專(zhuān)利名稱(chēng)：胞質(zhì)磷脂酶a的制作方法
背景技術(shù)：
在氣喘、關(guān)節(jié)炎以及其它炎癥疾病中，白細(xì)胞三烯和前列腺素是重要的炎癥介質(zhì)。在氣喘病患者體內(nèi)，白細(xì)胞三烯通過(guò)支氣管收縮、增加粘液分泌以及炎癥細(xì)胞的化學(xué)引誘導(dǎo)致支氣管梗阻(O’Byrne，1997)；前列腺素導(dǎo)致了與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛和水腫。阻塞這些脂類(lèi)介質(zhì)的合成或作用的藥理學(xué)干涉能有效地治療人類(lèi)疾病，因此確認(rèn)了它們的重要性(Simon等，1998年；O’Byrne，1997)。
胞質(zhì)磷脂酶A2(cPLA2)引發(fā)了由從細(xì)胞膜釋放花生四烯酸來(lái)制備白細(xì)胞三烯和前列腺素。花生四烯酸依次由環(huán)加氧酶途徑代謝為前列腺素以及由5-脂氧化酶途徑代謝為白細(xì)胞三烯。在花生四烯酸的釋放的同時(shí)，形成了溶血小板活化因子(lyso-PAF)，然后可將其乙酰化生成PAF，而PAF也是一種涉及氣喘和關(guān)節(jié)炎的病理生理學(xué)的分子(Venable等，1993)。因此，由cPLA2催化的反應(yīng)引發(fā)制備了三類(lèi)炎癥介質(zhì)白細(xì)胞三烯、前列腺素和PAF。
cPLA2為各異的磷脂酶A2酶超家族中的一員，其具有分裂甘油磷脂的sn-2酯的共同能力。該家族最初成員的特征為在細(xì)胞外或顆粒內(nèi)分泌的低分子量的酶(并且在本文中統(tǒng)稱(chēng)為sPLA2s；第I、II、III、V、VII和IX族)(Dennis，1997)。PLA2家族由克隆而擴(kuò)展并且擴(kuò)充了特征為依賴(lài)于鈣的對(duì)花生四烯酸基有選擇性的cPLA2(Clark等，1991；Kramer等，1991)、不依賴(lài)于鈣的PLA2(Tang等，1997；Balboa等，1997)和血漿與細(xì)胞內(nèi)的PAF-乙酰水解酶(Hattori等，1994、1995)。這些新型酶與所述低分子量酶或其互相之間沒(méi)有序列同源性。此外，與使用活化水來(lái)分裂磷脂的sPLA2s不同，這些酶看來(lái)似乎使用了親核的絲氨酸。在這方面，它們與α/β水解酶家族的其它脂肪酶之間比其與sPLA2s之間具有更多的共同點(diǎn)。最近克隆了兩種附加的與cPLA2的催化結(jié)構(gòu)域具有30％同一性的酶；把它們叫做cPLA2β(C.Song等，手稿在準(zhǔn)備中)和cPLA2γ(Underwood等，1998)。
在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,322,776、5,354,677、5,527,698和5,593,878中描述了克隆cPLA2。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,466,595、5,554,511、5,589,170和5,840,511中描述了克隆不依賴(lài)于鈣的cPLA2。
各種證據(jù)都支持cPLA2在脂類(lèi)介導(dǎo)的生物合成中起了重要作用。cPLA2是唯一對(duì)含有花生四烯酸的磷脂在sn-2位具有高選擇性的酶(Clark等，1995；Hanel和Gelb，1993)。cPLA2的活化或其增加的表達(dá)與增加白細(xì)胞三烯和前列腺素的合成相關(guān)(Lin等，1992b)?；罨螅琧PLA2易位至核膜，在那里cPLA2與環(huán)加氧酶和脂氧化酶共定位(co-localized)，并將花生四烯酯代謝成前列腺素和白細(xì)胞三烯(Schievella等，Glover等，1995)。雖然這些數(shù)據(jù)是令人信服的，但是在類(lèi)花生酸和PAF的合成中cPLA2起重要作用的最權(quán)威的證據(jù)來(lái)自小鼠試驗(yàn)，其中小鼠缺乏來(lái)自同源重組的cPLA2(Uozumi等，1997；Bonventre等，1997)。腹膜的巨噬細(xì)胞是源于這些動(dòng)物不能制造白細(xì)胞三烯、前列腺素或PAF。缺乏cPLA2的小鼠也為cPLA2在疾病中的作用提供了信息，因?yàn)檫@些小鼠在用于模擬氣喘的過(guò)敏反應(yīng)模型中抵抗支氣管機(jī)能亢進(jìn)(hyperreactivity)(Uozumi等，1997)。
cPLA2由至少兩個(gè)功能獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域組成N末端的依賴(lài)于Ca2+的脂類(lèi)結(jié)合(CaLB)結(jié)構(gòu)域和不依賴(lài)于Ca2+的催化結(jié)構(gòu)域(Nalefski等，1994)。N末端的CaLB結(jié)構(gòu)域?yàn)镃2家族中的一員并且已解出它的結(jié)構(gòu)(Perisic等，1998；Xu等，1998)；它用其膜基體通過(guò)共定位所述催化結(jié)構(gòu)域的方式介導(dǎo)鈣的調(diào)節(jié)(Nalefski等，1994)。此外，也由所述催化結(jié)構(gòu)域的磷酸化作用來(lái)調(diào)節(jié)cPLA2的活性(Lin等，1991；Leslie等，1997)。Ser505和Ser727一起保存在所有物種中并且在多細(xì)胞的類(lèi)型中被磷酸化(de Carvalho等，1998)。由MAP-激酶家族的成員將Ser505磷酸化對(duì)釋放花生四烯酸的細(xì)胞外刺激來(lái)說(shuō)是一個(gè)共同反應(yīng)。Ser505突變成Ala減少了活化作用(Lin等，1993)，但是對(duì)Ser727的類(lèi)似的突變沒(méi)有作用(Leslie，1998)。
