專利名稱：：高抗草甘膦的epsp合酶及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及從采用免培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的群落水平DNA庫中分離的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種具有抗草甘膦抗性的酶。
背景技術(shù)：
：草甘膦(Glyphosate)為內(nèi)吸傳導(dǎo)型、廣譜滅生性除草劑，其作用機(jī)制是通過抑制植物體內(nèi)5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，干擾植物體內(nèi)芳香族氨基酸的生物合成，導(dǎo)致植物死亡。應(yīng)用化學(xué)誘變細(xì)菌產(chǎn)生的突變體，抗藥性機(jī)理研究確證了基因是草甘膦作用靶標(biāo)EPSP合酶的編碼基因。近年來包括美國和中國在內(nèi)的國家，草甘膦產(chǎn)量急劇增加還與系列轉(zhuǎn)基因抗草甘膦品種的選育和大面積的推廣有直接的關(guān)系。美國Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的編碼基因『"及其抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物等方面已申請了100余份專利，獲得轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品種，其中大豆等多種轉(zhuǎn)基因作物已進(jìn)入商品化生產(chǎn)。我國在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物方面的研究己取得一定進(jìn)展，但目前尚無轉(zhuǎn)抗草甘膦基因作物進(jìn)入商品化階段的報(bào)道。同時，由于沒有配套出口轉(zhuǎn)基因抗除草劑種子的優(yōu)勢和抗草甘膦基因?qū)＠?，與國外大公司在市場銷售競爭中處于極為不利的地位。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的抗草甘膦的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(簡稱為"EPSP合酶")以及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在提高植物抗草甘膦抗性方面的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的EPSP合酶多肽，它包含具有SEQIDN0:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDNO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(較佳地1-20個，更佳地1-10個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼上述EPSP合酶多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQIDNO:1中1-1287位的序列;(b)具有SEQIDNO:1中1-1290位的序歹廿。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有活性的多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種改變植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDN0:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了本發(fā)明的EPSPS的核苷酸序列(SEQIDN0:1)。圖2顯示了本發(fā)明的EPSPS的氨基酸序列(SEQIDN0:2)。圖3顯示了本發(fā)明的EPSPS與II類EPSPS的比對結(jié)果。其中星號代表相同的氨基酸；句號標(biāo)記保守的氨基酸；冒號標(biāo)記十分保守的氨基酸；陰影標(biāo)記的區(qū)域表示與草甘膦抗性和維持PEP綁定相關(guān)的重要區(qū)域。圖4顯示了本發(fā)明RDEPSPS與部分I類和II類EPSPS的系統(tǒng)發(fā)育比較圖。圖5顯示了RDEPSPS的草甘膦耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6顯示了本發(fā)明EPSPS的SDS-PAGE電泳結(jié)果，其中泳道如下泳道1:M;泳道2:未誘導(dǎo)RDEPSPS蛋白泳道3:IPTG誘導(dǎo)的RDEPSPS。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從采用免培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的群落水平DNA庫中分離獲得了一種新的EPSP合酶，并且通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了它具有高抗草甘膦抗性，并且轉(zhuǎn)入植物后，可導(dǎo)致植物抗草甘膦抗性的提高。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。在本發(fā)明中，術(shù)語"EPSPS"、"EPSP合酶"、"EPSP合成酶""EPSP多肽"或"5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶"可互換使用，都指具有5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)氨基酸序列(SEQIDN0:2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的EPSP合酶或多肽"是指EPSP多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化EPSP合酶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括EPSP合酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然EPSP合酶相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