專利名稱：脫乙酰殼多糖和殼多糖的生產(chǎn)的制作方法
殼多糖是β-(1，4)-D-葡糖胺的高度不溶性的N-乙?；酆衔铩Ｃ撘阴ざ嗵鞘菤ざ嗵堑乃崛苄悦撘阴；问健ざ嗵?、脫乙酰殼多糖及其衍生物具有多種工業(yè)用途，包括生產(chǎn)粘度控制劑、粘合劑、層析載體、增加紙張強(qiáng)度的試劑、絮凝劑、食品添加劑、藥物和化妝品。
通過使蟹或蝦殼去蛋白質(zhì)化和去鈣化可制備殼多糖。用熱堿溶液使殼多糖脫乙?；傻玫矫撘阴ざ嗵?。這種生產(chǎn)脫乙酰殼多糖的方法具有很多不利的特點，例如，該方法需要昂貴的熱能和對健康有潛在危害的苛性堿。該方法還產(chǎn)生大量廢料，因此必需大筆處理費用。另外，蝦或蟹殼的供應(yīng)在很大程度上取決于季節(jié)和環(huán)境因素，對生產(chǎn)能力造成無法預(yù)料的限制。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)真菌Actinomucor taiwanensis和真菌Rhizopus azygosporus可產(chǎn)生異常高產(chǎn)量的脫乙酰殼多糖和殼多糖。
因此，本發(fā)明包括生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法的特征在于(1)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Rhizopus azygosporus真菌或Actinomucor taiwanensis真菌以形成培養(yǎng)物，和(2)從細(xì)胞中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。例如，通過將真菌細(xì)胞與培養(yǎng)物分開并將脫乙酰殼多糖或殼多糖從分離出的細(xì)胞分離出來即可從培養(yǎng)物中分離得到脫乙酰殼多糖和殼多糖。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法包括(1)在對本發(fā)明方法有用的培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛霉科真菌以形成培養(yǎng)物，和(2)從所得真菌培養(yǎng)物中分離出脫乙酰殼多糖或殼多糖。
對本發(fā)明方法有用的培養(yǎng)基可包括約5至60g／L(如約30g／L)的玉米浸出汁，約10至100g／L(如約50g／L)的葡萄糖，約0．01至30g／L(如約2．5g／L)的硫酸銨或其它適當(dāng)組分。
本發(fā)明的方法能由含有Rhizopus azygosporus或Actinomucortaiwanensis真菌的培養(yǎng)物異常高產(chǎn)量地生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖。另外，我們發(fā)現(xiàn)含有玉米浸出汁、葡萄糖、酵母浸膏和硫酸銨的培養(yǎng)基能使真菌培養(yǎng)物的殼多糖和脫乙酰殼多糖產(chǎn)出量增加。因此，本發(fā)明的方法提供了另一種生產(chǎn)殼多糖和脫乙酰殼多糖的方法，而無需依賴對環(huán)境有害的化學(xué)物質(zhì)或甲殼類動物易變的產(chǎn)量。
從下列詳細(xì)描述和權(quán)利要求書中顯而易見本發(fā)明的其它特征或優(yōu)點。
本發(fā)明涉及由屬于毛霉科的真菌培養(yǎng)物大量生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖。
可用于本發(fā)明方法的具體真菌包括Rhizopus azygosporus或Actinomucor taiwanensis。可從臺灣食品工業(yè)和研究開發(fā)研究所(中國臺灣新竹300 Shih-Ping路331號)的培養(yǎng)物保藏和研究中心(CCRC)請求得到這兩種微生物，R．a(chǎn)zygosporus的保藏目錄號為CCRC31558，A．taiwanensis的保藏目錄號為CCRC31559。
培養(yǎng)真菌的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可用真菌接種YM瓊脂，于25℃至37℃將經(jīng)接種的瓊脂保溫3至6天。將得自真菌的孢子懸浮于液體中以得到104至107cfu／ml的原種。用該原種直接接種發(fā)酵培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為3至8，其可含有10至100g／L碳源(如葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、糖蜜或豆油)、5至60g／L氮源(如豆粉、蛋白胨或玉米浸出汁)、0．5至20g／L酵母浸膏、0．01至30g／L(NH4)2SO4、0至3g／L K2HPO4、0至3g／L NaCl、0至15g／L MgSO4·7H2O和／或0至0．3g／L CaCl2。將真菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2至4天。
可使用標(biāo)準(zhǔn)方法從真菌菌絲體中分離和純化脫乙酰殼多糖。例如，可按McGahren等人，生物化學(xué)方法，1988-90，1984中所述，使用堿和酸處理以分離脫乙酰殼多糖。分離脫乙酰殼多糖的其它細(xì)節(jié)和步驟可參見歐洲申請0531991 A2；Yokoi等人，發(fā)酵與生物工程雜志，85246-249，1998；美國專利5，232，842；Rane等人，食品生物技術(shù)，711-33，1993；和Hang，生物技術(shù)通訊，12911-912，1990。
一般，從發(fā)酵肉湯中分離出細(xì)胞塊并用蒸餾水洗滌。然后用0．5至2N NaOH處理細(xì)胞，將該堿性混合物于121℃保溫15分鐘。離心沉淀固體物并用蒸餾水和乙醇洗滌。用2％醋酸溶液處理經(jīng)洗滌過的沉淀物，并于95℃保溫12小時。離心分離所得懸浮液，產(chǎn)生酸溶性上清液(含有脫乙酰殼多糖)和酸不溶性沉淀物(含有殼多糖)。
用2N NaOH將上清液的pH調(diào)節(jié)至10，從而沉淀出脫乙酰殼多糖。最后用蒸餾水洗滌脫乙酰殼多糖并凍干。酸不溶性的沉淀物也用蒸餾水洗滌并凍干。該酸不溶性和堿不溶性組分是純化的殼多糖。
無需進(jìn)一步詳述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于上述內(nèi)容和下文的描述最大程度地利用本發(fā)明。下列實施例僅用于闡明本領(lǐng)域技術(shù)人員如何實施本發(fā)明，而不以任何方式限制其所公開的內(nèi)容。說明書中提及的任何出版物都列入本文作為參考。
下列實施例的結(jié)果簡述于實施例后出現(xiàn)的表1。