幾條線的證據(jù)表明cPLA2的催化機(jī)理經(jīng)歷了絲氨酸-?；虚g體(Trimble等，1993；Hanel和Gelb，1995)。Ser228的突變消除了cPLA2對(duì)所有包括磷脂、溶血磷脂和脂肪酰化香豆素在內(nèi)的底物的活性(Pickard等，1996；Huang等，1996)。Ser228存在于五肽序列G-L-S-G-S中，其與經(jīng)典的“脂肪酶基序”G-X-S-X-G相似(Schrag和Cygler，1997)，其中在更寬的稱(chēng)為α/β水解酶的酶家族范圍內(nèi)的大多數(shù)脂肪酶中都發(fā)現(xiàn)了此脂肪酶基序。這些酶具有由保存完好的混合β折疊片層組成的共同核心，其中所述β折疊片層的鏈被α螺旋所散開(kāi)。在所有的α/β水解酶中，催化的絲氨酸存在于β鏈和α-螺旋之間的緊密轉(zhuǎn)角處，并將其稱(chēng)為“親核肘(nucleophilic elbow)”(見(jiàn)Schrag和Cygler的綜述，1997)。這個(gè)轉(zhuǎn)角指導(dǎo)短的絲氨酸支鏈遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)主鏈，降低在所述殘基周?chē)目臻g位阻并要求+2和-2支鏈要小以避免空間碰撞；因此所述G-X-S-X-G基序占優(yōu)勢(shì)(Derewenda和Derewenda，1991)。
除絲氨酸外，α/β水解酶還用組氨酸和一種酸(天冬氨酸/谷氨酸)作為與存在于絲氨酸蛋白酶中類(lèi)似的催化三聯(lián)體中的其它成員(Schrag和Cygler，1997)。盡管在cPLA2中Asp549對(duì)活性顯示出其重要性，但是19個(gè)組氨酸殘基中沒(méi)有一個(gè)顯示相同的重要性(Pickard等，1996)。另一種不同的殘基Arg200在酶促過(guò)程中起了作用，盡管還不知道其中的機(jī)理。這些觀察結(jié)果表明cPLA2對(duì)?；饷竿ㄟ^(guò)新的催化機(jī)理起作用。
如sPLA2s和α/β水解酶家族的脂肪酶都相似，cPLA2優(yōu)先分裂位于界面的底物(Nalefaki等，1994)。這種已知為界面活化的現(xiàn)象應(yīng)歸功于酶的構(gòu)象變化或者歸功于底物的更有利的提呈(Scott等，1990)。仍然不知道在cPLA2中的1500-折疊對(duì)單體物質(zhì)和分子團(tuán)底物的活性不同的起因。
盡管cPLA2在炎癥疾病中具有重要作用，但其三維結(jié)構(gòu)還未解開(kāi)，留下了許多未能解答的問(wèn)題。在這里，我們報(bào)道了人類(lèi)cPLA2在2.5分辨率下的X-射線晶體結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)深入了解了花生四烯酸酯的選擇性和界面活化的機(jī)理，闡明Ser228、Asp549和Arg200的作用，并且揭示CaLB和催化結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。重要地是，所述結(jié)構(gòu)為獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，與α/β水解酶家族的不同。
本發(fā)明提供了結(jié)晶的cPLA2。優(yōu)選所述cPLA2為人類(lèi)cPLA2或?yàn)閬?lái)自非哺乳動(dòng)物物種的cPLA2。在某些實(shí)施方案中，所述cPLA2為重組cPLA2和/或包含天然形成的cPLA2的成熟序列。
其它實(shí)施方案提供了與第二種化學(xué)物種締合的包含cPLA2的結(jié)晶組合物。優(yōu)選所述第二種化學(xué)物種選自cPLA2活性的潛在抑制劑和cPLA2膜結(jié)合的潛在抑制劑。
而其它實(shí)施方案提供了包含能具體體現(xiàn)cPLA2結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)組的cPLA2結(jié)構(gòu)模型。優(yōu)選這種數(shù)據(jù)組由對(duì)cPLA2的晶體分析，可包括NMR分析來(lái)測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，所述數(shù)據(jù)組具體體現(xiàn)了cPLA2的部分結(jié)構(gòu)，包括(但不限于)cPLA2的活性部位或cPLA2的CaLB結(jié)構(gòu)域。
