一種驢精液冷凍保存方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體是一種驢精液冷凍保存方法。
【背景技術】
[0002]自1950年Smith和Polge冷凍保存牛精液獲得成功后，其它動物如豬、馬、家禽及一些野生動物的精液冷凍保存研究進展也較快。精液冷凍技術是指用干冰(_79°C)、液氮(_196°C)或液氦(_269°C)等作為冷源，將精液進行特殊處理后冷凍，然后投入超低溫的液氮中，使精子細胞的代謝維持在最低水平，可達到長期保存的目的。使用時將精液在水浴中解凍，精子恢復活性，即可用于人工輸精。目前，牛的精液保存已達到應用階段，馬、驢等家畜的精液保存技術還處在實驗階段。1973年西北農(nóng)學院用干冰冷凍驢顆粒精液，授精母馬16匹，受胎率為37.5%。1977年陜西省畜牧獸醫(yī)研究所用干冰冷凍袋裝驢精液，授精母馬109匹，情期受胎率為52.3%。2008年新疆農(nóng)業(yè)大學王慧偉等，制作的驢冷凍精液，給7頭發(fā)情母驢輸精，其中3頭成功妊娠。2010年，塔里木大學動科學院曾維斌等制作的驢凍精，解凍后精子活力可以達到0.31。
[0003]應用冷凍精液進行人工授精，不僅可以解決精液遠距離運輸問題，促進不同區(qū)域的優(yōu)良種質(zhì)資源的交流，而且可以延長種公畜遺傳物質(zhì)的使用時間。我國在奶牛及肉牛上應用冷凍精液技術及人工授精技術已發(fā)展的較為完善，充分提高了養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益.但在驢精液冷凍保存技術上雖有所研究，但普遍存在冷凍精液解凍后，精子活率低，受胎率不高等現(xiàn)象。本發(fā)明較其他的驢精子冷凍保存區(qū)別在于:冷凍稀釋液有所不同；在冷凍方法上采用控制性降溫、液氮熏蒸的溫度和短的熏蒸時間，這些技術改進和創(chuàng)新顯著的提高了精子冷凍效果。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
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本發(fā)明的目的是提供了一種驢精液冷凍保存方法，提高種公驢的利用效率，加速驢的品種改良步伐。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
通過人工采精專用假臺驢進行精液采集，然后將采集的驢精液在I液和II液的稀釋下進行冷凍處理保存。
[0006]本發(fā)明解決上述問題的技術方案如下:
1.稀釋液的配置
I液:乳糖7g、葡萄糖1.25g,新鮮雞蛋黃20ml、蒸餾水10ml0
[0007]II液:取I液45ml，加入5ml甘油、青霉素鈉5000U1、硫酸鏈霉素5000UI。
[0008]2.驢精液的采集
2.1準備臺驢或者假臺驢
根據(jù)種公驢的個體大小調(diào)整假臺驢的驢體，使其更適合種公驢爬跨。
[0009]2.2裝配采精假陰道采精假陰道裝好后先用75%的酒精消毒內(nèi)胎及集精杯，再用96%的酒精擦拭，待酒精揮發(fā)后，再用稀釋液沖洗。
[0010]2.3假陰道的調(diào)溫、調(diào)壓、涂潤滑劑
先灌入1800毫升的42°C溫水，用溫度計測試陰道器內(nèi)壁的溫度，保持在40°C之間為宜，吹氣加壓，使采精筒大口內(nèi)胎縮成三角形為佳，最后用潤滑劑涂抹至陰道器內(nèi)壁的前1/3，如涂抹過深，易使?jié)櫥瑒┪廴揪夯蛘吡魅爰瓋?nèi)。
[0011]2.4精液的采集
用軟毛巾蘸溫開水沖洗種公驢的外生殖器，采精員站在臺驢或者假臺驢的左側(cè)，待種公驢陰莖勃起爬跨，順勢輕托種公驢陰莖將其導入假陰道孔內(nèi)，觀察種公驢表現(xiàn)待公驢射精后，將假陰道氣孔閥門打開，使全部精液流入集精杯內(nèi)，以紗布封口，送入精液處理室。
[0012]3.精液冷凍處理
3.1采精前處理
控制精液處理室的溫度在25°C — 30°C，將空離心管置于35°C水浴中預熱，將載有冷凍稀釋I液的離心管置于25°C水浴中預熱，將載有冷凍保存II液的實驗瓶置于4°C冰箱中。
[0013]3.2精液的過濾及離心
采集的種公驢精液經(jīng)八層無菌紗布過濾，顯微鏡鏡檢活力即直線運動精子比例達到70%以上，可進行冷凍。580-620 Xg離心力條件下離心lOmin，棄上清液，留下濃縮液。
[0014]3.3精液的稀釋
將離心后的濃縮液移至實驗瓶，加入等體積(I:1)的冷凍稀釋I液，緩緩搖勻后置于盛有22°C 10ml溫水的燒杯中，再將該燒杯置于4°C冰箱中，平衡90min后，向裝有精子混合液的離心管中再次添加4°C與精子濃縮液等體積的冷凍保存II液。添加完成后緩緩搖勻，在4°C下再平衡90min。
[0015]3.4精液的冷凍
在4°C溫度下，用專用注射器將經(jīng)處理的精子混合液吸入0.5ml細管內(nèi)，快速封口，置于液氮面上2.5cm上熏蒸6min后，直接投入液氮中冷凍。將細管凍精從液氮中取出，置于38°C水浴中45s，即精子解凍
本發(fā)明的技術用冷卻源降低或抑制精子新陳代謝水平，長期保存在超低溫的狀態(tài)下，并且在復蘇后能保持受精能力，以突破時間和空間對種畜精液使用的限制。這一技術的核心是采用何種冷凍保存液和冷凍方法對精子進行處理以降低冷凍和復蘇過程中對精子的損害。本發(fā)明所述方法中，驢冷凍精液需在無菌的環(huán)境下操作，每一步都需嚴格控制，嚴防出錯，否則會影響最終結(jié)果。本發(fā)明方法的冷凍精液合格率達100%，即冷凍精液解凍后精子活力在0.3以上，冷凍-解凍后精子的活率達到35%以上，精子的頂體完整率達到80%以上，每劑細管中有效精子數(shù)不少于3000萬個。
[0016]【具體實施方式】:
1.稀釋液的配置
1.1基礎液的配置
用電子分析天平準確稱取乳糖7g、葡萄糖1.25g，將其溶解于10mL蒸餾水中，用恒溫磁力攪拌器攪拌均勻后，用10%碳酸氫鈉調(diào)整溶液pH值至7.1?7.8，然后用0.22 μπι的濾膜進行過濾除菌。過濾后的液體基礎液，放入4°C冰箱中備用。
[0017]1.2蛋黃的抽取雞蛋應選擇農(nóng)家自產(chǎn)雞蛋或者來源于無疫病的雞場，且所使用雞蛋須新鮮、完整、干凈，取用卵黃前先用75%酒精棉球?qū)Φ皻け砻孢M行消毒，待酒精揮發(fā)盡后用蛋清分離器取出完整的卵黃；也可在雞蛋腰中線處敲開一裂紋，將雞蛋一分兩半，利用二個蛋殼交替傾倒的方法，除去蛋清，留下卵黃；然后用滅菌的注射器穿過卵黃膜抽取卵黃。
[0018]1.3 I液和II液的配置
在進行驢精液冷凍前，取75mL基礎液置于錐形瓶中，抽取卵黃20mL加入。