專利名稱：：高耐受草甘膦的epsp合酶及其編碼序列的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新型高耐受草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)，以及編碼該合酶的核苷酸序列。
背景技術：
：草甘膦(glyphosate)為Monsanto公司產(chǎn)品1^皿(1叩中的主要活性成分，該除草劑是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導型優(yōu)秀除草劑，是全世界使用量最大的除草劑品種之一。但是，該除草劑也是一種非選擇性除草劑，對農(nóng)作物同樣有著殺死作用。為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用草甘膦，須培育出具有草甘膦抗性或降解性質(zhì)農(nóng)作物。草甘膦抑制植物莽草酸代謝過程中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)活性，進而阻斷芳香族氨基酸的生物合成而使植物死亡(S.R.Padgetteetal.，in〃e/^'w'ofe-力邵ects,S.O.Duke，Ed.(CRCPress,BocaRaton，F(xiàn)L，1996)，pp.53-84)，當前全球商業(yè)化種植的所有草甘膦抗性轉(zhuǎn)基因作物均為針對EPSP所設計，是目前商業(yè)化轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物的唯一作用機制。應用化學誘變細菌產(chǎn)生的aroA突變體，抗藥性機理研究確證了aroA基因是草甘膦作用靶標EPSP合酶的編碼基因。美國Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的編碼基因aroA及其抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物等方面已申請了100余份專利，獲得轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品種，其中大豆等多種轉(zhuǎn)基因作物己進入商品化生產(chǎn)。目前尚未見到在核苷酸水平與已報道的EPSP合酶編碼基因(3roA)同源性較低的抗草甘膦的EPSP合酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是發(fā)i見并人工合成新型高耐受草甘膦的EPSP合酶以及編碼該合酶的核苷酸序列，并將該序列轉(zhuǎn)入植物中，培育新型的高耐受草甘膦的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種新型高耐受草甘膦的EPSP合酶，如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，以及編碼該合酶的核苷酸序列，如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示。經(jīng)序列結(jié)構(gòu)分析和序列比較分析(見圖3)，顯示該EPSP合酶屬于I型EPSP合酶。本發(fā)明采集草甘膦極端污染環(huán)境中土壤樣品，用免培養(yǎng)方法從中分離群落水平總DNA，構(gòu)建群落水平總DNA粘粒文庫，并篩選草甘膦抗性轉(zhuǎn)化子；將轉(zhuǎn)化子點于含20mM草甘膦的M9固體培養(yǎng)基上篩選抗性轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明還進行了草甘膦耐受實驗，結(jié)果表明上述轉(zhuǎn)化子具有非常強的草甘膦耐受活性。本發(fā)明還進行了高耐受草甘膦的DNA片段的全核苷酸序列測定。分析結(jié)果表明，插入的片段大小為3151bp,其中包含了一個1335bp的閱讀框，其序列如SEQIDNO:2所示，它包含的核苷酸序列全長為1335個堿基，其開放讀框位于885-2220位，編碼全長為445個氨基酸的EPSP合酶(如SEQIDNO:l所示)。本發(fā)明對上述高耐受草甘膦的EPSP合酶基因進行了人工合成，其序列如SEQIDNO:3所示。將人工合成的5'和3'端酶切位點為SflwHI和7//mffll位點EPSP基因，用于表達高耐受草甘膦的EPSP合酶以及構(gòu)建相應的基因植物表達載體。將上述人工合成的EPSP基因，用BawHI和歷'"dIII酶切后，連入相同酶切的載體pET28a得到重組質(zhì)粒pETGR-79并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Promega公司)。本發(fā)明還進行了EPSP的酶活測定和動力學參數(shù)的測定，酶活性為10.477U/mg。Kj/Km為2.16。根據(jù)動力學參數(shù)可知，GR-79EPSP不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保持著與PEP較強的親和性，這些特性將為用于轉(zhuǎn)基因作物的培育提供可能。