專利名稱：：甲殼素脫乙酰酶的生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)的酶工程領(lǐng)域，更具體地涉及利用基因工程的手段獲得產(chǎn)生甲殼素脫乙酰酶工程菌來制備乙酰酶的方法。
背景技術(shù)：
：甲殼素是一種高分子物質(zhì)，在自然界的含量僅次于纖維素，全球蝦蟹殼年產(chǎn)量近2,000萬噸。甲殼素不溶于水、稀酸、稀堿和其他有機(jī)溶劑，很大程度上限制了其應(yīng)用范圍。目前應(yīng)用最多的是甲殼素的脫乙酰衍生物——?dú)ぞ鄣?，甲殼素脫去乙?；蔀闅ぞ厶堑倪^程必須要具備濃堿(至少40%以上)和較高溫度(9(TC以上)的條件，這不但對生產(chǎn)設(shè)備提出了很高的要求，而且遇到了"生產(chǎn)過程中的濃堿如何處理"的難題。據(jù)統(tǒng)計我國的甲殼素產(chǎn)量已超過了4000噸大關(guān)，市場對甲殼素的巨大需求和甲殼素生產(chǎn)中的嚴(yán)重污染之間存在著不可調(diào)和的矛盾，針對甲殼素脫乙酰酶的研究便應(yīng)運(yùn)而生。甲殼素脫乙酰酶(chitindeacetylase,EC3.5丄41)是一種催化甲殼素分子脫除乙?；?、形成殼聚糖的酶，將這種酶應(yīng)用于殼聚糖的制備，不僅可以有效地解決目前殼聚糖生產(chǎn)中的環(huán)境污染問題，而且可以生產(chǎn)出目前化學(xué)法不能生產(chǎn)的、適用于特殊行業(yè)(醫(yī)藥、環(huán)保等)需求的殼聚糖產(chǎn)品，如乙?；潭染鶆颉⒎肿恿糠秶植颊臍ぞ厶钱a(chǎn)品、以及具有特定乙?；恢玫臍ぞ酃烟堑取５怯捎谠撁冈谏锝缰胁⒉黄毡榇嬖?，所以它的來源問題一直困擾著它的應(yīng)用。圍繞這個問題，主要的研究進(jìn)展體現(xiàn)在如下方面1真菌來源的甲殼素脫乙酰酶1974年Yoshio最初在接合菌綱的魯氏毛霉中首先發(fā)現(xiàn)了甲殼素脫乙酰酶的存在，20年后Kafezopulos采用了硫酸銨沉淀、三次凝膠層析結(jié)合的方法分離得到了電泳純的甲殼素脫乙酰酶。以后，研究者們又陸續(xù)從犁頭霉、構(gòu)巢曲霉、黑根霉、短帚霉、灰色小克銀漢霉及啤酒酵母等微生物中檢測到了甲殼素脫乙酰酶活性的存在。2細(xì)菌來源的甲殼素脫乙酰酶我國學(xué)者黃慧莉等在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了甲殼素脫乙?；富钚裕ζ涿笇W(xué)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與真菌來源的酶學(xué)性質(zhì)相似。3病原體來源的甲殼素脫乙酰酶1990年日本研究者在炭疽病病原菌中較早的發(fā)現(xiàn)了甲殼素脫乙酰酶，并用生化分離技術(shù)分離得到純度較高的酶，其酶學(xué)性質(zhì)與真菌來源的酶有較大差異。2006年，研究者又在病原菌侵襲內(nèi)阿衣巴中證實(shí)了該酶的存在。雖然甲殼素脫乙酰酶存在于一些生物體內(nèi)，但是其含量都是微乎其微的。依靠傳統(tǒng)的生化技術(shù)、分離獲得甲殼素脫乙酰酶的主要過程是從特定的微生物的菌絲體或培養(yǎng)液出發(fā)，采用高速離心分離的辦法獲得含有甲殼素脫乙酰酶的粗提取液，再組合使用若干種柱層析分離方法，以獲得純度較高的酶產(chǎn)品。該過程耗時長、得率低，僅能滿足實(shí)驗(yàn)室的需要。所以，用基因工程的方法構(gòu)建表達(dá)該酶的工程菌，為大量、快速生產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶提供了一條有效的途徑。構(gòu)建酶工程菌株首先需要特定的基因片段。不同生物來源的基因片段往往對基因能否表達(dá)、基因的表達(dá)形式和基因的表達(dá)條件起著至關(guān)重要的作用。然而，一旦獲得良好的酶工程菌株，進(jìn)而采用發(fā)酵的方法來獲得生物酶，那么不僅可以解決生物材料來源的問題，還可以大大的簡化費(fèi)時費(fèi)力的生物酶純化過程。為了進(jìn)一步擴(kuò)大甲殼素及殼聚糖的應(yīng)用范圍并保護(hù)其知識產(chǎn)權(quán)，本領(lǐng)域迫切需要解決甲殼素脫乙酰酶的來源問題，而用基因工程的方法和手段制備生物酶是其先決條件。目前，我國尚無任何關(guān)于甲殼素脫乙酰酶制備方法的專利。