可使用任何可獲得的方法，根據(jù)此處公開(kāi)的或?qū)Y(jié)晶cPLA2獨(dú)立分析得到的晶體學(xué)或NMR數(shù)據(jù)構(gòu)建這種模型。這種模型可由可得的分析數(shù)據(jù)點(diǎn)，使用已知的軟件包來(lái)構(gòu)建，其中軟件包如HKL、MOSFILM、XDS、CCP4、SHARP、PHASES、HEAVY、XPLOR、TNT、NMRCOMPASS、NMRPIPE、DIANA、NMRDRAW、FELIX、VNMR、MADIGRAS、QUANTA、BUSTER、SOLVE、O、FRODO、RASMOL和CHAIN。然后，從這些數(shù)據(jù)構(gòu)建的模型能用可得的系統(tǒng)目視觀測(cè)，其中所述系統(tǒng)包括例如Silicon Graphics、Evans和Sutherland、SUN、Hewlett Packard、Apple Macintosh、DEC、IBM及Compaq。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明模型的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)及用于構(gòu)建、加工和/或觀察本發(fā)明模型的硬件。
其它實(shí)施方案還提供了包含計(jì)算機(jī)硬件和本發(fā)明模型的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
也提供了鑒定物種，即cPLA2的活性或結(jié)合的激動(dòng)劑或拮抗劑的方法，包括(a)提供本發(fā)明的模型，(b)研究這種模型與候選物種(candidate species)的相互作用，和(c)選擇預(yù)定作為所述激動(dòng)劑或拮抗劑的物種。也提供根據(jù)這種方法鑒定的物種。
其它實(shí)施方案提供(1)鑒定能抑制cPLA2的活性或結(jié)合的物質(zhì)的方法，包括確定候選物質(zhì)和cPLA2的結(jié)構(gòu)模型之間的相互作用，或(2)鑒定模擬cPLA2的活性或結(jié)合的物質(zhì)的方法，包括確定候選物質(zhì)和cPLA2的結(jié)構(gòu)模型之間的相互作用。也提供根據(jù)這種方法鑒定的物質(zhì)。
候選物種與所述模型之間的相互作用的研究可用可得的軟件平臺(tái)來(lái)實(shí)施，其中所述軟件平臺(tái)包括QUANTA、RASMOL、O、CHAIN、FRODO、INSIGHT、DOCK、MCSS/HOOK、CHARMM、LEAPFROG、CAVEAT(UC Berkley)、CAVEAT(MSI)、MODELLER、CATALYST和ISIS。
其它實(shí)施方案提供了由合理的藥物設(shè)計(jì)鑒定cPLA2活性抑制劑的方法，包括(a)設(shè)計(jì)潛抑制劑，該抑制劑能基于cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)在cPLA2的活性部位與一個(gè)或多個(gè)氨基酸形成非-共價(jià)鍵；(b)合成所述抑制劑；和(c)確定所述潛抑制劑是否抑制cPLA2的活性。優(yōu)選用于這種方法的cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)得自空間群P21212的cPLA2晶體，其中a＝153.59埃，b＝95.49埃和c＝139.13埃。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述抑制劑設(shè)計(jì)成與在所述cPLA2活性部位中的一種或多種氨基酸的一個(gè)或多個(gè)原子相互作用，所述原子選自Ser228的CB和Oγ原子；Asp549和Asp575的Oδ1和Oδ2原子；Arg200、Arg413和Arg579的CB、CG、CD、NE、CZ、NH1和NH2原子；Trp393的主鏈羰基氧；Asn555的Nδ2和Oδ1原子；Phe397、Phe681、Phe683和Phe199的CD1、CE1、CG、CZ、CE2和CD2原子；Trp232和Trp393的CG、CD1、NE1、CE2、CZ2、CH2、CZ3、CE3和CD2；Ser577的CB和Oγ原子；Cys331的CB和Sγ原子；Glu589的OE1和OE2原子；Lys588的CB、CG、CD、CE和NZ原子；Thr680的Oγ1原子；Glu418和Glu422的OE1和OE2原子；Met417的CB、CG、SD和CE原子；Leu400和Leu421的CB、CG、CD1和CD2原子；Ile424的CB、CG1、CG2或CD1原子；Ala578的主鏈NH和羰基氧原子；和His639的CB、CG、ND1、CE1、NE2和CD2原子。也提供了由這種方法鑒定的激動(dòng)劑和拮抗劑。
也提供了通過(guò)合理的藥物設(shè)計(jì)鑒定cPLA2膜結(jié)合的抑制劑的方法，包括(a)設(shè)計(jì)潛抑制劑，該抑制劑能基于cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)在cPLA2的靜電斑區(qū)中與一個(gè)或多個(gè)氨基酸形成非-共價(jià)鍵；(b)合成所述抑制劑；和(c)確定所述潛抑制劑是否抑制cPLA2的膜結(jié)合。優(yōu)選用于這種方法的cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)得自空間群P21212的cPLA2晶體，其中a＝153.59埃，b＝95.49埃和c＝139.13埃。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述抑制劑設(shè)計(jì)成與一種或多種氨基酸相互作用，所述氨基酸選自Arg467、Arg485、Lys488、Lys544和Lys543。也提供了采用這種方法鑒定的激動(dòng)劑和拮抗劑。
