專利名稱：一種β－甘露聚糖酶的基因序列及其編碼的重組酶的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β-甘露聚糖酶的基因序列，該基因編碼的重組酶的制備和含有該酶的制品。具體地說，本發(fā)明涉及編碼嗜堿芽孢桿菌(alkaliphilic Bacillus)N16-5的β-甘露聚糖酶DNA分子，涉及含有該酶基因的重組質(zhì)粒和表達相應(yīng)酶的重組菌株。
β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.1.78)是一種半纖維素酶，可以水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖(參見Tipdon，R.S.et al.Advances inCarbohydrate Chemistry and Biochemistry，32299-316，AcademicPress，New York，1976.)。甘露聚糖是自然界中存在的一種較為豐富的半纖維素資源，數(shù)量僅次于纖維素。豆科植物種子、針葉樹木材、綠色咖啡豆等都含有大量的甘露聚糖，一些植物膠，如田青膠、角豆膠、魔芋精粉等幾乎完全是由半乳糖或葡萄糖與甘露糖組成的甘露聚糖。利用β-甘露聚糖酶對上述植物材料進行深加工和綜合利用具有很大的應(yīng)用潛力，特別是在食品、醫(yī)藥方面具有重要性應(yīng)用價值，因為β-甘露聚糖酶可把植物甘露聚糖降解為甘露寡糖，甘露寡糖能促進人體腸道正常菌群的生長發(fā)育(參見Akino，T.et al.Agric.Biol.Chem.，52773-779，1988)，這對提高人體的健康水平具有重要意義。
β-甘露聚糖酶已從不同來源的的生物中分離，如芽孢桿菌、氣單孢菌、黃單孢菌、梭孢菌、青霉、木霉和鏈霉菌等(7)。相關(guān)的專利和文獻的出發(fā)點主要在于處理造紙工業(yè)中的半纖維素(參見Buchert et al.USP5,661,021 Aug.26，1997；Ratto，M.et al.Biotechnol.Letters，10661-664，1988；和Christgau et al.USP5,795,764 Aug.18，1998)，尚未有一種適合于甘露寡糖生產(chǎn)的β-甘露聚糖酶產(chǎn)品，其主要問題是酶活性復雜，底物水平低等，直接影響甘露寡糖的產(chǎn)率和收率。β-甘露聚糖酶水解植物甘露聚糖反應(yīng)在堿性條件下進行，可以增加半纖維素在水中的溶漲性，從而有利于酶的作用。目前已知的微生物β-甘露聚糖酶最適pH一般在酸性或中性范圍，日本研究的兼性嗜堿芽孢桿菌AM001，最適pH在8.5-9.0，并試圖進行甘露寡糖的酶法生產(chǎn)，對甘露寡糖的轉(zhuǎn)化率29％。另外，甘露聚糖酶基因的專利與文獻報道近年來較多(參見USP5,661,021和USP5,795,764)，但很少有嗜堿菌堿性β-甘露聚糖酶基因的報道。
本發(fā)明的一個目的是提供一種β-甘露聚糖酶基因。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備β-甘露聚糖酶的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供含有所述的β-甘露聚糖酶基因重組表達質(zhì)粒和重組菌株，并將其基因表達產(chǎn)物用于高效生產(chǎn)甘露寡糖。
本發(fā)明提供了一種編碼嗜堿芽孢桿菌N16-5的β-甘露聚糖酶的DNA分子，該β-甘露聚糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
按照本發(fā)明的DNA分子，其中，所述的DNA分子包括SEQ NO1 DNA序列。
本發(fā)明還提供了含有如上所述的DNA序列的重組表達質(zhì)粒。
按照本發(fā)明的重組表達質(zhì)粒，其中，所述的重組表達質(zhì)粒為含有以上所述的DNA序列的重組表達質(zhì)粒pMAN1和重組表達質(zhì)粒pMAN2。
本發(fā)明還涉及含有如上所述的重組表達質(zhì)粒的重組菌株，包括嗜堿芽孢桿菌N16-5菌株，大腸桿菌JM109菌株JM109MAN1和大腸桿菌JM109菌株JM109MAN2。
按照本發(fā)明的再一個方面，本發(fā)明提供了一種制備具有酶活性的β-甘露聚糖酶的方法，包括下述步驟(1)從嗜堿芽孢桿菌N16-5菌株中提取總DNA，經(jīng)限制酶部分水解，得到DNA片段，將其連接到pUC19載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得含β-甘露聚糖酶基因的重組表達質(zhì)粒pMAN1及重組大腸桿菌菌株JM109MAN1；(2)從重組表達質(zhì)粒pMAN1分離出含β-甘露聚糖酶基因的DNA片段，再經(jīng)限制酶部分水解，得到小片段DNA，將其連接到pUC19載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得含β-甘露聚糖酶基因的重組表達質(zhì)粒pMAN2及重組大腸桿菌菌株JM109MAN2。
附圖簡要描述


圖1為本發(fā)明的堿性β-甘露聚糖酶基因重組質(zhì)粒pMAN1構(gòu)建模式圖。