發(fā)明內(nèi)容為了克服傳統(tǒng)的生化技術(shù)、分離獲得甲殼素脫乙酰酶的耗時長、得率低，僅能滿足實(shí)驗(yàn)室的需要的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種可以快速、大量制備甲殼素脫乙酰酶的方法。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種甲殼素脫乙酰酶的生物制備方法，它包括下列步驟(a)制備含基因序列如SEQIDNO.l所述甲殼素脫乙酰酶的重組表達(dá)載體；(b)制備含有步驟(a)所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體；(c)表達(dá)和純化甲殼素脫乙酰酶。在一實(shí)施例中，所述步驟(a)如下①選取處于對數(shù)生長期的總狀毛霉菌絲體為材料，從中抽提總RNA;②使用通用引物T17AP進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用基因特異的簡并引物(5，-GATGATGGMCCYAACTGYTC-3，，M=A/C，Y=C/T)和通用引物AP擴(kuò)增基因的3'末端；根據(jù)得到的3'末端信息，設(shè)計基因特異性的引物(5'-TCGGCTACTGTTTTAGTCAGG-3，)，合成5'端第一鏈cDNA并加尾；進(jìn)而運(yùn)用基因特異性引物(5'-ACCGTCTTGAATACCACGCAT-3，)和AP引物擴(kuò)增得到5'末端cDNA;拼接5'和3'末端cDNA序列，從而得到總狀毛霉甲殼素脫乙酰酶的全長cDNA;③釆用PCR的引物為正向5，畫GCGGATCCCTTACTTCTGGCACAATTTTAC國3，，反向5，-CCGCTCGAGTTAAGACAGTAAAGAACCAAG-3，，以全長cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，收集含所述基因序列如SEQIDNO.l的DNA片段；④將步驟③所得的DNA片段和表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切作用，然后用DNA連接酶連接，獲得甲殼素脫乙酰酶的重組表達(dá)載體。在一實(shí)施例中，所用的內(nèi)切酶為5am/和^0/。在一實(shí)施例中，所述的表達(dá)載體為pET28a(質(zhì)粒大小為5369bp)，用限制性內(nèi)切酶丑am/和^72o/雙酶切切除的序列158-198bp之間的片段。在一實(shí)施例中，所述的表達(dá)載體重組表達(dá)區(qū)域包含6個組氨酸序列標(biāo)簽。在一實(shí)施例中，所述的轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌BL21。本發(fā)明的有益效果發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)到相比于其他幾種霉菌(根霉，曲霉和青霉)，總狀毛霉的培養(yǎng)液和菌絲體中均能檢測到較高的、對于甲殼素晶體底物的脫乙酰酶活性，所以其中必定含有編碼基因。本發(fā)明人根據(jù)其他一些已發(fā)現(xiàn)的脫乙酰酶基因的共性，設(shè)計了基因特異性的簡并引物，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和快速擴(kuò)增cDNA片段末端技術(shù)，從總狀毛霉總RNA中捕獲了該基因的全長cDNA。本發(fā)明首次從總狀毛霉中獲取了甲殼素脫乙酰酶基因(共2個，分別為Cdal和Cda2)，并優(yōu)選其一即Cda2，進(jìn)而獲得了該基因的重組表達(dá)載體，在原核宿主大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，得到了甲殼素脫乙酰酶。本發(fā)明設(shè)計基因特異性簡并引物，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和快速擴(kuò)增cDNA片段末端技術(shù)，結(jié)合重組DNA的方法，利用已有的原核表達(dá)載體，得到了能夠產(chǎn)生甲殼素脫乙酰酶的大腸桿菌菌株。為生物制備甲殼素脫乙酰酶提供了可靠的來源。在國內(nèi)首次在原核細(xì)胞大腸桿菌內(nèi)表達(dá)了總狀毛霉來源的甲殼素脫乙酰酶基因。與從生物體內(nèi)提取、純化得到酶的傳統(tǒng)的方法相比，具有生產(chǎn)周期短、提取成本低、產(chǎn)品酶得率和產(chǎn)量較高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明人經(jīng)過條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高了甲殼素脫乙酰酶基因在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)效率。本發(fā)明針對變性的包涵體蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了液相色譜柱上復(fù)性。并與總狀毛霉的另一甲殼素脫乙酰酶基因(Cdal)的重組蛋白作了比較。以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明。圖1表示將甲殼素脫乙酰酶核心序列插入表達(dá)載體pET28a后形成的重組質(zhì)粒。