圖2(A).cPLA2單體的帶狀圖。所述CaLB結(jié)構(gòu)域以綠色顯示，同時(shí)將兩個(gè)鈣原子畫(huà)成紅色。將cPLA2的“帽”結(jié)構(gòu)染成紫色。低電子密度的活動(dòng)環(huán)以點(diǎn)來(lái)表示。將CaLB和所述催化結(jié)構(gòu)域之間的彈性連接體染成紅色。也顯示了4個(gè)在cPLA2中被磷酸化的絲氨酸殘基的位置。圖用Molscript(Kraulis，1991)和RASTER3D(Bacon和Anderson，1988)制作。(B)cPLA2的GRASP表面圖。將在由Xu等(1998)做的NMR實(shí)驗(yàn)中與十二烷基膽堿磷酸分子團(tuán)相互作用而發(fā)生N15/NH移動(dòng)的殘基涂成紫色。用紅色突出所述cPLA2的活性裂縫。為了表示清楚，除去了蓋殘基。(C)cPLA2的表面能圖象，將堿性殘基涂上藍(lán)色陰影并且將酸性殘基涂上紅色。為了表示清楚，除去了蓋殘基。在所述分子的膜-結(jié)合區(qū)上可清楚見(jiàn)到堿性非常強(qiáng)的斑。圖用GRASP(Nicholls，1992)制作。所有的觀察都在相同的方向。
圖3(A)規(guī)則的α/β水解酶折疊的Richardson圖象。用箭頭代表β鏈，同時(shí)用矩形代表α螺旋。二級(jí)結(jié)構(gòu)元素根據(jù)Schrag和Cygler(1997)的綜述編號(hào)。將緊跟“親核肘”之后的C螺旋染成粉紅色。
(B)cPLA2折疊的Richardson圖。與在規(guī)則的α/β水解酶折疊中一樣，設(shè)計(jì)編號(hào)方案使得緊跟在Ser288之后的螺旋是C螺旋。為了更易與(A)中的規(guī)則的α/β水解酶折疊對(duì)比，因此將中心核染成黃色。將組成所述“帽”的元素涂成紫色；紅色的環(huán)狀區(qū)很易移動(dòng)并且不存在可追蹤的電子密度。
圖4.cPLA2α、β和γ的一級(jí)結(jié)構(gòu)的排列。將同樣的殘基裝入盒內(nèi)，同時(shí)將在cPLA2的X-射線晶體結(jié)構(gòu)中觀測(cè)到的二級(jí)結(jié)構(gòu)元素在所述序列的下面表明。用黃色顯示位于所述帽區(qū)結(jié)構(gòu)域之外的二級(jí)結(jié)構(gòu)元素，同時(shí)用紫色顯示在所述帽區(qū)內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元素。黑線代表轉(zhuǎn)角或環(huán)狀區(qū)。帶有黑線的未鑒定的殘基或二級(jí)結(jié)構(gòu)元素不顯示出可追蹤的電子密度。
圖5(A).顯示由蓋殘基覆蓋的cPLA2催化結(jié)構(gòu)域的表面圖。在漏斗狀物體的底部顯示的是Ser228。由紅色點(diǎn)代表在實(shí)驗(yàn)圖上不可見(jiàn)的連續(xù)序列并且提出其參與形成了蓋鉸合部。在電子密度圖中只能看見(jiàn)主鏈原子的殘基代表丙氨酸。將所有疏水殘基的暴露表面染成藍(lán)色，并且將Arg200的所有疏水殘基的暴露表面染成紅色。用GRASP(Nicholls，1992)制備該圖。
(B)在Ser228周?chē)?的半徑范圍內(nèi)的cPLA2的活性部位的特寫(xiě)。將直接參與催化的兩個(gè)殘基染成綠色。用黃色顯示Arg200和所述環(huán)?？康母拾彼釟埢?97與198。在所述實(shí)驗(yàn)圖中可見(jiàn)的單個(gè)水分子與Asp549和來(lái)自Trp393和Thr330的羰基原子之間以氫鍵結(jié)合。用Molscript和RASTER3D制成該圖。
圖6.提出cPLA2的催化機(jī)理包括Ser228進(jìn)攻在甘油磷脂底物的sn-2位。AA花生四烯酸；HG首基；C18十八烷基。假定Gly197和198為含氧陰離子洞(oxyanion hole)的一部分，而Arg200穩(wěn)定所述首基的磷酸根部分。
發(fā)明及優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述運(yùn)用每749個(gè)殘基一個(gè)重原子散射體解出cPLA2的結(jié)構(gòu)在CHO細(xì)胞中表達(dá)全長(zhǎng)的人類(lèi)cPLA2，并通過(guò)經(jīng)過(guò)修改的在Clark等，1990(Stahl等，手稿在準(zhǔn)備中)中描述的方法進(jìn)行純化。在18℃用PEG1000做沉淀劑并使用標(biāo)準(zhǔn)蒸汽擴(kuò)散技術(shù)獲得晶體。單晶在幾天內(nèi)可生長(zhǎng)至最高可達(dá)0.6mm×0.5mm×0.1mm的尺寸，但是其對(duì)X-射線損傷非常敏感。將晶體的四周浸泡在增加PEG400和DMSO含量的冷凍保護(hù)劑溶液中，隨后將其快速冷卻并暴露在同步輻射下，以上操作為使衍射達(dá)到最小2.5的布拉格間距的關(guān)鍵。晶體為空間群P21212(a＝153.59，b＝95.49，c＝139.13)，每個(gè)不對(duì)稱(chēng)單位具有兩個(gè)單體(1498個(gè)殘基)和60％的溶劑。