本發(fā)明構(gòu)建了高耐受草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體，利用葉盤法轉(zhuǎn)化構(gòu)建抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因煙草，經(jīng)草甘膦抗性梯度實驗證明，轉(zhuǎn)基因植物能在含20mM草甘膦的培養(yǎng)基上良好生長。本發(fā)明還提供了一種重組載體，它包含SEQIDNO:2所述的DNA。本發(fā)明用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，這些宿主包括原核細胞，也包括真核細胞。本發(fā)明還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術將SEQIDNO:2轉(zhuǎn)化入植物的方法，以提高植物對草甘膦抗性，其步驟如下(1)將SEQIDNO:l或SEQIDNO:2所示序列可操作地連于植物表達調(diào)控序列，形成植物表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入植物細胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。上述"可操作地連于"表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。上述載體可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在本發(fā)明中，EPSP合酶編碼基因指編碼具有SEQIDNO:l蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO:2同源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQIDN0:2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQIDNO:2核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQIDNO:2中的核苷酸序列的同源性至少89%,較佳地至少80%，更佳地至少卯％，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與天然的SEQIDNO:l相同功能的蛋白的SEQIDNO:2中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地l-60個，更佳地l-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5，和/或3，端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，SEQIDNO:l蛋白還包括具有與SEQIDNO:l的相同功能的變異形式。這些變異形式包括但并不限于若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地卜20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氦基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括SEQIDNO:l蛋白的活性片段和活性衍生物。所述多肽的變異形式包括同源序列、EPSP合酶保守性變異多肽、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與SEQIDNO:2雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用SEQIDNO:l多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。上述"EPSP合酶保守性變異多肽"指與SEQIDNO:l的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽可以根據(jù)表l進行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1氨基酸替換表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1是GR-79克隆草甘膦抗性分析圖，圖中GR-79-ER菌株是土壤總DNA部分酶切后與載體pACYC184連接后轉(zhuǎn)化入EPSP合酶缺陷型大腸桿菌ER2799菌株(NEB公司)后獲得的草甘膦抗性菌株。CP4-ER菌株是將來源于取cp4的EPSP合酶基因與載體pACYC184連接后轉(zhuǎn)化入EPSP合酶缺陷型大腸桿菌ER2799菌株(NEB公司)后獲得的草甘膦抗性菌株。本圖中作為陽性對照。pACYC184-ER是含有pACYC184質(zhì)粒(NEB公司)的EPSP合酶缺陷型大腸桿菌ER2799菌株。本實驗中作為陰性對照。本圖是將三株菌株分別接入到含有O，20，50，80，100，120，150，200，250，300mM草甘膦濃度的限制性培養(yǎng)基M9中，經(jīng)過37'C、36h的搖床培養(yǎng)后，測定菌液在OD600時的吸光度值，所繪制而成。圖中可見菌株GR-79-ER在含有250mM濃度的草甘膦的限制性培養(yǎng)基中能夠生長，說明該菌株草甘膦抗性能達250mM。說明質(zhì)粒上攜帶的外源片段能夠?qū)θ毕菪途闑R2799進行功能互補。