pET28a-Cda2重組質(zhì)粒(Kan表示卡那霉素抗性標(biāo)記；Ori表示復(fù)制起點(diǎn)；lacl表示阻遏蛋白編碼序列；Cda2表示甲殼素脫乙酰酶編碼序列；florigin表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施案例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)方法，未詳細(xì)說明的技術(shù)屬于常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明采用的基因及cDNA克隆和基因重組方法沒有特別限制，可以采用分子生物學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的分子克隆技術(shù)。本發(fā)明主要的方法包括出發(fā)菌種篩選、cDNA克隆、DNA重組、原核表達(dá)和蛋白質(zhì)純化方案。實(shí)驗(yàn)l(1)選擇合適的甲殼素脫乙酰酶來源菌株可采用常規(guī)的方法培養(yǎng)霉菌，選取處于對數(shù)生長期的總狀毛霉菌絲體為材料，從中抽提總RNA;以總狀毛霉(Mwcorracewoms)為材料，采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，在28。C、200rpm搖床震蕩培養(yǎng)，收集菌絲體時間為20h，分離和收集菌絲體和培養(yǎng)液部分，對于收集得到的菌絲體，采用Trizol法(超絕UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒)抽提總RNA。以部分脫乙?；募讱に鼐w作為底物，測定甲殼素脫乙酰酶的酶活力，以選擇該酶活性(或活力單位數(shù))較高的出發(fā)菌株。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，總狀毛霉的培養(yǎng)液和菌絲體中均能檢測到較高的對于甲殼素晶體底物的脫乙酰酶活性，因此，作為出發(fā)菌株是合適的。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注*數(shù)據(jù)來自對數(shù)生長末期，**數(shù)據(jù)來自穩(wěn)定期末期。實(shí)驗(yàn)2(2)甲殼素脫乙酰酶全長cDNA克隆設(shè)計系列基因特異性簡并引物，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和快速擴(kuò)增cDNA末端的方法獲得甲殼素脫乙酰酶基因的全長cDNA-Cda2;根據(jù)快速擴(kuò)增cDNA末端方法，使用通用引物T17AP進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用基因特異的簡并引物(5，-GATGATGGMCCYAACTGYTC-3，，M=A/C，Y=C/T)和通用引物AP擴(kuò)增基因的3'末端；根據(jù)得到的3'末端信息，設(shè)計基因特異性的引物(5'-TCGGCTACTGTTTTAGTCAGG-3')，合成5'端第一鏈cDNA并加尾；進(jìn)而運(yùn)用基因特異性引物(5'-ACCGTCTTGAATACCACGCAT-3，)禾口AP引物擴(kuò)增得到5'末端cDNA;拼接5，和3'末端cDNA序列，從而得到總狀毛霉甲殼素脫乙酰酶的全長cDNA序列-Cda2，該cDNA全長為1355bp，所述核苷酸序與SEQIDNO.2相同。正確地克隆得到甲殼素脫乙酰酶全長cDNA是構(gòu)建表達(dá)載體的關(guān)鍵。本發(fā)明人經(jīng)過研究，合成了基因特異性的簡并性引物(位于基因中部)，采用分子生物學(xué)中常用的分子克隆技術(shù)，從對數(shù)生長期的總狀毛霉RNA庫中"釣"到了2個甲殼素脫乙酰酶全長cDNA，為后續(xù)工作奠定了必要的基礎(chǔ)。總狀毛霉來源甲殼素脫乙酰酶的全長cDNA之一(即Cda2)及其推測氨基酸序列?？偁蠲辜讱に孛撘阴Ｃ溉LcDNA-Cda2及其推測氨基酸序列，附圖中67-1257bp為重組表達(dá)所用核心序列，所述核苷酸序與SEQIDNO.l相同。實(shí)驗(yàn)3(3)DNA重組可采用常規(guī)的DNA重組技術(shù)。但是，由于全長cDNA序列中包含有5'端和3'端非編碼序列以及可能的信號肽序列，所以需要使用PCR技術(shù)將所需核心序列分離出來，供DNA重組的連接使用。用PCR的方法，從cDNA中截取基因表達(dá)核心序列片段，并在兩端導(dǎo)入特定的限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)和保護(hù)堿基；使用5"m/和J^o/限制性內(nèi)切酶所得的片段進(jìn)行雙酶切。所用PCR的引物正向引物CDA2國F5，-GCGGATCCCTTACTTCTGGCACAATTTTAC-3，反向引物CDA2-R5'-CCGCTCGAGTTAAGACAGTAAAGAACCAAG-3，PCR擴(kuò)增體系(25^L):總DNA2^iL10Xbuffer2.5"正向引物CDA2-FluL反向引物CDA2-RluLdNTP1yL~酶0.5"ddH20_17"總體積25mLPCR反應(yīng)程序94。C預(yù)變性4min;94。C變性30s，53。C復(fù)性45s，72。