制備滲入重原子的cPLA2晶體的嘗試顯示僅有釓或鋱能提供同晶衍生物。但是，任一鑭系元素替代了CaLB中一個(gè)Ca2+原子就由此提供了每749個(gè)氨基酸殘基一個(gè)重原子散射體。這些晶體本身的相位信息的質(zhì)量不夠高，因此不能制備原始的電子密度圖。這個(gè)觀測(cè)結(jié)果，加上大部分重原子的結(jié)合在其本身和被滲入的晶體間產(chǎn)生非-類(lèi)質(zhì)同晶的事實(shí)，將導(dǎo)致由多波長(zhǎng)反常色散(MAD)相(Hendrickson，1991)解出cPLA2的結(jié)構(gòu)。
制備滲入鋱的cPLA2晶體，然后經(jīng)低溫處理(cryotreated)(見(jiàn)方法)，并且在100°K的氮?dú)饬髦欣鋮s。收集單晶圍繞TbLm邊緣(見(jiàn)表1)在三個(gè)不同的波長(zhǎng)的數(shù)據(jù)，出于輻射靈敏度的原因，在數(shù)據(jù)集合之間所述單晶沿著其旋轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)變。用SHARP(de La Fortelle和Bricogne，1997)計(jì)算實(shí)驗(yàn)相至3.2；隨后，幾個(gè)溶劑平化的循環(huán)和在DM的雙重平均(Cowtan等，1996)允許我們將相擴(kuò)展至2.5。這個(gè)方法生成了高質(zhì)量的電子密度圖(


圖1)，其中能清楚地鑒定每個(gè)cPLA2單體的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。最初，用QUANTA程序(Molecular Simulation Inc.)將CaLB(Perisic等，1998；1RLW)轉(zhuǎn)化成密度(was rotated into density)并且將聚氨丙酸軌跡建立為催化結(jié)構(gòu)域的可見(jiàn)區(qū)，生成了每個(gè)單體具有大約550個(gè)殘基的模型。用最終相合并步驟(REFMAC；Murshudov等，1997)改良這個(gè)最初結(jié)構(gòu)的受限相，接著由人工模型建造法(QUANTA)生成模型，隨后在XPLOR(Brünger等，1992b)中修改。本發(fā)明模型包含1285個(gè)殘基(在兩單體之間)和40個(gè)水分子(表1)。分子結(jié)構(gòu)cPLA2單體為大約100?！?5?！?5大小的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的橢圓體結(jié)構(gòu)(圖.2a)。N末端的CaLB結(jié)構(gòu)域(殘基16-138)為獨(dú)特的折疊的β夾心，其由殘基139-143連接至催化結(jié)構(gòu)域，這樣它形成了非常少的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接觸。所述催化結(jié)構(gòu)域的中心核由具有散布的螺旋的10-鏈中心β折疊片層組成，其中所述β折疊片層與規(guī)則的α/β水解酶折疊不同。由于所述結(jié)構(gòu)域間環(huán)具有彈性，因此不對(duì)稱(chēng)單元中存在的cPLA2單體不為完美可重疊的。實(shí)際上，當(dāng)CaLB結(jié)構(gòu)域?yàn)橹丿B時(shí)，在兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域之間有4-5°的差別。連接所述結(jié)構(gòu)域的環(huán)在每個(gè)單體中有獨(dú)特的構(gòu)象并且其殘基表現(xiàn)為高溫因子。
cPLA2為當(dāng)自由Ca2+的水平升高至亞微摩爾水平時(shí)易位至所述膜的胞質(zhì)蛋白(Clark等，1990，1991)。cPLA2的結(jié)構(gòu)域排列顯示了所述活性部位是如何由所述細(xì)胞膜導(dǎo)向的。圖2b為一表面圖，它突出了由Xu和其合作者對(duì)CaLB實(shí)施的HSQC研究(1998)的結(jié)果。將在這些實(shí)驗(yàn)中，在與十二烷基磷酸膽堿分子團(tuán)培育時(shí)顯示發(fā)生N15/NH移動(dòng)的殘基用紫色突出。很明顯，突出的殘基出現(xiàn)在所述分子的作為活性部位的同一表面上。因此，如果CaLB用這些殘基來(lái)締合磷脂膜，那么所述催化結(jié)構(gòu)域大概會(huì)處于使磷脂底物在所述活性部位結(jié)合的位置上。在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的連接體的彈性以及它們之間缺乏主要蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用表明為了與所述膜達(dá)到最佳的相互作用能完成結(jié)構(gòu)域之間的小旋轉(zhuǎn)。