而陰性對照菌株不能在限制性培養(yǎng)基中生長，不能對缺陷型菌株進行功能互補。陽性對照菌株草甘膦抗性達200mM。圖2是GR-79的EPSP合酶在不同時間的蛋白表達。GR-79菌株中的EPSP合酶基因與pET28a載體連接后轉(zhuǎn)入BL21中，在IPTG的誘導下進行蛋白表達，取樣時間分別間隔一小時。樣品經(jīng)過煮沸后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離。結(jié)果顯示該菌株在4小時的蛋白表達量就已經(jīng)達較高程度。表達的蛋白為可溶性蛋白。大小約45kD。圖3是GR-79氨基酸序列與報道的ClassI和ClassII典型類型的氨基酸序列的比較。比較結(jié)果顯示GR-79的氨基酸序列屬于ClassI類型的EPSP合酶。并且GR-79的EPSP合酶是一種具有草甘膦抗性的I型酶。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，而不用于限制本發(fā)明的范圍。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規(guī)條件。實施例l高耐受草甘膦的DNA片段克隆1、草甘膦極端污染環(huán)境中土壤樣品的采集從被50%左右草甘膦污染達十年以上的土壤中(河北某化工有限公司草甘膦生產(chǎn)工廠開放式分裝點)采集土壤樣品。2、采用免培養(yǎng)方法從草甘膦極端污染土壤樣品中分離群落水平總DNA稱取草甘膦污染土壤樣品2克，加入0.6g細玻璃珠(dO.llmm)，4000轉(zhuǎn)/分振蕩2次。加入300u12%SDS+12%苯酚Tris緩沖液(pH8.0)溶液冰上1小時，加入等量苯酚Tris緩沖液，pH8.0(約700ml)，充分混勻，經(jīng)4°C，13，OOO卬m離心5分鐘。上層溶液加入0.1倍體積的3MNaAcpH5.2，混勻后加入0.6倍體積異丙醇混勻。DNA沉淀溶于200u1lxTE(粗DNA)。稱100mg氯化銫置于一個新的1.5mlEpp.離心管中，加入100U1粗DNA輕輕混勻，室溫黑暗條件下靜置1-3小時。室溫，13，OOOrpm，離心20分鐘。上清液中加入400ul無菌去離子水和300ul異丙醇，室溫靜置30分鐘。室溫，13，OOOrpm，離心20分鐘。沉淀溶于100lUlxTE和40ul8M醋酸鉀(KAc)，室溫靜置15分鐘。4'C，13，OOOrpm離心15分鐘。上清液加入0.6倍體積異丙醇混勻。室溫靜置30分鐘。室溫，15，OOOrpm離心20分鐘。DNA沉淀溶于100U1lxTE。采用Wizardspincolumnclean-up分離試劑盒純化DNA樣品。純化DNA溶于總體積為lOOul的lOmMTris-EDTA(pH8.0)緩沖液中。3、群落水平總DNA粘粒文庫的構(gòu)建土壤細菌DNA用Sfl"3AI在lOul反應體系進行部分酶切試切，Sflw3AI酶按1:100稀釋，37°C，分別酶切10min，20min，30min，40min，50min，60min后加入10Xloadingbuffer1P1終止反應，電泳檢測最適酶切反應時間。而后選擇相同的體系酶切30min進行大量酶切。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收26kbDNA片段備用。質(zhì)粒載體pACYC184(NEB公司)用SamHI完全酶切后用SAP堿性磷酸脂酶進行末端去磷酸化，以減少載體自連。上述回收后的土壤細菌DNA(200ng)和末端去磷酸化的質(zhì)粒載體pACYC184(150ng)用2U的T4ligase在4。C下連接16h。上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliER2799(NEB公司)電擊感受態(tài)細胞，涂布LB+Cmr。然后將LB板上生長的克隆影印到M9+Cmr+50mM草甘膦的平板，37。C培養(yǎng)48h。將平板上生長的菌經(jīng)LB平板劃線培養(yǎng)后，將這些菌落再接種到含不同草甘膦濃度的M9平板上(100，150mM草甘膦)。將這些重組菌中的質(zhì)粒抽提后重新轉(zhuǎn)化ER2799后涂布M9+Cmr平板驗證(ER2799+pACYC184為對照)，同時進行重組質(zhì)粒酶切驗證。4、篩選草甘膦抗性轉(zhuǎn)化子將轉(zhuǎn)染細菌涂布含Cm(氯霉素)、的LB平板上，37。C培養(yǎng)20h后，約有5000個菌落生長，將這些菌落影印到含Cmr和50mM草甘膦的M9平板上培養(yǎng)48h后，有三個菌落生長。將這三個菌落接種到含100mM、150mM的草甘膦的M9平板上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有1個克隆能在含150mM的草甘膦的M9平板上生長，其所含的質(zhì)粒被命名為pACYCGR-79。從該克隆抽提的質(zhì)粒pACYCGR-79轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2799(NEB公司)或大腸桿菌JM1098(Promega公司)中，將轉(zhuǎn)化子用無菌牙簽點于含20mM草甘膦的M9固體培養(yǎng)基上檢驗抗性，結(jié)果證明這個克隆所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子均具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性確實是由于轉(zhuǎn)入pACYCGR-79引起的。