C延伸1.5min，35個循環(huán);72""C延遲10min。從全長cDNA中切取的基因表達(dá)核心序列為1191bp,見SEQIDNO.l。如圖1所示，表示將甲殼素脫乙酰酶核心序列插入表達(dá)載體pET28a后形成的重組質(zhì)粒。pET28a-Cda2重組質(zhì)粒(Kan表示卡那霉素抗性標(biāo)記；Ori表示復(fù)制起點(diǎn)；lacl表示阻遏蛋白編碼序列；Cda2表示甲殼素脫乙酰酶編碼序列；florigin表示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))。選用的表達(dá)載體為pET28a(質(zhì)粒大小為5369bp)，用限制性內(nèi)切酶5am/和^72o/雙酶切切除的序列158-198bp之間的片段。將上述所得的片段，用DNA連接酶將其連接起來，獲得甲殼素脫乙酰酶的重組表達(dá)質(zhì)粒；所得的重組質(zhì)?？偣矠?526bp，重組表達(dá)區(qū)域包含6個組氨酸序列標(biāo)簽。實(shí)驗(yàn)4(4)原核表達(dá)可采用常規(guī)的大腸桿菌BL21系統(tǒng)和pET載體系列。最佳表達(dá)條件的確—、,:把重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入缺陷性大腸桿菌宿主菌；所述缺陷型宿主菌為大腸桿菌BL21。已構(gòu)建完成插入Cda2基因的pET28a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21。以含卡那霉素的LB培養(yǎng)基作為培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)的基本條件，先后對誘導(dǎo)時的溫度(16°C、20°C、25°C、30°C、37°C及42°C)、誘導(dǎo)劑IPTG濃度(0.05、0.1、0.5和lmM)和誘導(dǎo)時間(1、2、3及4h)進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37°C、IPTG濃度為O.lmM、誘導(dǎo)后表達(dá)lh時，根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果掃描顯示，表達(dá)的甲殼素脫乙酰酶已占細(xì)菌總蛋白的30%以上。實(shí)驗(yàn)5(5)蛋白質(zhì)的純化對于部分可溶的甲殼素脫乙酰酶，可采用常規(guī)的親和層析分離。對于包涵體蛋白質(zhì)，可采用常規(guī)的蛋白質(zhì)變性-復(fù)性技術(shù)路線進(jìn)行分離。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明人對不同的蛋白質(zhì)變性-復(fù)性方案進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，探索得出了利用液相色譜法對變性溶解蛋白質(zhì)進(jìn)行柱上復(fù)性的純化蛋白質(zhì)方案。包涵體重組蛋白質(zhì)的純化己構(gòu)建完成插入Cda2基因的pET28a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21。培養(yǎng)溫度為37"C、IPTG濃度為O.lmM、誘導(dǎo)后表達(dá)時間2h后收集菌體細(xì)胞。將菌體細(xì)胞破碎、洗滌和分離，溶解后待上樣，在AKTA快速蛋白液相色譜的Ni-Sepharose柱上用6-0M脲線性梯度進(jìn)行重折疊(梯度體積使用30ml,流速為0.5ml/min)，用10-500mM咪唑線性梯度洗脫重折疊的目的蛋白(梯度體積為10ml，流速為lml/min)，得到電泳純的甲殼素脫乙酰酶。結(jié)果顯示，重組Cda2基因得到的蛋白質(zhì)活力高于重組Cdal基因得到的蛋白質(zhì)，證實(shí)在總狀毛霉中所得到的兩個甲殼素脫乙酰酶基因片段中，Cda2更適合于重組載體的構(gòu)建。在國內(nèi)首次在原核細(xì)胞大腸桿菌內(nèi)表達(dá)了總狀毛霉來源的甲殼素脫乙酰酶基因。與從生物體內(nèi)提取、純化得到酶的傳統(tǒng)的方法相比，具有生長周期短、提取成本低、產(chǎn)品酶得率和產(chǎn)量較高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明人經(jīng)過條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高了甲殼素脫乙酰酶基因在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)效率。本發(fā)明針對變性的包涵體蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了液相色譜柱上復(fù)性。并與總狀毛霉的另一甲殼素脫乙酰酶基因(Cdal)的重組蛋白作了比較。本方法與常規(guī)生化制備方法的比較，結(jié)果見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。