圖2為本發(fā)明的堿性β-甘露聚糖酶基因重組質(zhì)粒pMAN2構(gòu)建模式圖。
圖3為本發(fā)明的堿性β-甘露聚糖酶基因在大腸桿菌中的表達。
圖4為本發(fā)明的來自嗜堿芽孢桿菌N16-5的β-甘露聚糖酶DNA序列。
圖5為本發(fā)明的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細描述。
本發(fā)明是基于本發(fā)明的發(fā)明人的下述發(fā)現(xiàn)而完成的嗜堿芽孢桿菌N16-5在堿性條件下產(chǎn)生大量堿性β-甘露聚糖酶，該酶特別適于水解植物多糖形成甘露寡糖，如酶解魔芋粉等，寡糖轉(zhuǎn)化率達80％以上。
本發(fā)明從嗜堿芽孢桿菌N16-5分離得到β-甘露聚糖酶的基因，它是1479bp的DNA，其DNA序列圖如圖4所示(SEQ ID NO1)編碼一個由493個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列圖如圖5所示(SEQ ID NO2)。通過常規(guī)方法獲得了含有該基因的重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌使重組菌株表達β-甘露聚糖酶。因此本發(fā)明同時提供了一種可能性，即通過遺傳工程或分子生物學手段，將本發(fā)明涉及的酶基因克隆到嗜堿芽孢桿菌或其它受體菌，由嗜堿芽孢桿菌N16-5菌株或其它菌株或在其它培養(yǎng)條件產(chǎn)生本發(fā)明涉及的β-甘露聚糖酶。本發(fā)明涉及的β-甘露聚糖酶特別適合于甘露寡糖的酶解生產(chǎn)，也為利用魔芋多糖等為原料大量生產(chǎn)甘露寡糖提供了一種可能。
本發(fā)明涉及的β-甘露聚糖酶特別適合于甘露寡糖的酶解生產(chǎn)，為建立利用魔芋多糖等為原料，大量生產(chǎn)甘露寡糖的工藝，提供了一種可能。
為達到本發(fā)明的目的，制備本發(fā)明的β-甘露聚糖酶及其重組表達質(zhì)粒和重組菌株的方法包括如下步驟(1)從嗜堿芽孢桿菌N16-5中提取總DNA，經(jīng)限制酶部分水解，得到DNA片段，連接到pUC19載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得含β-甘露聚糖酶基因的重組質(zhì)粒pMAN1及重組大腸桿菌菌株JM109MAN1；(2)從重組質(zhì)粒pMAN1分離出含β-甘露聚糖酶基因的DNA片段，再經(jīng)限制酶水解，獲得小片段DNA，連接到pUC19載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得含β-甘露聚糖酶基因的重組質(zhì)粒pMAN2及重組大腸桿菌JM109MAN2。
在可使上述β-甘露聚糖酶基因表達的條件下培養(yǎng)該重組菌，在含有β-甘露聚糖的培養(yǎng)基上，菌落周圍形成透明圈，證明該重組菌表達β-甘露聚糖酶活性。該蛋白質(zhì)具有甘露聚糖酶活性，pI為4.3，最適pH9.5，最適溫度70℃，可高效水解植物甘露聚糖產(chǎn)生寡糖。測序表明，該酶結(jié)構(gòu)基因是1479bp的DNA，編碼一個由493個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
上述基因的表達產(chǎn)物，水解魔芋精粉，進行寡糖轉(zhuǎn)化。底物濃度5-15％，反應(yīng)溫度40-60℃，反應(yīng)pH 9-10，時間8-24小時，反應(yīng)結(jié)束后，以醋酸，檸檬酸或鹽酸調(diào)pH至5-6，加0.5-2％粉末或顆粒狀活性炭脫色。過濾即可得到甘露寡糖糖漿。寡糖轉(zhuǎn)化率80％以上，總收率70％以上，其中2-8糖占總糖的80％以上，該寡糖對于促進體內(nèi)雙歧桿菌的生長、提高人體健康水平具有重要作用。
本發(fā)明涉及的β-甘露聚糖酶是一新型的β-甘露聚糖酶。根據(jù)酶的氨基酸序列相似性，目前已知的β-甘露聚糖酶分屬于糖苷水解酶第5和26兩個家族(參見Ethier，N.et al.Appl.Environ.Microbiol.644428-4432，1998)。通過對本發(fā)明涉及的β-甘露聚糖酶基因推導的氨基酸序列比較分析，本發(fā)明涉及的β-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族中的一員，與其它已報道的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列相比，相似性小于60％。
本發(fā)明涉及的β-甘露聚糖酶的性能不同于已知的β-甘露聚糖酶，其最適pH和溫度，在迄今發(fā)現(xiàn)的β-甘露聚糖酶中是最高的。本發(fā)明提供了利用常規(guī)方法獲得此新型的β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)基因、重組表達質(zhì)粒和重組菌體模式，使本發(fā)明的β-甘露聚糖酶由其它菌株或在其它培養(yǎng)條件產(chǎn)生。同時，本發(fā)明提供了一種以魔芋精粉為原料，酶解生產(chǎn)甘露寡糖的有效方法，對甘露寡糖的轉(zhuǎn)化率可達80％。