5、草甘膦耐受實驗將大腸桿菌ER2799(含攜帶有新克隆的pACYCGR-79質(zhì)粒)接種到含0200mm草甘膦的M9液體培養(yǎng)基(Cmr)中，經(jīng)過37'C、36h的搖床培養(yǎng)后，測定培養(yǎng)物的OD600。同時以無插入片段的質(zhì)粒的大腸桿菌ER2799為陰性對照。結(jié)果將ER2799(攜帶pACYCGR-79質(zhì)粒)接種到含0300mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基(Cmr)中，經(jīng)過37'C、36h的搖床培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)陰性對照在M9中幾乎不能生長；而ER2799(pACYCGR-79)在含有250mM草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中還能生長(見圖1)。這一結(jié)果說明pACYCGR-79上攜帶的外源片段具有非常強的草甘膦耐受活性。而帶有CP4質(zhì)粒陽性對照菌只能在200mM的液體培養(yǎng)基中生長。實施例2高耐受草甘膦的DNA片段的序列分析及其EPSP合酶功能驗證1、高耐受草甘膦的DNA片段的序列分析對實施例1中所亞克隆的高耐受草甘膦DNA片段進行全核苷酸序列測定。分析結(jié)果表明，插入的片段大小為3151bp，其中包含了一個1335bp的閱讀框，其序列如序列1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1335個堿基，其開放讀框位于885-2220位，編碼全長為445個氨基酸的EPSP合酶。將所亞克隆的高耐受草甘膦編碼序列與已報道的EPSP合酶編碼基因(woA)比較，在核苷酸水平同源性較低。氨基酸序列同源性分析結(jié)果表明，GR-79氨基酸序列與已報道的典型的I型EPSP合酶的氨基酸同源率均高于該酶與II型EPSP合酶的氨基酸序列的同源率，并且GR79氨基酸序列中不含有n型酶中典型的保守氨基酸區(qū)段，而含有的保守氨基酸區(qū)段類似于I型酶。說明GR-79EPSP屬于I類EPSP。GR-79EPSP與典型的I型和II型EPSP合酶的系統(tǒng)發(fā)育比較結(jié)果，如圖3所示。實施例3高耐受草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成根據(jù)已完成的含1335bp編碼區(qū)的核苷酸序列，首先分8個區(qū)段分別根據(jù)正鏈和副鏈序列，分別合成出長度約150-200bp、具有粘性末端的單鏈寡核苷酸片段。將正鏈和副鏈各一一對應的8個互補的單鏈寡核苷酸片段分別退火，形成8個帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段?；旌想p鏈寡核苷酸片段，經(jīng)T4DNA連接酶催化組裝成一個完整的EPSP合酶基因。該合成的DNA片段含有SEQIDNO:2中1-335位的核苷酸序列，并且合成基因的上下游兩端含5fl附HI和///"dill位點。如SEQIDNO:2所示。將上述人工合成的5'和3'端酶切位點為^附111和///^1111位點￡3基因，用于表達高耐受草甘膦的EPSP合酶以及構(gòu)建相應的基因植物表達載體。實施例4高耐受草甘膦的EPSP表達上述人工合成的5'和3'端酶切位點為5awHI和///"dill位點EPSP基因，用5awHI和歷"dIII酶切后，連入相同酶切的載體pET28a(NEB公司)得到重組質(zhì)粒pETGR-79并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Promega公司)。將轉(zhuǎn)化子先在LB+Kmr培養(yǎng)基中37°C，200rpm培養(yǎng)至OD600值約0.5，加入IPTG(終濃度為0.75mmol/L)后轉(zhuǎn)入37XH秀導蛋白表達，SDS-PAGE電泳檢測。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，含有pETGR-79的大腸桿菌BL21(DE3)(Promega公司)在37'C經(jīng)IPTG誘導4h后表達量即達到最高值。目的蛋白為可溶性蛋白；大小約45kD，與預測值相符(見圖2)。實施例5EPSP的酶活測定和動力學參數(shù)的測定1、測定方法無機磷標準曲線lOmM無機磷標準液按1:10稀釋，分別取0、1、2、3…20ul于1.5mlEppendorf離心管中，加入milli-Q純水至100u1混勻，加入MAT溶液0.8ml混勻，計時三分鐘后加入34%SC溶液100u1迅速混勻，室溫靜置20min后測定OD660值。重復三次。以無機磷濃度為橫坐標，OD660值為縱坐標作圖得到無機磷標準曲線。1)酶活測定酶粗提物蛋白定量采用考馬斯亮藍G-250染色法(Bradford,1976)。