語"EPSP多肽"指具有EPSP合酶活性的SEQIDNO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與EPSP合酶相同功能的、SEQIDNO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為l-50個，較佳地1-30個，更佳地l-20個，最佳地l-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為IO個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與EPSPSDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了EPSP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EPSP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約IOO個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供EPSP合酶或多肽的類似物。這些類似物與天然EPSP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到。在本發(fā)明中，"EPSP合酶保守性變異多肽"指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表l進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDN0:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDN0:2的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:l所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指(l)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50。/。(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼EPSP合成酶的多聚核苷酸。本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明的EPSPS核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂萌斯ず铣伞CR擴(kuò)增法、或重組法的方法獲得。例如首先根據(jù)SEQIDNO:l的序列進(jìn)行全序列合成。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用人工合成的EPSPS核苷酸全長序列或其片段作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或EPSP合酶編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984;224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的EPSP多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼EPSP多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，EPSP合酶多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語"重組表達(dá)載體"指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含EPSP合酶編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)m脂A合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌;真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl^法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得抗草甘膦抗性提高的植物。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。另一方面，本發(fā)明還包括對EPSP合酶DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與EPSP合酶基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制EPSP合酶的分子，也包括那些并不影響EPSP合酶功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的EPSP合酶基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的EPSP合酶基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)EPSP合酶或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用.EPSP合酶基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與EPSP合酶基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如KCoh')中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。抗EPSP合酶的抗體可用于檢測樣品中的EPSP合酶。多克隆抗體的生產(chǎn)可用EPSP合酶或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測EPSP合酶水平的測試方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。一種檢測檢測樣品中是否存在EPSP合酶的方法是利用EPSP合酶的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與EPSP合酶特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在EPSP合酶。