專利名稱：一種高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲殼素，又名甲殼質(zhì)、殼多糖等，化學(xué)名為聚[(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-e-D-葡萄 糖]，是一種天然高分子多糖，但其溶解性能很差，因而其應(yīng)用受到一定限制。殼聚糖 (chitosan)是甲殼素分子中的乙?；徊糠只蛉棵摮蟮漠a(chǎn)物，其溶解性能得到很大改 善。殼聚糖在國內(nèi)外的應(yīng)用十分廣泛。目前已在食品、醫(yī)藥、化工、生物、紡織、環(huán)保、 功能材料等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。如在醫(yī)藥工業(yè)中可以制作人造皮膚、藥物載體等。在 輕紡工業(yè)中用作增染劑、固色劑等。在日用化學(xué)工業(yè)中可制作洗發(fā)香波等。在食品工業(yè) 中可作為酒類和飲料的澄清劑、食品添加劑；也可研制成為減肥功能食品等。在環(huán)境保 護(hù)方面可用作污水處理的絮凝劑等。此外，在制作功能材料方面，可制作超濾膜、反滲 透膜等；也可作為纖維材料、催化劑、酶和細(xì)胞的固定化載體等。甲殼素和殼聚糖由于 其天然無毒和在許多領(lǐng)域的廣泛用途，已引起許多國家的重視，現(xiàn)已成為最熱門的研究 領(lǐng)域之一。目前國內(nèi)外生產(chǎn)殼聚糖主要采用濃堿法，但其制備工藝存在諸多問題，如 未除盡蛋白質(zhì)及鈣鹽、脫已酰度低、粘度低、操作步驟多、生產(chǎn)周期長、原料和能量消耗 大、生產(chǎn)成本高等。目前，還有利用微波法制備殼聚糖，但是技術(shù)尚未成熟應(yīng)用較少。
甲殼素脫乙酰酶(chitin deacetylase, E. C. 3. 5. 1. 41，以下簡稱CDA)是催化甲殼 素轉(zhuǎn)變?yōu)闅ぞ厶堑闹匾a(chǎn)酶。其通過催化N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺脫去乙?；鶎⒓讱?素轉(zhuǎn)變?yōu)闅ぞ厶恰?974年，Araki從真菌Mucorroxii培養(yǎng)液中獲得并部分純化。1982年， Kauss在植物病原體Colletotrichum lindemuthianum中也發(fā)現(xiàn)甲殼素脫乙酰酶，這 是首次報道從非接合菌類中分離得到該酶。甲殼素脫乙酰酶(chitindeacetylase，E.C. 3.5. 1.41)可替代現(xiàn)有的濃堿法生產(chǎn)高質(zhì)量的殼聚糖，這不僅可以解決環(huán)境污染問題， 而且可以生產(chǎn)出用化學(xué)法較難得到的高質(zhì)量的殼聚糖產(chǎn)品。因此，該酶具有重要的學(xué)術(shù)及 應(yīng)用價值。
從甲殼素富集的土壤中分離篩選得到高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶菌株，對殼聚糖的生產(chǎn)具有 重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的能產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶 的微生物及其應(yīng)用。
本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是篩選產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的方法，以及研究菌株csuft F14的生理生化特征。
一種高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14，保藏號為CCTCCM209062。
所述的高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14為革蘭氏陽性菌、具運(yùn)動性、 兼性厭氧、菌體短桿狀、形成內(nèi)生芽孢，芽孢卵圓形，孢囊膨大，游離芽孢表面著色弱， Gram染色陽性；在LB培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在LB培 養(yǎng)基上不產(chǎn)色素，生長溫度為28 3(TC。
所述的解淀粉芽孢桿菌csuftF14還具有以下生理生化特征還原硝酸鹽；水解淀粉； 發(fā)酵D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和D-木糖；接觸酶陽性；氧化酶陰性；硫化氫陽性； 酯酶陽性；乙酸氧化陰性。
所述的解淀粉芽孢桿菌csuft F14可用于制備生產(chǎn)殼聚糖的制劑。
本發(fā)明的產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶菌株csuftF14不同于已有的普通解淀粉芽孢桿菌，具有產(chǎn) 甲殼素脫乙酰酶能力，且酶活高于一般的產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶菌株，如構(gòu)巢曲霉、毛霉、黑 曲霉等。與國內(nèi)的產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶微生物相比，該菌株培養(yǎng)條件簡單，繁殖快，容易保 存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
解淀粉芽孢桿菌(5ad腸腦少/。/—咖"'msO, csuftF14
保藏日期2009年03月26日
保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心
保藏單位簡稱CCTCC
保藏號CCTCCM 209062


圖1為csuft F14菌株產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的顯色作用圖2為csuft F14菌株顯微觀察圖3為csuft F14菌株相對酶活。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。 實(shí)施例l:本發(fā)明菌株的篩選方法1) 平板初篩
采用平板涂布法。稱取10g采自湘江河岸的土樣，傾入90mL含玻璃珠的無菌水中，充 分振蕩20min后，在無菌環(huán)境下，移取lmL梯度稀釋至10、音濃度，取lml，涂布于加入了 PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；同時取lml，涂布于加入了牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。將 PDA培養(yǎng)基于26'C培養(yǎng)4d，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于3(TC培養(yǎng)2d，從培養(yǎng)基中挑取單菌落， 繼續(xù)純化，重復(fù)3次菌落特征一致，無異常菌落出現(xiàn)者，可認(rèn)為是單菌落，即完全純化。 挑取最后一次純化的平板上的單一菌落接種到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)保存，備用。