如圖2c的表面能圖所示，存在從所述活性部位伸展通過(guò)CaLB的β3鏈上一條帶正電荷的殘基的高堿性結(jié)構(gòu)域?？善谕鰤A區(qū)具有以下特征其為在所述蛋白質(zhì)上的一個(gè)區(qū)域，使得與所述膜層(見(jiàn)下文)帶負(fù)電荷的磷脂首基產(chǎn)生多靜電接觸。但是，殘基434至456為無(wú)序的，使得不可能準(zhǔn)確定義所述堿性斑的真實(shí)大小。然而，值得注意的是在PI4激酶中和在不同種類(lèi)的sPLA2s中見(jiàn)到了相似的堿性斑(Rao等，1998)?？稍O(shè)想cPLA2與由磷脂酰甲醇脂質(zhì)體構(gòu)成的膜(Hixon和Gelb，1998)的非常緊密的結(jié)合是通過(guò)這個(gè)斑和附近的CaLB結(jié)構(gòu)域中的β鏈3的一段堿性序列來(lái)介導(dǎo)。N末端的CaLB結(jié)構(gòu)域在全長(zhǎng)的cPLA2中的CaLB結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與那些由NMR和X-射線晶體學(xué)(Xu等，1998；Perisic等，1998)解出的非常相似，只有很小的區(qū)別。簡(jiǎn)單地說(shuō)，它由八個(gè)由六個(gè)環(huán)互相連接的反平行β鏈組成，并折疊成符合C2結(jié)構(gòu)域的“II型”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的β-夾心(Nalefski等，1994b)。將兩個(gè)Ca2+原子通過(guò)一群天冬氨酸和天冬酰胺支鏈，以及主鏈羰基原子結(jié)合至CaLB的一端的三個(gè)獨(dú)立環(huán)上(鈣-結(jié)合環(huán)；CBLs)；在由Perisic和合作者(1998)解出的CaLB結(jié)構(gòu)域中觀察到相同的原子排列。所述Ca2+原子的間隔大約為4。但是，在全長(zhǎng)的cPLA2中的Ca2+原子的環(huán)境并沒(méi)有顯示出在由這些作者解出的CaLB結(jié)構(gòu)中存在有任何水分子；相反，與鈣位點(diǎn)1(由Perisic等定義，1998)配位的是來(lái)自用于結(jié)晶和低溫保護(hù)中的緩沖劑的MES(2-[N-嗎啉基]乙磺酸)的分子。在兩個(gè)cPLA2單體中，Ca2+1和最靠近的MES磺酸鹽氧原子之間的距離為大約2.2。此外，嗎啉基團(tuán)也與His62和Tyr96的支鏈接觸，因此形成了小的疏水生態(tài)位。雖然是人工結(jié)晶作用，但是cPLA2的Ca2+1對(duì)MES的硫酸鹽的配位作用能效法磷脂分子的磷酸根的結(jié)合模式，因此顯示了在cPLA2中，Ca2+充當(dāng)了所述蛋白質(zhì)與所述磷酸化膜之間的橋梁，而非僅作為變構(gòu)激活體。cPLA2折疊的新拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)其與α/β水解酶的區(qū)別cPLA2的催化結(jié)構(gòu)域由14條β鏈和13段α螺旋組成；其中心核由10條絞合的中心混合的β折疊片層組成，其中所述中心核被9段α螺旋包圍，而β5至β11鏈形成了所述折疊片層最明顯的部分(指的是圖3b中的Richardson圖)。所述β折疊片層具有超螺旋結(jié)構(gòu)。為了簡(jiǎn)化，基于由Schrag和Cylger(1997)提出的α/β水解酶折疊命名法來(lái)區(qū)別cPLA2的二級(jí)元素，其中催化性絲氨酸總是在β5之后并在C螺旋之前。
所述cPLA2核中的第一條β鏈?zhǔn)铅?，其跟在CaLB后面的彈性連接之后。在所述折疊的中心部分，包含一段長(zhǎng)螺旋的長(zhǎng)環(huán)完成了到β4的連接。這個(gè)β1/α螺旋結(jié)構(gòu)與在Humicola lanuginosa脂肪酶中觀察到的類(lèi)似，其中所述螺旋區(qū)也不能認(rèn)做所述折疊的一部分，但將其β10連接到所述核中的第一β鏈上(PDB中的入口1TIB)。隨后跟著的平行β鏈，β5位于所述催化性絲氨酸(228)之前。β5、C螺旋(在圖3a和3b中涂成粉紅色)以及連接前兩者的環(huán)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與α/β水解酶類(lèi)似。將這個(gè)連接環(huán)命名位“親核肘”。另外三個(gè)由環(huán)混雜的α螺旋提供了這個(gè)區(qū)和所述折疊的這個(gè)部分的另外4條β鏈之間的連接。在跟隨(β6-β9)的四條β鏈中，β6最長(zhǎng)，并與β7之間有極少量的氫鍵。因此，盡管β7至β1鏈的次序不連續(xù)，也能在更大的結(jié)構(gòu)內(nèi)看成是一個(gè)小β折疊片層。
在β9之后，存在一個(gè)關(guān)于中心α/β核的結(jié)構(gòu)的重要分歧。在這一點(diǎn)的cPLA2序列形成了在圖2a和3b中以紫色顯示的區(qū)。這180個(gè)殘基斑形成了催化結(jié)構(gòu)域“帽”。Asp549，Ser228的催化配偶體位于所述帽的尾部與β10之間的區(qū)域中，其中該區(qū)為所述中心核的一部分。在所述帽結(jié)構(gòu)之后，占據(jù)了最后3條β鏈以完成所述中心β折疊片層并且螺旋G到J散布在其中。