本發(fā)明β-甘露聚糖酶具有如下特征(1)由嗜堿芽孢桿菌N16-5或其衍生菌產(chǎn)生，衍生菌是指轉(zhuǎn)化有本發(fā)明涉及的DNA片段的重組菌株；
(2)具有圖4所示的DNA序列編碼；(3)具有圖5所示的氨基酸序列；(4)其特性至少有下述的一種1)具有甘露聚糖酶活性，pI為4.3，最適pH9.0，最適溫度70℃，分子量51000道爾頓；2)具有甘露聚糖酶活性，pI為2.5，最適pH10.0，最適溫度70℃，分子量38000道爾頓；3)具有甘露聚糖酶活性，pI為2.5，最適pH9.0，最適溫度70℃，分子量34700道爾頓；(5)可高效水解植物多糖產(chǎn)生寡糖。
進一步地，本發(fā)明涉及一DNA分子，該DNA分子編碼本發(fā)明涉及的β-甘露聚糖酶，此DNA核苷酸序列(1)由圖4所示的DNA序列可編碼部分組成；(2)編碼一蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如圖所示的氨基酸序列。
下面通過實施例對本發(fā)明進行進一步詳細的說明。應(yīng)該理解的是，所述的實施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。實施例1嗜堿芽孢桿菌N16-5總DNA的提取采用從中國內(nèi)蒙烏杜淖堿湖分離的嗜堿芽孢桿菌N16-5，取其新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50mMTris緩沖液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mMEDTA(pH8.0)，混勻后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70％和無水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE緩沖液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保溫1小時，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70％和無水乙醇洗，真空干燥，用去離子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度計測定結(jié)果為A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。實施例2β-甘露聚糖酶基因的克隆取前面所述的總DNA溶液10μl(約50μgDNA)，用限制酶EcoRI部分水解，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到2-10kbDNA片段。取2μl(5μg)EcoRI酶解DNA片段與1μl(1μg)經(jīng)EcoRI酶解的質(zhì)粒pUC19DNA在20μl連接體系進行連接反應(yīng)，其中含2μl(10X連接緩沖液)，1μlT4DNA連接酶，14μl水。連接體系在16℃反應(yīng)16小時，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109后，涂于含Amp(氨芐青霉素)，IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)16-18小時，挑取白斑于含Amp和甘露聚糖的液體培養(yǎng)基或含Amp和甘露聚糖的固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18-20小時，能夠液化甘露聚糖或在含有β-甘露聚糖的固體培養(yǎng)基上形成透明圈的菌落，確定為陽性克隆(見圖3)。對陽性菌落用堿法提取重組質(zhì)粒，用各種限制酶水解重組質(zhì)粒，根據(jù)電泳結(jié)果證實有DNA片段插入質(zhì)粒，其大小約為8.0kb。含該DNA片段的重組質(zhì)粒稱為pMAN1(見
圖1)，含此重組質(zhì)粒pMAN1的重組大腸桿菌稱為大腸桿菌JM109MAN1。
此重組質(zhì)粒pMAN1可高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達β-甘露聚糖酶活性和抗氨芐性能。將重組質(zhì)粒中的DNA插入片段用地高辛DNA標記檢測試劑盒標記，與嗜堿芽孢桿菌N16-5的染色體DNA進行Southern blot DNA雜交實驗，證實重組質(zhì)粒pMAN1中插入的DNA片段來自嗜堿芽孢桿菌N16-15的染色體DNA。實施例3β-甘露聚糖酶基因的亞克隆和序列取10μ1的質(zhì)粒pMAN1中的插入DNA片斷在50μl體系中，進行各種限制酶酶解反應(yīng)，如AccI、HindIII、PstI、EcoRI和XbalI等的單或雙酶切反應(yīng)，37℃保溫1.5小時，瓊脂糖凝膠電泳純化回收DNA片段。如前所述方法，將得到的單一或雙酶解DNA片段連接到質(zhì)粒pUC19DNA或pGEM-4Z，形成一系列亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，相應(yīng)地獲得一系列重組大腸桿菌，培養(yǎng)后測其酶活，結(jié)果顯示含有HincII酶切DNA片段的重組大腸桿菌具有甘露聚糖酶活性，該HincII酶切DNA片段約為3.5kb。