附本發(fā)明所涉及的DNA核苷酸序列如下SEQUENCELISTING<iio>上海海洋大學(xué)<120>甲殼素脫乙酰酶的生物制備方法<130>說明書序列表<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1191<212>DNA<213>Mucorracemosus<400>cttsctttctggcacaatttt3CtSCCC333ttg3tCCC3aaaacgtgtctgtaccttcg603tt3CtC333cc3cssgc3tC33tCCCtCtg33g33tgtgttt3ttstsgccctgstacc120tcattagttg3t3tcgtctctgctgaatggcct3ctsgctggcaaaaagct3Ct3CC33C1803ttcsttgcc3tgt3t33Ctctsttgsttggsccssggct240CCC33t3ttCcsgtgcgtsctctgcttgctgacggttcttt333C3tgscsggct3ttct300tcctcttctgatcctgattgctggtggtctgctagtggttgt3ct33gccC3333tttCt360gscgcct3tacagatctggttcsgtgtgc3g33cctg3g3cttggggcttgacttacgat420g3tgg3ccc33ctgctctcstaacgctttttatg3ttacc480gctaccatgttttacattggttctsaitgtt3tcgsttggccttatggtgct3tgcgtggt540attcaagacggtcstC3C3ttgcttgccscscctggtctcsccctstgst600aagtgttggctgaattctatttctcttt33sctggccsct660ggttt33C3cctcgttsttggcgccctccttstggtg3tsttgatgaccgtgttcgttgg720attgctgctcaactgggtttgsctgctgtt3tgtggsscttggatacagacg3ttgggct780gctggcctgsCt3333C3gtagccg3tgtcC33sctgctt3tg3tC33ttC3ttC333tg840ggcaagaacggtsccttcgctggtsgtggt33C3ttgtCttggcgcstg3g3tC33t33t900gcctggccsttC3333tttgcctsgtsttc3sgctgctt3caagcaagtc960attastgtcgC33Cttgtttt33t3t3tCtC33CCtt3tttscstggttg1020gatgtattg3tgcttcttctsctgccgtt3gtggagttcc3tctgctcsg1080tctgcsgccssgtcascctctaccgscgccC33tcttccg3tgctsgcagC33tgCt3tt1140agttctstctttgctttgtttgcagt3gctcttggttctttactgtctta1191<210>2<211>1355<212〉DNA<213>Mucorracemosus<400>23tgC333tC3sg3C3ctggc3gcsttg3ttgctst3gctc333tsgcai3aitgasgtcgct60gctg3tcttsctttctggcsC33tttt3Ct3CCC333ttgcgtgtctgt3120ccttcgatt3CtC333CC3Caagcatcaatccctctgssg33tgtgtttsttst3gccct180g3t3cctC3ttsgttgststcgtctctgctg33tggcct3ctsgctggcs240sgctgssttcattgccatgt3t33CtCt3ttgattggacc30033ggctccc33t3ttccsgtgcgtsctctgcttgctgscggttcttt333catgacsggc360t3ttcttcctcttctgstcctgsttgctggtggtctgct3gtggttgtsc420atttctgacgcctatacagatctggttcsgtgtgcsgsscctg3g3cttggggcttgsct權(quán)tacgatgatggsccc33ctgCtCtC3t33Cgcttttt3tgsttsccttgs540ccatgtttt3C3ttggttct33tgtt3tcgattggccttatggtgctatg600cgtggtsttctcsc3ttgcttgccscscctggtctcsccct3tgst33ct660accaagaagtgttggctgaattC七3tttctctttai333gc720gccsctggttt33cscctcgttsttggcgccctccttstggtgatattgatgsccgtgtt780cgttggattgctgctcssctgggtttgsctgctgtt3tgtggaacttggatscsg3cg3t840tgggctgctggcctgsct3agatgtccaaactgcttatgatC33ttC3tt900C3satgggcssgsscggt3ccttcgctggtsgtggt