所述α/β水解酶折疊為許多酯酶和其它水解酶所共有(Schrag和Cygler，1997)。它的Richardson圖(圖3a)由中心β折疊片層組成，所述中心β折疊片層的β鏈次序接著線性序列(β3除外，它通常位于在β4和β5之間)。乍看之下，cPLA2的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示為所述α/β水解酶折疊的環(huán)狀排列。但是，仔細(xì)對(duì)照?qǐng)D3a和3b，清楚地表明只有環(huán)繞所述親核肘的區(qū)域才實(shí)際上直接可比(β5至C螺旋；殘基222-238)。主要的區(qū)別包括鏈β6至β9的反平行性質(zhì)，β5和β6之間的螺旋的多樣性以及所述cpla2的α/β核的較后部分的鏈之間的缺少插入的螺旋。
雖然在cPLA2中(殘基370-548)的帽結(jié)構(gòu)為催化結(jié)構(gòu)域的一部分，但是它不包括在α/β核中。人類(lèi)cPLA2的α、β和γ(圖4)的催化結(jié)構(gòu)域的序列對(duì)比顯示了同源性集中在所述α/β核(黃色元素)與β鏈9a和9d中。因此，所述帽的中心部分不同于cPLA2的同種型。在圖2a中cPLA2的帶狀圖和圖2c中表面能圖之間的對(duì)比顯示上文假設(shè)的與膜磷脂靜電接觸的高堿性區(qū)事實(shí)上大部分由帽殘基形成，其中在圖2a中用紫色顯示所述帽區(qū)。
cPLA2的帽區(qū)也包括整個(gè)結(jié)構(gòu)的三個(gè)活動(dòng)性最大的區(qū)中的兩個(gè)，殘基433-456和500-536(第三區(qū)為C末端，殘基728-749)。這些氨基酸段沒(méi)有可追蹤的電子密度并且不包括在所述模型中(圖2a中的點(diǎn)狀線)。有趣的是，當(dāng)受到激動(dòng)劑的刺激時(shí)，正是這些帽的高彈性區(qū)被磷酸化，其中該區(qū)停靠了四個(gè)絲氨酸殘基中的三個(gè)(437、454、505)。Ser437和Ser454的作用還不清楚，因?yàn)樵诓煌锓N中沒(méi)有保存它們。相反，在來(lái)自不同進(jìn)化物種(小雞、人類(lèi)、斑馬魚(yú)、小鼠、大鼠)的cPLA2中保存了Ser505，并且在昆蟲(chóng)細(xì)胞中為了cPLA2的最大活化作用需要由MAP激酶將其磷酸化(Lin等，1993；Qiu等，1998)。Ser505不與蛋白體或者不與晶格中其它相鄰的cPLA2單體接觸，其中Ser505在我們的晶體中很可能是異形磷酸化的并位于高彈性的、被溶劑暴露的環(huán)中。Ser505對(duì)所述活性部位和膜結(jié)合區(qū)來(lái)說(shuō)都是在末端的(見(jiàn)圖2a)；然而，值得注意的是它接近CaLB和所述催化結(jié)構(gòu)域之間的鉸合部(見(jiàn)討論)。cPLA2磷酸化作用的第四個(gè)位點(diǎn)，Ser727，是在結(jié)構(gòu)的C末端。雖然在各種物種中保存了這個(gè)位點(diǎn)，但是仍然不知道相關(guān)的功能。活性部位漏斗部分由溶劑可浸入的蓋覆蓋所述cPLA2結(jié)構(gòu)最顯著的特征為活性部位漏斗，其中該漏斗深入了三分之一進(jìn)入所述催化結(jié)構(gòu)域中，從而揭示了Ser228和Asp549位于一個(gè)深的、窄裂隙的底部中。雖然頂部寬，但是在圖5a中可見(jiàn)在所述活性部位裂隙的嘴的位置，所述漏斗縮減直徑至接近7。所述漏斗排滿了親水殘基(在圖5a為藍(lán)色)并且形成支架，其中膜磷脂底物的脂肪?；糠挚梢越Y(jié)合到支架中。
所述cPLA2的活性部位由“蓋”部分覆蓋，其中“蓋”由殘基413-457組成。所述蓋折疊到環(huán)區(qū)中，其后跟隨小螺旋序列和短轉(zhuǎn)角(見(jiàn)圖5a)。引導(dǎo)進(jìn)入所述蓋區(qū)的殘基408-412表現(xiàn)為非常大的溫度因子，并且殘基434-456沒(méi)有可追蹤的電子密度。這些觀察表明這些區(qū)是非常易移動(dòng)的并且可將其設(shè)想為“蓋鉸合部”。所述蓋的可見(jiàn)區(qū)具有兩親性質(zhì)；其暴露于溶劑的面主要由極性殘基(T416、E418、E419、E420、N423)形成，而其內(nèi)側(cè)排滿了疏水性氨基酸(M417、L421、I424)?？梢韵胂笏錾w的“雙面”特征在膜磷脂結(jié)合上發(fā)揮了一定作用，因?yàn)橐幻婢哂行纬蓺?結(jié)合接觸的能力，而另一面更易于或者與所述底物或者與所述膜發(fā)生疏水相互作用。
模擬在具有在適當(dāng)位置的蓋的cPLA2的活性裂隙中的二?；字肿拥膰L試證明酰基酯鍵不能位于沒(méi)有與周?chē)鷼埢a(chǎn)生沖突的活性部位絲氨酸的附近。因此，可以想象為了底物結(jié)合需要蓋移動(dòng)以生產(chǎn)適當(dāng)?shù)目臻g，與觀察結(jié)果相符合的提議是cPLA2在分子束而非單體底物的存在下顯示出更高的活性(Cygler和Schrag，1997)，該現(xiàn)象稱(chēng)為界面活化。
