhì)的三七胚性愈傷組織，為從三七胚性愈傷組織分 化為三七植株提供基礎，有利于自動化、規(guī)模化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1
[0022] 一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0023]選取健康的三七植株幼嫩的莖、葉、花作為外植體，用清水沖洗5次，先用70 %的酒 精滅菌l〇s，用無菌水沖洗3次后，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1 %的升汞中，浸泡滅 菌，無菌去離子水沖洗6次，備用。
[0024] 在無菌環(huán)境中將經(jīng)過滅菌的莖、葉、花切割為0.5cm2的塊狀外植體;在無菌的條件 下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的外植體接種到培養(yǎng)基 上，每瓶培養(yǎng)基接種3~5塊外植體。
[0025] 在MS+O.lmg/L 2,4-D+O.lmg/L BA+0.002mg/L TDZ的培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)。
[0026] 其中，光照控制為4小時光照條件和4小時黑暗條件交替進行，光照強度為15001x; 溫度:22 °C ;空氣相對濕度:50%。培養(yǎng)周期為4一5周。
[0027] 實施例2
[0028] 一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0029]選取健康的三七植株幼嫩的莖、葉、花作為外植體，用清水沖洗6次，先用70 %的酒 精滅菌l〇s，用無菌水沖洗3次后，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1 %的升汞中，浸泡滅 菌，無菌去離子水沖洗8次，備用。
[0030] 在無菌環(huán)境中將經(jīng)過滅菌的莖、葉、花切割為0.5cm2的塊狀外植體;在無菌的條件 下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的外植體接種到培養(yǎng)基 上，每瓶培養(yǎng)基接種5塊外植體。
[0031] 其中的誘導培養(yǎng)基為MS+2mg/L 2,4-D+2mg/L BA+2mg/L TDZ。
[0032] 其中，光照控制為8小時光照條件和8小時黑暗條件交替進行，光照強度為20001x; 溫度:25°C ;空氣相對濕度:80% ;培養(yǎng)周期為5周。
[0033] 實施例3
[0034] 一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0035]選取健康的三七的花藥作為外植體，將三七花清水沖洗5次，先用70 %的酒精滅菌 l〇s，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1 %的升汞中，浸泡滅菌，無菌去離子水沖洗6次，備 用。
[0036] 在無菌濾紙上剝?nèi)』ㄋ?在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在 火焰上灼燒一下，將花藥接種到組培瓶中，每瓶15粒；
[0037] 在MS+0.5mg/L 2,4-D+O.lmg/L BA+0.008mg/L TDZ的培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)。
[0038] 其中，光照控制為6小時光照條件和6小時黑暗條件交替進行，光照強度為16001x; 溫度:22°C ;空氣相對濕度:50%，培養(yǎng)周期為6周。
[0039] 實施例4
[0040] -種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0041 ]選取健康的三七的花藥作為外植體，將三七花清水沖洗6次，先用70 %的酒精滅菌 10S，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1 %的升汞中，浸泡滅菌，無菌去離子水沖洗8次，備 用。
[0042] 在無菌濾紙上剝?nèi)』ㄋ?在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在 火焰上灼燒一下，將花藥接種到組培瓶中，每瓶20粒；
[0043] 在MS+lmg/L 2,4-D+lmg/L BA+lmg/L TDZ的培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)。
[0044] 其中，光照控制為5小時光照條件和5小時黑暗條件交替進行，光照強度為17001x; 溫度:25°C ;空氣相對濕度:80%，培養(yǎng)周期為7周。
[0045] 不同植物激素對三七胚性愈傷組織的誘導率的影響試驗：
[0046]選取5組健康的三七植株幼嫩的莖作為外植體，經(jīng)過相同的滅菌處理，分別接種于 4組誘導培養(yǎng)基（l)MS+0.1mg/L 2,4-D、（2)MS+0.1mg/L BA、（3)MS+0.1mg/L TDZ、（4)MS+ O.lmg/L 2,4-D+O.lmg/L BA^(5)MS+0.lmg/L 2,4-D+O.lmg/L BA+O.lmg/L TDZ.