從發(fā)酵肉湯中回收細(xì)胞塊，于121℃用1N NaOH處理細(xì)胞15分鐘，將堿不溶性物質(zhì)懸浮于2％醋酸中，于95℃將所得混合物保溫12小時以溶解脫乙酰殼多糖。通過將酸溶性上清液的pH調(diào)節(jié)至10以沉淀出脫乙酰殼多糖。然后洗滌，干燥和稱重脫乙酰殼多糖。對酸不溶性物質(zhì)殼多糖也進(jìn)行洗滌，干燥和稱重。以每升培養(yǎng)物中殼多糖或脫乙酰殼多糖的克數(shù)計算產(chǎn)量，結(jié)果示于表1。使用含有玉米淀粉和蛋白胨的培養(yǎng)基得到了最高產(chǎn)量的殼多糖和脫乙酰殼多糖。
表1中所用縮寫如下“R．a(chǎn)．”表示Rhizopus azygosporus；“A．t．”表示Actinomucor taiwanensis，“S．M．”表示豆粉；“C．S．L．”表示玉米浸出汁；“C．S．”表示玉米淀粉；“S．O．”表示豆油。表1中描述的所有培養(yǎng)物都含有酵母浸膏。
上述實施例1至7的結(jié)果表明(1)A．taiwanensis和R．a(chǎn)zygosporus是殼多糖和脫乙酰殼多糖的超級生產(chǎn)者，(2)含有玉米浸出汁、葡萄糖和硫酸銨的培養(yǎng)基可增加由真菌產(chǎn)生的殼多糖和脫乙酰殼多糖的產(chǎn)量。
應(yīng)理解盡管結(jié)合詳細(xì)描述描述了本發(fā)明，但上述描述僅想闡明而不是限制由所附權(quán)利要求書的范圍所限定的本發(fā)明范圍。其它方面、優(yōu)點和改動也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
表1
權(quán)利要求
1．生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Rhizopus azygosporus真菌以形成培養(yǎng)物，并從培養(yǎng)物中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。
2．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括從培養(yǎng)物中分離真菌細(xì)胞，其中從所述分離出的真菌細(xì)胞中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約5至60g／L的玉米浸出汁。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約30g／L的玉米浸出汁。
5．權(quán)利要求3的方法，其中所述培養(yǎng)基還含有約10至100g／L的葡萄糖和約0．01至30g／L的硫酸銨。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約30g／L的玉米浸出汁，約50g／L的葡萄糖和約2．5g／L的硫酸銨。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約5至60g／L的玉米浸出汁，約10至100g／L的葡萄糖和約0．01至30g／L的硫酸銨。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約30g／L的玉米浸出汁，約50g／L的葡萄糖和約2．5g／L的硫酸銨。
9．生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Actinomucor taiwanensis真菌以形成培養(yǎng)物，并從培養(yǎng)物中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。
10．權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括從培養(yǎng)物中分離真菌細(xì)胞，其中從所述分離出的真菌細(xì)胞中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約5至60g／L的玉米浸出汁。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約30g／L的玉米浸出汁。
13．權(quán)利要求11的方法，其中所述培養(yǎng)基還含有約10至100g／L的葡萄糖和約0．01至30g／L的硫酸銨。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約30g／L的玉米浸出汁，約50g／L的葡萄糖和約2．5g／L的硫酸銨。
15．權(quán)利要求9的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約5至60g／L的玉米浸出汁，約10至100g／L的葡萄糖和約0．01至30g／L的硫酸銨。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約30g／L的玉米浸出汁，約50g／L的葡萄糖和約2．5g／L的硫酸銨。
17．生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛霉科真菌以形成培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)基含有約5至60g／L的玉米浸出汁，約10至100g／L的葡萄糖，約0．01至30g／L的硫酸銨；和從真菌培養(yǎng)物中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。
18．權(quán)利要求17的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約30g／L的玉米浸出汁。
19．權(quán)利要求17的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約50g／L的葡萄糖。
20．權(quán)利要求17的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約2．5g／L的硫酸銨。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)Rhizopus azygosporus真菌或Actinomucor taiwanensis真菌并從培養(yǎng)物中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖以生產(chǎn)殼多糖或脫乙酰殼多糖的方法。
文檔編號C12N1/14GK1282792SQ00121059
公開日2001年2月7日 申請日期2000年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月8日
發(fā)明者陳美惠, 陳慶源, 吳志律, 莊淑惠, 黃英娥, 陳彥霖, 袁國芳 申請人:食品工業(yè)發(fā)展研究所