在冰上于1.5mlEppendorf離心管中加入以下溶液10mMPEP溶液2u1，10mMS3P溶液2u1，0.5MHEPES溶液2P1，lmM(NH4)6M07024*4H20溶液2P1禾卩milli-Q純水12u1混勻，于28'C溫浴5min后各管樣品間隔2S加入1u1粗酶液并計時，2min后再間隔2S依次加入200u1MAT溶液，顯色3min后再間隔2S依次加入20P134%SC溶液迅速混勻，室溫顯色20min后測定OD660值。對照除不加酶液外，其余同樣品管。樣品管與對照管的OD660值相減后，對照無機磷標準曲線即可求得反應釋放出的無機磷摩爾量，再除以反應時間和酶蛋白量就得到該酶的酶活力(U/mg)。2)半抑制劑量(IC50)測定上述反應液中添加0、10-3、10-2、10-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力數(shù)據(jù)以草甘膦濃度為X軸，采用對數(shù)坐標，以反應速度V(U/mg)為Y軸作圖。3)Km(PEP)測定將S3P溶液濃度恒定于lmM，在不同PEP濃度(0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM)下按上述反應體系測定酶反應速度，所測數(shù)值按V-v/[S](Eadic-Hofstee)法作圖。Ki(glyphosate)測定在不同草甘膦濃度(0、10、50、100uM)下測定PEP濃度為66.7、100、200、500nM時EPSP的酶反應速度。采用雙對數(shù)作圖，得到1/V-1/[S]直線，再將各直線的斜率作為縱坐標，草甘膦濃度作為橫坐標得到一條新的直線，該直線與X軸的交點即為Ki(glyphosate)值。2、結(jié)果GR-79EPSP的酶活性為10.477U/mg，GR-79EPSP測定如表2所示表2GR-79EPSP的動力學參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>根據(jù)GR-79EPSP的動力學參數(shù)可知，GR-79EPSP不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保持著與PEP較強的親和性，這些特性將為將GR-79EPSP用于轉(zhuǎn)基因作物的培育提供可實施例6高耐受草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體的構(gòu)建高耐受草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體構(gòu)建的具體方法如下A,pBI121(ClonTech公司)和pCAMBIA2301(ClonTech公司)用州力dIII和五coRI雙酶切，將pBI121帶有p35S-GUS-Nos-ter的片段連入pCAMBIA2301，形成中間載體p35S-2301-GUS;B.用力al和雙切p35S-2301-GUS和上述人工合成的EPSP基因，用EPSP置換p35S-2301-GUS相應酶切位點的GUS，從而獲得高耐受草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體。再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，用于轉(zhuǎn)化模式植物煙草。實施例7利用葉盤法轉(zhuǎn)化構(gòu)建抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因煙草(1)用無菌牙簽挑取YPE選擇平板上的實施例5中制備的陽性克隆，接種于2MLYPE液體(Smr，Kanr)，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；(2)室溫下4，OOOg離心IO分鐘；(3)棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌體的OD600在0.5左右；(4)取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約lcm2見方的小葉片；(5)將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無菌濾紙上吸干菌液；把經(jīng)浸染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28"C暗培養(yǎng)48小時；(6)將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA1.Omg/l+NAA0.lmg/l+Kan50mg/l+羧節(jié)青霉素250mg/l)上，25-28。C光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；(7)約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/l+Kan25mg/l)上進行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；(8)待根系發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始幾天用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，轉(zhuǎn)移至在含10mM的草甘膦的固體培養(yǎng)基中篩選草甘膦抗性的植株。