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(niicroarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于基因的表達(dá)分析。用EPSP合酶特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測EPSP合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQIDN0:2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從采用免培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的群落水平DNA庫中分離的并人工全合成的。其序列如SEQIDN0:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1290個堿基，其開放讀框位于1-1287位，編碼全長為429個氨基酸的EPSP合酶(SEQIDN0:2)。本發(fā)明的該EPSP合酶被簡稱為"RDEPSPS"。本發(fā)明的EPSP合酶具有如下主要特點(diǎn).-A)草甘膦抗性功能明確，且顯示了高于以前報(bào)道的抗草甘膦能力；B)結(jié)構(gòu)新，在核酸水平上與已見報(bào)道的EPSP合酶編碼基因無明顯同源性，在氨基酸水平上與其他EPSP合酶的同源性也較低。本發(fā)明的EPSP合酶為改變植物的抗草甘膦抗性提供了新的途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。可以通過將EPSP合酶的編碼基因?qū)?，改變現(xiàn)有優(yōu)良農(nóng)作物品種的抗草甘膦抗性，可獲得抗草甘膦的小麥、水稻或其它農(nóng)作物品種，解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在的實(shí)際問題。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l:髙抗草甘膦的DNA片段克隆1、草甘膦極端污染環(huán)境中土壤樣品的采集自然環(huán)境中特別是在長期使用草甘膦等除草劑地區(qū)的土壤中，存在種類繁多的能耐受草甘膦或其它除草劑的細(xì)菌菌株。從被50%左右草甘膦污染達(dá)十年以上的土壤中(河北某化工有限公司草甘膦生產(chǎn)工廠開放式分裝點(diǎn))采集樣品。2、采用免培養(yǎng)方法從草甘膦極端污染土壤樣品中分離群落水平總DNA稱取草甘膦污染土壤樣品2克，加入0.6g細(xì)玻璃珠(cKO.llmm)，4000轉(zhuǎn)/分振蕩2次。加入3002%SDS+12%苯酚Tris緩沖液(pH8.0)溶液冰上1小時，加入等量苯酚Tris緩沖液,pH8.0(約700ml)，充分混勻，經(jīng)4°C，13,000rpm離心5分鐘。上層溶液加入0.1倍體積的3MNaAcpH5.2，混勻后加入0.6倍體積異丙醇混勻。DNA沉淀溶于200lUlxTE(粗DNA)。稱100mg氯化銫置于一個新的1.5mlEpp.離心管中，加入100ul粗DNA輕輕混勻，室溫黑暗條件下靜置1-3小時。室溫，13，000rpm，離心20分鐘。上清液中加入400u1無菌去離子水和300u1異丙醇，室溫靜置30分鐘。室溫，13，000rpm，離心20分鐘。沉淀溶于100u1lxTE和40ul8M醋酸鉀(KAc)，室溫靜置15分鐘。4°C，13,000rpm離心15分鐘。上清液加入0.6倍體積異丙醇混勻。室溫靜置30分鐘。室溫，15，000rpm離心20分鐘。DNA沉淀溶于100ullxTE。采用Wizardspincolumnclean-up分離試劑盒純化DNA樣品。純化DNA溶于總體積為100lU的10mMTris-EDTA(pH8.0)緩沖液中。3、群落水平總DNA粘粒文庫的構(gòu)建土壤細(xì)菌DNA用Sm/3AI在10|nl反應(yīng)體系進(jìn)行部分酶切試切，Saw3AI酶按1:100稀釋，37°C，分別酶切10min，20min,30min,40min，50min,60min后加入10Xloadingbufferlpl終止反應(yīng)，電泳檢測最適酶切反應(yīng)時間。而后選擇相同的體系酶切30min進(jìn)行大量酶切。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收26kbDNA片段備用。質(zhì)粒載體pACYC184(購自NEB公司)用5amHI完全酶切后用SAP堿性磷酸脂酶進(jìn)行末端去磷酸化，以減少載體自連。上述回收后的土壤細(xì)菌DNA(200ng)和末端去磷酸化的質(zhì)粒載體pACYC184(150ng)用2U的T4ligase在4°C下連接16h。上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入EER2799(購自NEB公司)電擊感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Cnf+Knf。然后將LB板上生長的克隆影印到M9+CInr+Kmr+5(Mm草甘膦的平板，37。C培養(yǎng)48h。將平板上生長的菌經(jīng)LB平板劃線培養(yǎng)后，將這些菌落再接種到含不同草甘膦濃度的M9平板上(IOO，150mm草甘膦)。將這些重組菌中的質(zhì)粒抽提后重新轉(zhuǎn)化ER2799后涂布M9+Cnf+Knf平板驗(yàn)證(ER2799+pACYC184為對照)，同時進(jìn)行重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。4、篩選草甘膦抗性轉(zhuǎn)化子將轉(zhuǎn)染細(xì)菌涂布含Cm(氯霉素)、Kra(卡那霉素)的LB平板上，37。C培養(yǎng)20h后，約有5000個菌落生長，將這些菌落影印到含Cnf、Knf和50mM草甘膦的M9平板上培養(yǎng)48h后，有三個菌落生長。將這三個菌落接種到含100raM、150mM的草甘膦的M9平板上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有1個克隆能在含150mM的草甘膦的M9平板上生長，其所含的質(zhì)粒被命名為pACYCRD。