33C3ttgtcttggcgcstgsg3tc960ccstgsgcctggccaittc3333tttgcctagtattcaagctgcttsc33g1020C33gtC3ttS3tgtcgcs3Cttgtttt3at3t3tctC33Ccttstttcga3g3tt3t3C31080tggttggatgtattgaatggaacagctgcttcttctactgccgtt3gtggagttccatct1140gctcagtctgcsgccssgtc33CCtCt3CCgacgcccaatcttccgstgctsgcsgcaat1200gctatttsgttctatctttgctttgtttgcsigtagctcttggttctttsctgtCtt33tt6L1260agtctcatcttttgstgstctCC3tttC3ttcaataaagctcttsttttt1320tatcctcgtttagacgtttc135權(quán)利要求1、一種甲殼素脫乙酰酶的生物制備方法，包括下列步驟(a)制備含基因序列如SEQIDNO.1所述甲殼素脫乙酰酶的重組表達(dá)載體；(b)制備含有步驟(a)所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體；(c)表達(dá)和純化甲殼素脫乙酰酶。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于所述步驟(a)如下①選取處于對數(shù)生長期的總狀毛霉菌絲體為材料，從中抽提總RNA;②使用通用引物T17AP進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用基因特異的簡并引物5，-GATGATGGMCCYAACTGYTC-3，(M=A/C，Y=C/T)和通用引物AP擴(kuò)增基因的3'末端；根據(jù)得到的3'末端信息，設(shè)計基因特異性的引物5，-TCGGCTACTGTTTTAGTCAGG-3，，合成5'端第一鏈cDNA并加尾；進(jìn)而運(yùn)用基因特異性引物5'-ACCGTCTTGAATACCACGCAT-3'和AP引物擴(kuò)增得到5'末端cDNA;拼接5'和3'末端cDNA序列，從而得到總狀毛霉甲殼素脫乙酰酶的全長cDNA;③采用PCR的引物為正向5，-GCGGATCCCTTACTTCTGGCACAATTTTAC匿3，，反向5，-CCGCTCGAGTTAAGACAGTAAAGAACCAAG-3，，以步驟②所述全長cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，收集含所述基因序列如SEQIDNO.l的DNA片段；④將步驟③所得的DNA片段和表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切作用，然后用DNA連接酶連接，獲得甲殼素脫乙酰酶的重組表達(dá)載體。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物制備方法，其特征在于所述內(nèi)切酶為B"m4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物制備方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體為pET28a。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體的表達(dá)區(qū)域包含6個組氨酸序列標(biāo)簽。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物制備方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌BL21。全文摘要本發(fā)明公開了一種總狀毛霉來源甲殼素脫乙酰酶的生物制備方法，包括下列步驟(a)制備含基因序列如SEQIDNO.1所述甲殼素脫乙酰酶的重組表達(dá)載體；(b)制備含有步驟(a)所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體；(c)表達(dá)和純化甲殼素脫乙酰酶。本發(fā)明設(shè)計基因特異性簡并引物，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和快速擴(kuò)增cDNA片段末端技術(shù)，結(jié)合重組DNA的方法，利用已有的原核表達(dá)載體，得到了能夠產(chǎn)生甲殼素脫乙酰酶的大腸桿菌菌株。為生物制備甲殼素脫乙酰酶提供了可靠的來源，具有生產(chǎn)周期短、提取成本低、產(chǎn)品酶得率和產(chǎn)量較高等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C12N15/70GK101659960SQ200910054879公開日2010年3月3日申請日期2009年7月16日優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日發(fā)明者蔣霞云,鄒曙明申請人:上海海洋大學(xué)