(9)抗性植株經(jīng)Southern、Northern雜交以及Westhernblot驗證為轉(zhuǎn)基因的抗性植株。(10)在溫室中經(jīng)草甘膦抗性梯度實驗證明，轉(zhuǎn)基因植物能在含20mM草甘膦的培養(yǎng)基上良好生長。12序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所<120>高耐受草甘膦的EPSP合酶及其編碼序列<130>07-13<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>445<212>PRT<213>未知<400>1MetSerHisSerThrSerArgSerProTrpSerLysAlaThrGluTyr151015HisGluAlaLeuValThrProThrSerAsnLyslieAsnGlyGlulie202530PheValProGlySerLysSerTyrThrAsnArgAlaLeulielieAla354045AlaLeuAlaGluGlyThrSerThrLeuLysGlylieLeuLysSerAsp505560AspSerTyrTrpCyslieAspAlaLeuArgArgLeuGlylieLyslie65707580GluValAlaGluGluThrValThrlieHisGlyCysGlyGlyLysTrp859095ProValGinSerAlaGluLeuPhelieGlyAlaAlaGlyThrlieAla100105110ArgPheLeuProGlyAlaLeuAlaValAlaGinGinGlyGluTrplie115120125ValAspGlyValProGinLeuArgGluArgProLeuLysProLeuVal130135140AspAlaLeuThrGinLeuGlyGlyArglieGluTyrLeuThrGluHis145150155160ProGlyLeuProLeuArgValLysGlyAlaGlyLeuSerGlyGinHis165170175ValArgValProGlyAsnValSerSerGinPheLeuSerGlyLeuLeu180185190lieAlaSerProTyrAlaSerGluAlaValSerlieGluVallieAsn195200205GlyLeuValGinProSerTyrlieAlalieThrHeGinLeuMetArg210215220GluPheGlyAlaLysValGluHisAsnGluAspTyrSerLeuPheLys225230235240ValTyrProThrGlyTyrGinGlyArgAspThrlieLeuGluAlaAsp245250255AlaSerThrAlaCysTyrPheLeuSerLeuAlaAlaLeuThrGlyGly260265270ThrlieGinValLysAsnValGlyTyrHisSerTyrGinProAspAla275280285ArgPhelieAspValLeuGluGinMetGlyCysGluValHeLysAsn290295300GluSerPheLeuGluValThrGlyProThrArgLeuLysGlyGlyPhe305310315320GluValAspMetLysProMetSerAspGinAlaLeuThrlieGlyAla325330335LeuAlaProPheAlaAspAlaProlieArgValThrAsnValAlaHis340345350HeArgAlaHisGluSerAspArglieAlaVallieCysSerSerLeu355360365GinGinMetGlyValGinValGluGluArgGluAspGlyPheThrlie370375380TyrProGlyGinProValGlyThrThrLeuAsnProHisAspAspHis385390395400ArgAsnAlaMetValPheGlyLeuLeuGlyValLysValProHislie405410415ArglieValAspProGlyCysValSerLysThrCysProAlaTyrPhe420425430GluGluLeuGinLysPheGlylieHisValGluTyrAsn16435440445<210>2<211>1335<212>DNA<213>未知<400>2atgtcacattctacctctaggtccccatggtccaaggctactgagtaccatgaggcactt60gtaacaccaacctcgaacaagattaacggtgaaatatttgtacctggctcaaagagctat120accaatcgagctctaatcattgctgctttagcagaggggacttctacacttaagggaata180ttaaagagtgatgattcctactggtgtattgatgccttaaggaggcttggcattaagatc240gaggttgccgaagagacggtcaccatteatggctgtggaggaaaatggccagttcaatct300gcagagctttttattggggctgcaggtaccattgcccgcttccttccaggagccttagct360gttgcccagcaaggggagtggatcgtagatggggttccacaactgcgagaaagaccatta420aaacctttagtggatgccttaactcagcttggtggtagaatagagtatctgactgagcat480ccgggtctgcctttacgagtaaagggggcaggtctaagtggacagcatgtaagggtgcca540ggaaatgtctctagccaatttttaagtggtttattaatcgccagtccttatgcctcagaa600gctgtcagcattgaggtaatcaatggactcgttcaaccgtcttacattgccattacgatt660cagttaatgagagaatttggtgccaaagtggagcataatgaggattacagtctctttaag720<image>imageseeoriginaldocumentpage18</image>accaaccgcgctctcateattgctgctttggccgaggggacttctacccttaagggaatc180ttgaagagtgatgattcctactggtgcattgatgccttgaggaggcttggcattaagato240gaggttgccgaggagaccgtgaccattcatggctgcggaggaaagtggccagttcaatct300gccgagcttttcattggggctgccggtaccattgcccgcttccttccaggagccttggct360gttgcccagcaaggggagtggatcgtggatggggttccacaactccgcgagagaccattg420aagcctttggtggatgccttgactcagcttggtggtagaatcgagtacctcactgagcat480ccgggtctccctttgcgcgtgaagggagctggtctcagtggacagcatgtgagggtgcca540ggaaacgtgtctagccaattcttgagtggtttgttgatcgccagtccttacgcctcagag600gctgtgagcattgaggtgatcaacggactcgttcaaccgtcttacattgccattaccatt660cagttgatgagagagttcggtgccaaggtggagcataacgaggattacagtctcttcaag720gtttaccctactggataccaaggtcgtgataccatccttgaggccgatgcttcaaccgcc780tgctacttcctctccttggccgcgttgactggaggtaccatccaggtgaagaacgttggc840taccattcgtaccagccagatgctcgtttcattgatgtgttggagcaaatgggctgcgag900gtgattaagaacgagtcattcctcgaggttaccggcccaacccgcttgaagggtggcttc960gaggtggatatgaagcctatgtctgaccaagccttgaccatcggcgccttggctcctttc1020gccgatgccccgattcgcgtgaccaacgtcgctcacattagggctcatgagtcagaccgc1080atcgctgttatttgctcctcgttgcagcagatgggagttcaggtggaggagagagaggat1140ggcttcactatctacccaggtcagccagtgggtaccacccttaaccctcatgatgatcat1200cgtaacgccatggtgttcggtttgcttggagtgaaggtgccacatattagaatcgtggac1260ccgggttgcgtgtctaagacctgcccagcctacttcgaagagctccagaagttcggaatc1320catgtggagtacaac133權利要求1.一種高耐受草甘膦的EPSP合酶的氨基酸序列，如SEQIDNO1所示。2.編碼權利要求1所述氨基酸序列的DNA序列，如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示。3.包含權利要求2所述SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的DNA序列的重組載體。4.用權利要求3所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，包括原核細胞和真核細胞。5.權利要求2所述的DNA序列用于培育高耐受草甘膦植物的用途。全文摘要本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種新型高耐受草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)，以及編碼該合酶的核苷酸序列。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的EPSP合酶編碼基因與已報道的EPSP合酶同源性低。實驗證實，將本發(fā)明所述基因在植物中表達后，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物對草甘膦具有增強的耐受性。文檔編號C12N9/00GK101429499SQ200710177090公開日2009年5月13日申請日期2007年11月9日優(yōu)先權日2007年11月9日發(fā)明者平淑珍,維張,亮李,敏林,梁愛敏,偉陸,明陳申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所