從該克隆抽提的質(zhì)粒pACYCRD轉(zhuǎn)入AER2799或大腸桿菌JM109中，將轉(zhuǎn)化子用無菌牙簽點(diǎn)于含20mM草甘膦的MOPS固體培養(yǎng)基上檢驗(yàn)抗性，結(jié)果證明這個克隆所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子均具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性確實(shí)是由于轉(zhuǎn)入pACYCRD引起的。5、草甘膦耐受實(shí)驗(yàn)將大腸桿菌ER2799(含攜帶有新克隆的pACYCRD質(zhì)粒)接種到含0200mm草甘膦的M9液體培養(yǎng)基(Cmr十Knf)中，經(jīng)過37'C、72h的搖床培養(yǎng)后，測定培養(yǎng)物的OD,。同時以含無插入片段的質(zhì)粒的大腸桿菌ER2799為陰性對照，以含插入已知草甘膦抗性基因HTG7ar^的大腸桿菌ER2799(含pACYCHTG7，該質(zhì)粒攜帶有已知的草甘膦抗性基因HTG7ar^)作為陽性對照。結(jié)果將ER2799(攜帶pACYCRD質(zhì)粒)接種到含0200mm草甘膦的M9液體培養(yǎng)基(Cnf+Kmr)中，經(jīng)過37'C、72h的搖床培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)陰性對照在M9中幾乎不能生長；陽性ER2799(pACYCHGT7)能在僅含有50mm草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中生長良好；而ER2799(pACYCRD)則在含有200mm草甘膦的M9液體培養(yǎng)基中還能生長(圖5)。這一結(jié)果說明pACYCRD上攜帶的外源片段具有非常強(qiáng)的草甘膦耐受活性。實(shí)施例2:高抗草甘膦的DNA片段的序列分析及其EPSP合成酶功能驗(yàn)證1、高抗草甘膦的DNA片段的序列分析對實(shí)施例1中所亞克隆的高抗草甘膦DNA片段進(jìn)行全核苷酸序列測定。分析結(jié)果表明，插入的片段大小為2482bp，其中包含了一個1290bp的閱讀框，其序列如SEQIDN0:1和圖1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1290個堿基，其開放讀框位于1-1287位，編碼全長為429個氨基酸的EPSP合成酶(SEQIDNO:2和圖2)。將所亞克隆的高抗草甘膦編碼序列與已報(bào)道的EPSP合酶編碼基因(flj)比較，在核苷酸水平幾乎沒有任何同源性。氨基酸序列同源性分析結(jié)果表明，本發(fā)明的EPSP合酶與蠟樣芽孢桿菌的EPSPS的氨基酸同一性為72%。多基因序列比對表明RDDEPSPS與I型的同一性低于30%;而與II的EPSPS的同一性高于50%(圖3)。該結(jié)果說明RDEPSPS屬于II類EPSPS。RDEPSPS與部分I類和II類EPSPS的系統(tǒng)發(fā)育比較結(jié)果如圖4所示。2、高抗草甘膦的DNA片段的EPSP合酶功能驗(yàn)證序列分析結(jié)果顯示抗性克隆中含有EPSP合酶的ORF，為了證實(shí)其具有EPSP合酶活性，本實(shí)驗(yàn)以常規(guī)的大腸桿菌EPSP合酶缺陷型菌株ER2799為受體菌株，采用CaCl2法將草甘膦抗性亞克隆pACYCRD轉(zhuǎn)入，用無菌牙簽將轉(zhuǎn)化子菌落點(diǎn)于MOPS固體培養(yǎng)基上，受體菌株ER2799、含有空載體質(zhì)粒的ER2799為陰性對照，如抗草甘膦亞克隆含有可表達(dá)的EPSP合酶基因，互補(bǔ)了受體菌的缺陷，則能夠利用限制性培養(yǎng)基的無機(jī)物合成氨基酸并生長，否則就不能生長。試驗(yàn)結(jié)果表明，草甘膦抗性亞克隆中所含的DNA片段均能在功能上互補(bǔ)EPSP合酶缺陷型菌株，因此，可以確定亞克隆pACYCRD中含有完整功能的EPSP合酶基因。實(shí)施例3:髙抗草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成根據(jù)已完成的含1290bp編碼區(qū)的核苷酸序列，首先分8個區(qū)段分別根據(jù)正鏈和副鏈序列，分別合成出長度約150-200bp、具有粘性末端的單鏈寡核苷酸片段。將正鏈和副鏈各一一對應(yīng)的8個互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸片段分別退火，形成8個帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段。混合雙鏈寡核苷酸片段，經(jīng)T4DNA連接酶催化組裝成一個完整的EPSP合酶基因。該合成的DNA片段含有SEQIDNO:l中1-1287位的核苷酸序列，并且合成基因的上下游兩端含Ndel和HindIII位點(diǎn)。將上述人工合成的5'和3'端酶切位點(diǎn)為Ndel和HindIII位點(diǎn)EPSPS基因，用于表達(dá)高抗草甘膦的EPSP合酶以及構(gòu)建相應(yīng)的基因植物表達(dá)載體。實(shí)施例4:高抗草甘膦的EPSPS表達(dá)上述人工合成的5'和3'端酶切位點(diǎn)為Ndel和HindIII位點(diǎn)EPSPS基因，用Ndel和HindIII酶切后，連入相同酶切的載體pET28a(購自N0VAGEN公司)得到重組質(zhì)粒pETRD并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。將轉(zhuǎn)化子先在LB+Kar^培養(yǎng)基中37°C，200rpm培養(yǎng)至OD,值約0.5，加入IPTG(終濃度為0.75mrool/L)后轉(zhuǎn)入37。C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，含有pETRD的BL21(DE3)在37。C經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h后表達(dá)量即達(dá)到最高值。目的蛋白為可溶性蛋白；大小約45kD，與預(yù)測值相符(見圖6)。實(shí)施例5:EPSPS的酶活測定和動力學(xué)參數(shù)的測定(a)測定方法無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線lOmM無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液按1:10稀釋，分別取0、1、2、3…20pl于1.5mlEppendorf離心管中,加入milli-Q純水至100^1混勻，加入MAT溶液0.8ml混勻，計(jì)時三分鐘后加入34%SC溶液100)Lil迅速混勻，室溫靜置20min后測定OD,值。