選取分離、純化后所得斜面菌種，在產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶篩選培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分甲 殼素10%， NaNO30.2%， KH2PO40.1%， K2HPO40.1%， MgS04 7H20 0.05%， PN0.05%， 瓊脂2%)上進(jìn)行培養(yǎng)。真菌培養(yǎng)4d，放線菌、細(xì)菌培養(yǎng)2d，取出觀察，根據(jù)產(chǎn)甲殼素脫乙 酰酶菌株周圍的顯色圈的深淺判斷菌株的產(chǎn)酶能力。篩選出甲殼素脫乙酰酶酶活力較高的 菌株9株。其中霉菌3株，放線菌2株，細(xì)菌4株。
2) 搖瓶復(fù)篩
平板初篩挑選出來的9株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，150ml三角瓶裝液發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成 分甲殼素(大于120目)1.5%, NaNO30.2%， K2HPO40.1%， KH2PO40.1%， MgSO40.05 %) 60ml， 30°C， 180rpm/min培養(yǎng)48h，用酶法測定濾液中的乙酸含量，通過測定乙酸含量的 高低反映酶活力。測得這9株菌株的甲殼素脫乙酰酶相對酶活力，見圖3， Z7菌株csuftF14 的相對酶活力最高。
試驗(yàn)和觀察的結(jié)果如下
一、 本發(fā)明菌株csuftF14的形態(tài)特征
該菌株為菌體呈短桿狀，染色均勻，具運(yùn)動性，兼性厭氧，可形成內(nèi)生芽孢，芽孢 囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，Gram染色陽性。在LB培養(yǎng)基上呈白色不透明 菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在多種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)色素。
二、 本發(fā)明菌株csuftF14的生理生化特征
可利用還原硝酸鹽；水解淀粉；可發(fā)酵D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，D-木糖；接 觸酶陽性；氧化酶陰性；硫化氫陽性；酯酶陽性；乙酸氧化陰性。
三、 本發(fā)明菌株csuftF14的分子鑒定
PCR擴(kuò)增和序列分析采用菌株基因組總DNA， 16SrDNA擴(kuò)增采用引物F27、 1541(上 海生工合成)。PCR反應(yīng)體系(25 U L): 10倍緩沖液2.5 u L， dNTP(各2.5mmo1 L")l u L,引 物各luL， Taq酶(5u' P !/1)0.25 ix L，模板DNA稀釋50倍后取2 U L(對照組加雙蒸水，其它條件同)，ddH20，18.25 u L。 PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min， 94。C變性30s， 55。C退火31min， 72。C延伸90s， 30個循環(huán)，最后72。C延伸10min， 4'C保存。
取4uLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工公司測序，所 測序列提交GenBank進(jìn)行同源性比較，采用鄰接法構(gòu)建出進(jìn)化樹。
菌株csuft F14的16s rDNA間隔區(qū)序列與GenBank接收號為EU855192.1的解淀粉芽 孢桿菌5ac/〃w awy/o/;^e/acz'e"j的16S rDNA相似性為99%。
實(shí)施例2:本發(fā)明菌株的應(yīng)用
將甲殼素加入發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分甲殼素(大于120目)1.5%，豆餅粉2.0%， 玉米粉2%，葡萄糖2%， NaNO30.2%， K2HPO40.1%， KH2PO40.1%， MgSO40.05%)中， 36°C， 160rpm/min，培養(yǎng)2天，發(fā)酵液過濾后加入10%NaOH溶液，邊加邊攪拌，至pH 值10-11，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，靜置后離心，將沉淀物用蒸餾水洗滌至pH值中性，離心， 收集沉淀物，烘干，即為殼聚糖制品。
權(quán)利要求
1、一種高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuft F14，其特征在于，所述的解淀粉芽孢桿菌csuft F14，保藏號為CCTCC M 209062。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14，其特征在 于所述的解淀粉芽孢桿菌csuftF14為革蘭氏陽性菌、具運(yùn)動性、兼性厭氧、菌體短桿狀、 形成內(nèi)生芽孢，芽孢卵圓形，孢囊膨大，游離芽孢表面著色弱，Gram染色陽性；在LB培 養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在LB培養(yǎng)基上不產(chǎn)色素，生長溫 度為28 30。C。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14，其特征在 于，所述的解淀粉芽孢桿菌CSuftF14具有以下生理生化特征還原硝酸鹽；水解淀粉；發(fā) 酵D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和D-木糖；接觸酶陽性；氧化酶陰性；硫化氫陽性；酯 酶陽性；乙酸氧化陰性。
4、 權(quán)利要求l所述的高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuftF14的應(yīng)用，其特征 在于，所述的解淀粉芽孢桿菌csuftF14用于制備生產(chǎn)殼聚糖的制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的解淀粉芽孢桿菌csuft F14及其應(yīng)用，該菌株保藏單位為CCTCC，保藏號為CCTCC M 209062。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是用該菌株生產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶，培養(yǎng)方法簡單，產(chǎn)酶活性高，有利于甲殼素脫乙酰酶的開發(fā)和利用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P19/04GK101544958SQ20091004306
公開日2009年9月30日 申請日期2009年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日
發(fā)明者何苑皞, 劉君昂, 劉高強(qiáng), 周國英, 宋光桃, 河 李, 琳 李, 章懷云 申請人:中南林業(yè)科技大學(xué)