[0047]在相同的環(huán)境下進行培養(yǎng)，其中光照控制為12小時光照條件和12小時黑暗條件交 替進行，光照強度為20001x;溫度:25°C ;空氣相對濕度:80 % ;培養(yǎng)5周后對其胚性愈傷組織 的誘導率進行測試。
[0048]表1，不同植物激素對三七胚性愈傷組織的誘導率的影響 [0049]
[0050]從表1的結果可以看出，TDZ的添加能明顯有利于三七的胚性愈傷組織的誘導。TDZ 與NAA和BA的協(xié)同作用明顯的促進胚性愈傷組織的誘導及生長。
[0051]不同光照條件對胚性愈傷組織的誘導率的影響試驗：
[0052]選取6組健康的三七植株幼嫩的莖作為外植體，經(jīng)過相同的滅菌處理，接種于相同 的誘導培養(yǎng)基 MS+0. lmg/L 2,4-D+O. lmg/L BA+O.lmg/L TDZ 中。
[0053] 對其進行不同的光照處理，分別為（1)5小時光照條件和5小時黑暗條件交替進行， (2) 10小時光照條件和10小時黑暗條件交替進行，（3) 12小時光照條件和12小時黑暗條件交 替進行，（4) 15小時光照條件和15小時黑暗條件交替進行，（5)20小時光照條件和20小時黑 暗條件交替進行，（5)20小時光照條件和20小時黑暗條件交替進行。
[0054] 6組的光照強度為20001x;溫度:25°C ;空氣相對濕度:80% ;培養(yǎng)5周后對其胚性誘 導率進行測試。
[0055] 表1，不同光照條件對三七胚性愈傷組織的誘導率的影響
[0056]
[0057]從表2的結果可以看出，使用光照與黑暗交替的光照條件與三七愈傷組織中紫色 素的形成有影響，其中12小時光照條件和12小時黑暗條件最有利于胚性愈傷組織的形成， 提高誘導率及促進愈傷組織的生長。
[0058]不同光照強度對胚性愈傷組織的誘導率的影響試驗：
[0059]選取5組健康的三七植株幼嫩的莖作為外植體，經(jīng)過相同的滅菌處理，接種于相同 的誘導培養(yǎng)基MS+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.1mg/L TDZ中，置于溫度：25°C;空氣相對 濕度:80% ;6小時光照條件和6小時黑暗條件交替進行的環(huán)境中，。
[0060] 其中，5組的光照強度分別為8001x，10001x，20001x，25001x;培養(yǎng)5周后對其胚性 愈傷組織誘導率進行測試。
[0061] 表3,不同光照強度對三七胚性愈傷組織的誘導率的影響
[0062]
[0063] 從表3的結果可以看出，光照強度為
15001x~20001x的條件下有利于提高三七胚 性愈傷組織的誘導及形成。
【主權項】
1. 一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，以三七植株幼嫩的莖、葉、花或 花藥作為外植體，經(jīng)過滅菌、接種、及誘導培養(yǎng)，得到三七胚性愈傷組織;所述的誘導培養(yǎng)基 為MS+0.1~2mg/L 2,4-D+0.1~2mg/L BA+0.002~2mg/L TDZ。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述誘導 培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.008mg/L TDZ。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述誘導 培養(yǎng)的光照控制為10~15小時光照、10~15小時黑暗，交替進行。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的光 照控制的光強度為1500-20001x。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的誘 導培養(yǎng)的環(huán)境控制為溫度:22°C - 25°C ;空氣相對濕度:50-80%。6. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三七 莖、葉、花作為外植體的滅菌方法為:選取健康的三七植株幼嫩的莖、葉、花為外植體，用清 水沖洗5~6次，將沖洗后的外植體置于濃度為0.1 %的升汞中，浸泡滅菌后用無菌去離子水 沖洗6~8次。7. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三七 莖、葉、花作為外植體的接種方法為：在無菌環(huán)境中將經(jīng)過滅菌的莖、葉、花切割大小為 0.5cm2的塊狀外植體;在無菌的條件下進行接種，每瓶培養(yǎng)基接種3~5塊外植體。8. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三七 莖、葉、花作為外植體的誘導培養(yǎng)的周期為4~5周。9. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三七 花藥作為外植體的接種方法為:在無菌濾紙上剝?nèi)』ㄋ?在無菌的條件下進行接種，將花藥 接種到組培瓶中，每瓶15~20粒。10. 根據(jù)權利要求1所述的一種三七胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)方法，其特征在于，所述三 七花藥作為外植體的誘導培養(yǎng)的周期為6~7周。
【文檔編號】A01H4/00GK106069791SQ201610725884
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月25日
【發(fā)明人】陳中堅, 王勇, 魏富剛, 余育啟
【申請人】文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司