重復(fù)三次。以無機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo)，OD,值為縱坐標(biāo)作圖得到無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活測定酶粗提物蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法(Bradford,1976)。在冰上于1.5mlE卯endorf離心管中加入以下溶液10mMPEP溶液2^1，10mMS3P溶液2pl，0.5MHEPES溶液2pl，lmM(NH4)6M07024'4H20溶液2|il和railli-Q純水12^il混勻，于28"C溫浴5min后各管樣品間隔2S加入1^1粗酶液并計(jì)時，2min后再間隔2S依次加入200|ulMAT溶液，顯色3min后再間隔2S依次加入20|ul34%SC溶液迅速混勻，室溫顯色20min后測定ODee。值。對照除不加酶液外，其余同樣品管。樣品管與對照管的OD,值相減后，對照無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得反應(yīng)釋放出的無機(jī)磷摩爾量，再除以反應(yīng)時間和酶蛋白量就得到該酶的酶活力(U/mg)。半抑制劑量(IC50)測定上述反應(yīng)液中添加O、10-3、10-2、IO-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力數(shù)據(jù)以草甘膦濃度為X軸，采用對數(shù)坐標(biāo)，以反應(yīng)速度V(U/mg)為Y軸作圖。Km(PEP)測定將S3P溶液濃度恒定于lmM，在不同PEP濃度(0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、l.O函)下按上述反應(yīng)體系測定酶反應(yīng)速度，所測數(shù)值按V-v/[S](Eadic-Hofstee)法作圖。Ki(glyphosate)測定在不同草甘膦濃度(O、10、50、100-)下測定PEP濃度為66.7、100、200、500nM時EPSPS的酶反應(yīng)速度。采用雙對數(shù)作圖，得到l/V-l/[S]直線，再將各直線的斜率作為縱坐標(biāo)，草甘膦濃度作為橫坐標(biāo)得到一條新的直線，該直線與X軸的交點(diǎn)即為Ki(glyphosate)值。(b)結(jié)果RDEPSPS的酶活性為15.57U/mg。RDEPSPS的動力學(xué)參數(shù)測定如下表所示動力學(xué)參數(shù)IC50(glyphosate;mM)A;(PEP;mM)A(glyphosate;mM)RDEPSPS15.075±0.0120.0343±0.0320.146±0.002根據(jù)RDEPSPS的動力學(xué)參數(shù)可知，RDEPSPS不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保持著與PEP較強(qiáng)的親和性，這些特性將為將RDEPSPS用于轉(zhuǎn)基因作物的培育提供可能。實(shí)施例6:髙抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表達(dá)載體構(gòu)建的具體方法如下A.pBI121(購自ClonTech公司)和pCAMBIA2301(購自ClonTech公司)用HindIII和EcoRI雙酶切，將pBI121帶有p35S-GUS-Nos-ter的片段連入pCAMBIA2301，形成中間載體p35S-2301-GUS;B.用Xbal和Sacl雙切p35S-2301-GUS和上述人工合成的EPSPS基因，用EPSPS置換p35S-2301-GUS相應(yīng)酶切位點(diǎn)的GUS，從而獲得高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表達(dá)載體。再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，用于轉(zhuǎn)化模式植物煙草。實(shí)施例7:利用葉盤法轉(zhuǎn)化構(gòu)建抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因煙草(1)用無菌牙簽挑取YPE選擇平板上的實(shí)施例5中制備的陽性克隆，接種于2MLYPE液體(Sm+,Kan+)，28。C，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；(2)室溫下4，000g離心10分鐘；(3)棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌體的OD,在0.5左右；(4)取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1cm2見方的小葉片；(5)將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無菌濾紙上吸干菌液；把經(jīng)浸染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28t:暗培養(yǎng)48小時；(6)將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/l+NAAO.lmg/l+Kan50mg/l+羧節(jié)青霉素250mg/l)上，25-28。C光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；(7)約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/l+Kan25mg/l)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；(8)待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始幾天用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，轉(zhuǎn)移至在含10mM的草甘膦的固體培養(yǎng)基中篩逸草甘膦抗性的植株。