含該DNA片段的重組質(zhì)粒稱為pMAN2(見圖2)，含此重組質(zhì)粒pMAN2的重組大腸桿菌稱為大腸桿菌JM109MAN2。采用Sanger雙脫氧法對此DNA片段進行了測序。測序結(jié)果見圖4，HincII酶切DNA片段全長3419bp，含有一個長1479bp的開放閱讀框架(ORF)，由ATG起始密碼子開始，到ATT終止密碼子結(jié)尾。該完整的ORF編碼一個由492個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。實施例4.重組β-甘露聚糖酶的純化和特性重組菌 E.coli JM109MAN2的菌體懸于10mM甘氨酸緩沖液(pH9.6)中，利用超聲波破碎細胞，離心上清液為重組β-甘露聚糖酶的粗酶液。此上清酶液經(jīng)DEAE-Sephadex A-25離子交換柱層析，羥基磷灰石吸附柱層析和PAGE制備電泳等步驟進行純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質(zhì)化學標準方法測定此重組β-甘露聚糖酶的基本特性。用SDS-PAGE測得的重組酶的分子量為51000道爾頓，與理論上推算的分子量(54000道爾頓)相近；用PAGEIEF測得的重組酶的等電點pI為4..3；重組酶反應(yīng)的最適pH為9..5，最適溫度為70℃。高壓液相色譜法測得重組β-甘露聚糖酶水解魔芋粉產(chǎn)生2-8糖等一系列寡糖。實施例5重組β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉進行寡糖轉(zhuǎn)化2.5L反應(yīng)器中裝1.8L水，升溫至55℃，加入Na2CO34.8克，NaHCO33克，β-甘露聚糖酶1.8×104單位，魔芋粉180克。55℃保溫16小時。用HCl調(diào)pH至5.5-6.0，加入顆粒狀活性炭10克，升溫至100℃并保持5分鐘，冷卻至70℃進行過濾(普通工業(yè)濾布)，所得產(chǎn)物中2-8糖占總糖的80％以上，寡糖轉(zhuǎn)化率80％以上，收率70％以上(表1)。
表1，甘露寡糖組份變化(克/100ml)時間(h)總糖 寡糖 2-6糖轉(zhuǎn)化率09.4 // 049.2 1.72546％ 19％89.7 6.89470％ 71％169.6 8.17881％ 85％
權(quán)利要求
1.編碼嗜堿芽孢桿菌N16-5的β-甘露聚糖酶的DNA分子，該β-甘露聚糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于該分子包括SEQ NO1 DNA序列。
3.含有權(quán)利要求1所述的DNA序列的重組表達質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達質(zhì)粒，其特征在于該重組表達質(zhì)粒為含有權(quán)利要求1所述的DNA序列的重組表達質(zhì)粒pMAN1和含有 1所述的DNA序列的重組表達質(zhì)粒pMAN2。
5.含有權(quán)利要求3所述的重組表達質(zhì)粒的重組菌株。
6.如權(quán)利要求4所述的重組菌株，其特征在于所述的菌株包括嗜堿芽孢桿菌N16-5菌株，大腸桿菌JM109菌株JM109MAN1和大腸桿菌JM109菌株JM109MAN2。
7.一種制備具有酶活性的β-甘露聚糖酶的方法，包括下述步驟(1)從嗜堿芽孢桿菌N16-5菌株中提取總DNA，經(jīng)限制酶部分水解，得到DNA片段，將其連接到pUC19載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得含β-甘露聚糖酶基因的重組表達質(zhì)粒pMAN1及重組大腸桿菌菌株JM109MAN1；(2)從重組表達質(zhì)粒pMAN1分離出含β-甘露聚糖酶基因的DNA片段，再經(jīng)限制酶部分水解，得到小片段DNA，將其連接到pUC19載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得含β-甘露聚糖酶基因的重組表達質(zhì)粒pMAN2及重組大腸桿菌菌株JM109MAN2。
全文摘要
本發(fā)明公開了由嗜堿芽孢桿菌(alkaliphilicBacillus)N16－5總DNA獲得的堿性β－甘露聚糖酶基因(β－mannanase gene)及其制備方法,構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達β－甘露聚糖酶。通過核苷酸序列和氨基酸序列比較,該酶為一新型β－甘露聚糖酶。以該酶水解魔芋精粉等產(chǎn)生一系列寡糖,寡糖的總轉(zhuǎn)化率為80%以上,由此生產(chǎn)的甘露寡糖在功能食品上具有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N9/42GK1351169SQ0013006
公開日2002年5月29日 申請日期2000年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月26日
發(fā)明者馬延和, 薛燕芬, 劉洪燦, 周培瑾 申請人:中國科學院微生物研究所