(9)抗性植株經(jīng)Southern、Northern雜交以及Westhemblot驗(yàn)證為轉(zhuǎn)基因的抗性植株。(10)在溫室中經(jīng)草甘膦抗性梯度實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)基因植物能在含20mM和30mM草甘膦的培養(yǎng)基上良好生長。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。<110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>高抗草甘膦的EPSP合酶及其編碼序列〈130>070601<160〉2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>1290<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉CDS<222〉(1)..(1287)<223〉EPSP合酶編碼序列<柳〉atgagtMetSer1ggaGly3幼LysCC3Pro5ttaLeuLysThraatAsncttLeu10teatctSerSercttc犯LeuGinGly15g犯Glu48￡LtttctlieSerattliecccPro20gggGlygatAsp鄉(xiāng)tegSerlie25tctSerescag8HisArggetgtgAlaVal30MetUcPhe96ggagcgGlyAlaatgMet35gcaAlag肌GlugggGlyLysactThr40acgThrlieaMcatAsnHistttttaPheLeu45AlaggtGly144gaagatGluAsp50tgcCystta_Leu敏SerThratelie55tctSertgtCysUtPheg肌aagGluLys60atgggcMetGlygtaValtegSer192lie乙ys65Argg犯GluggcGlyGlu70tatTyrgttValgaaGlugtgValg肌ggtGluGly75a朋ggtLysGlyateliegaaGlu80240ggat"UGlyLeuagtSerg犯GlucctPro85actThrtecSeratelieLeugatAsp90gtaggaaatteaValGlyAsnSerGly95Thr288actactcgtttaatgctggggattcttgecggtgtgccatttcatacgThrThrArgLeuMetLeuGlylieLeuAlaGlyValProPheHisThr100105110336tctctaattggagatgagtegattgccaagcgtccaatgagecgtgtt384SerLeulieGlyAspGluSerlieAlaLysArgProMetSerArgVal115120125acggtgccgctgcgctctatgggtgcaaagattgatgggcgtgagcat432ThrValProLeuArgSerMetGlyAlaLyslieA印GlyArgGluHis130135140ggccaatatacgcctttatctactagaggaggagcattaaaagcaatt480GlyGin丁yrThrProLeuSerThrArgGlyGlyAlaLeuLysAlalie145150155160cattaccattctcctgtagcaagtgcacaagtaaaateggcgatttta528HisTyrHisSerProValAlaSerAlaGinValLysSerAlalieLeu165170175cttgcgggacttcatgccgaaggcacaacaaaagtaaccgagcctttt576LeuAlaGlyLeuHisAlaGluGlyThrThrLysValThrGluProPhe180185190acateacgcgaccataccgagcgtatgcttcgcgcatttggagtagac624ThrSerArgAspHisThrGluArgMetLeuArgAlaPheGlyValAsp195200205gtagaggtagatggaacgactgtaagtattgaagggggacaatecctg672ValGluValAspGlyThrThrValSerlieGluGlyGlyGinSerLeu210215220cgcggaacggatgtgtacgtccctggagacatttctteagetgcattc720ArgGlyThrAspValTyrValProGlyAsplieSerSerAlaAlaPhe225230235240tttcttgttgcaggagccattgttccaaacagecgaategttttgaaa768PheLeuValAlaGlyAlalieValProAsnSerArglieValLeuLys245250255aacgtcggaetcaatcctacaagaacaggtattattgatgtgcttcag816AsnValGlyLeuAsnProThrArgThrGlylielieAspValLeuGin260265270caaatgggtgcacgccttacaatttecaatgaacgtattcaaaatgga864GinMetGlyAlaArgLeuThrlieSerAsnGluArglieGinAsnGly275280285gagcctattggcgatttgacgattgaaacgtctcagttgaaagggatt912GluProlieGlyAspLeuThrlieGluThrSerGinLeuLysGlylie290295300gaaattgggggcgatttaattcctcgtttaattgatgaaattccggta960GlulieGlyGlyAspLeulieProArgUulieAspGlulieProVal305310315320ategetlieAlacttLeuttgLeugcgAla325actThrC3gGingC3AlaactThrgggGly330333Lys3CgThrgtgValattlie3aaLys335g3tAsp1008gcggaaAlaGlug3￡lGluetaLeu340LysgtaValILysg犯Glu￡LCgThr345aacAsncgcArgateliegatAspacgThr350gttValAla1056accgagThrGluetaLeu355ageSer卿LysctgLeuggtGlygccAla360tctSergttValacgThrccaProThr365getAlaAspggcGly1104etcateLeulie370a/ttlieGluggcGly犯gLysacgThr375gccAlactgLeucgaArgageSerggtGly380g肌GlugtaValgacAspageSer1152"UcggaTyrGly385gatAspcatHiscgaArgattlie390GlyatgMetatgMetcttLeugcgAla395gtcValgcaAlaAlagccAlaattlie4001200gcaacgAlaThrggaGlygagGluVal405acgThretaLeuaat八sn卿ArgagtSer410AspgccAlalieHisgtcVal415tecSer1248taccctTyrProactThrtttPhe420tttPheg犯GluAspcttLeuAsp425GluetaLeu鄉(xiāng)Serc朋Gint犯1290<210〉2<211〉429<212〉PRT<213〉人工序列<400>2MetSerGlyLysProLeuLysThrAsnLeuSerSerLeuGinGlyGlu151015lieSerlieProGlyAspLysSerlieSerHisArgAlaValMetPhe202530GlyAlaMetAlaGluGlyLysThrThrlieAsnHisPheLeuAlaGly354045GluAspCysLeuSerThrlieSerCysPheGluLysMetGlyValSer505560lieLysArgGluGlyGluTyrValGluValGluGlyLysGlylieGlu65707580GlyLeuSerGluProThrSerlieLeuAspValGlyAsnSerGlyThr859095ThrThrArgLeuMetGlylieAlaGlyValProPheHisThrSerLeulie115ThrValPro130GlyGinTyr145HisTyrHisLeuAlaGlyThrSerValGlu210ArgGly225PheLeuAsnValGinMetGluPro290Glulie305lieAlaAlaGluThrGluteulie370TyrGly385AlaThrArg195ValThrValGlyGly275lieGlyLeuGluLeu355lieAspGlyTyrProThr訓(xùn)GlyLeuThrSerLeu180AspAspAspAlaLeu260AlaGlyGlyLeuLeu340SerGluHisGluPhe420AspArgProPro165HisHisGlyValGly245AsnArgAspAspAla325LysLysGlyArgVal405PheGluSerLeu150ValAlaThrThrTyr230AlaProLeuLeuL_eu310ThrValLeu!Lyslie390ThrGluSerMet135SerAlaGluGluThr215VallieThrThrThr295lieGinLysGlyThr375GlyLeuAsplie120GlyThrSerGlyArg200ValProValArglie280lieProAlaGluAla360AlaMetAsnLeu105AlaAlaArgAlaThr185MetSerGlyProThr265SerGluArgThrThr345SerLeuMetArgAsp425LysLysGlyGin170ThrLeulieAspAsn250GlyAsnThrLeuGly330AsnValArgLeuSer410GluArglieGly155ValLysArgGlulie235SerlieGluSerlie315LysArgThrSerAla395AspLeuProAsp140AlatysValAlaGly220SerArglieArgGin300AspThrlieProGly380ValAlaSerMet125GlyLeuSerThrPhe205GlySerlieAsplie285LeuGluValAspThr365GluAlalieGin110SerArgLysAlaGlu190GlyGinAlaValVal270GinLyslielieThr350AlaValAlaHisArgValGluHisAlalie160lieLeu175ProPheValAspSerLeuAhPhe240LeuLys255LeuGinAsnGlyGlylieProVal320LysAsp335ValAlaAspGlyAspSerAlalie400ValSer41權(quán)利要求1.一種分離的EPSP合酶多肽，其特征在于，它包含具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDNO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。3.—種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求l和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQIDNO:1中1-1287位的序列；(b)具有SEQIDNO:1中1-1290位的序列。6.—種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。7.—種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。8.—種具有EPSP合酶活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有EPSP合酶活性的多肽。9.一種能與權(quán)利要求1所述的EPSP合酶特異性結(jié)合的抗體。10.—種改變植物抗草甘膦抗性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDN0:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。全文摘要本發(fā)明提供了一種新的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(簡稱為“EPSP合酶”)，編碼EPSP合酶的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種EPSP合酶的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種EPSP合酶的多核苷酸的用途。文檔編號C12N9/00GK101285057SQ200710039338公開日2008年10月15日申請日期2007年4月11日優(yōu)先權(quán)日2007年4月11日發(fā)明者平淑珍,維張,敏林,丹金,偉陸,明陳申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所