大多數(shù)脂肪酶顯示界面活化為覆蓋“關(guān)閉”形式的酶的活性部位的蓋的構(gòu)象重排的結(jié)果。所述蓋在分子團(tuán)的結(jié)合部位之上離開(kāi)，因此形成“敞開(kāi)”形式，其中催化性殘基暴露于所述底物。X-射線晶體學(xué)通過(guò)確定“關(guān)閉”和“敞開(kāi)”兩種形式的脂肪酶的結(jié)構(gòu)得出了許多這種活化機(jī)理的例子，其中在有抑制劑的情況下大部分已結(jié)晶時(shí)為“敞開(kāi)”形式(Cygler和Schrag等，1997)。cPLA2的界面活化機(jī)理可與其它包含蓋的脂肪酶的界面活化機(jī)理相比，這樣蓋移動(dòng)是增加活性部位漏斗的可接近的表面積以及提供順暢進(jìn)入所述催化性殘基的重要步驟。cPLA2活性部位包括催化二聯(lián)體α/β水解酶?；馐怯墒谷寺?lián)想到在絲氨酸蛋白酶中存在的(Ser-Asp/Glu-His)催化三聯(lián)體實(shí)施的。由親核絲氨酸攻擊所述底物的?；ユI，產(chǎn)生通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合的酰基-酶中間體，隨后該中間體被釋放出，接著參與水分子的攻擊步驟。雖然所有具有所述α/β水解酶折疊的脂類(lèi)代謝酶通過(guò)催化三聯(lián)體的作用起作用，但是鑒定這種在cPLA2中的三聯(lián)體證明是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性的工作。由Sharp和合作者(1994)發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)定向突變證實(shí)了Ser228和Asp549在催化中的作用；但是，19個(gè)組氨酸殘基中的任一個(gè)都不影響活性，這一點(diǎn)指出了新的催化機(jī)理(Pickard等，1996)。這些觀察導(dǎo)致許多人提出cPLA2包含新的催化中心，該中心不需要組氨酸參與，而仍然不知道Arg200對(duì)活性的作用(Leslie，1997；Pickard等，1996)。
cPLA2的X-射線晶體結(jié)構(gòu)清楚地顯示了活性部位，其中Ser228位于漏斗形空穴的底部；Asp549的Oδ2位于距離其Oγ原子2.9的位置上(圖5b)。但是，必須清楚的是cPLA2的活性部位沒(méi)有組氨酸殘基。另外，在6的范圍內(nèi)沒(méi)有其它能實(shí)現(xiàn)活性部位基的功能的殘基。離任一殘基3.5的范圍內(nèi)的所有極性均由主鏈基團(tuán)或由距離Asp549的Oδ1原子3.2的單獨(dú)水分子作出貢獻(xiàn)。雖然Asn555沿所述活性部位漏斗排成一行，但是它的Nδ2原子距離任一殘基大約6并且不是理想地完成這個(gè)功能的候選物。
在酰基水解酶中，當(dāng)攻擊甘油磷脂底物的sn-2位時(shí)，過(guò)渡態(tài)要求由具有穩(wěn)定形成的過(guò)渡態(tài)的負(fù)電荷的功能的“氧陰離子洞”或一組氫鍵給體(通常為酰胺原子)和/或堿性殘基來(lái)穩(wěn)定。在一些脂肪酶中，至少一個(gè)構(gòu)成所述氧陰離子洞的殘基為移動(dòng)環(huán)的一部分，并且僅當(dāng)脂肪酶為“敞開(kāi)”形式時(shí)能得到合適的構(gòu)象；但是，這種重排不是絕對(duì)必要的。在cPLA2中，Gly197和198為β4和B螺旋之間的有富含甘氨酸的彈性環(huán)的一部分；這個(gè)位置允許Gly197和Gly198的酰胺主鏈成為預(yù)先形成的氧陰離子洞成員的理想候選物(見(jiàn)圖5b)。另外，位于β5和C螺旋之間的轉(zhuǎn)角尖端的Gly229的主鏈酰胺基團(tuán)也指向Gly197環(huán)，所以也可成為所述洞的一部分。因此，這個(gè)與胰凝乳蛋白酶中的氧陰離子洞非常相似的區(qū)看來(lái)是經(jīng)過(guò)良好設(shè)計(jì)，從而能穩(wěn)定由所述酯的親核進(jìn)攻產(chǎn)生的四面體中間體。
已提出Asp200的許多作用。它涉及為CaLB提供結(jié)合所述酶到脂類(lèi)界面的幫助；與所述磷脂膜相互作用；作為催化性殘基參與反應(yīng)；穩(wěn)定?；?酶中間體；或與所述底物磷脂的磷?；嘘P(guān)(Pickard等，1996)。埋入所述漏斗中的Arg200(在圖5a中將它的表面區(qū)域染成紅色)的位置阻止它為CaLB提供任何脂類(lèi)結(jié)合的幫助。另外，其支鏈距離活性部位絲氨酸大約9，這樣可令它不能在催化中起作用。但是，Arg200與活性部位漏斗周?chē)臍埢纬闪艘恍┲匾慕佑|。所述側(cè)鏈與Thr680形成了鹽橋并且與Phe678的主鏈原子產(chǎn)生接觸，兩者都位于螺旋H和I之間的環(huán)上。氧陰離子洞上的Arg200的位置表明由Pickard和合作者(1996)報(bào)道的Arg200Lys突變體中缺少這些二氫鍵可能是微細(xì)改變氧陰離子洞環(huán)的構(gòu)象將導(dǎo)致活性的不尋常結(jié)果的原因。由cPLA2實(shí)施的通過(guò)不同于其它?；饷傅臋C(jī)理進(jìn)行的催化在cPLA2的活性部位缺乏組氨酸殘基或任何其它可能的堿基表明所述酶通過(guò)新的催化機(jī)理促使酰基水解。在絲氨酸蛋白酶和其它的水解酶中，組氨酸殘基接受了來(lái)自活性絲氨酸的羥基的質(zhì)子，因此有助于形成共價(jià)四面體中間體。在第二步中，所述?；?酶中間體由水分子水解釋放出產(chǎn)品，在所述酶中重建絲氨酸-羥基。A類(lèi)TEM-1β內(nèi)酰胺酶的催化途徑也包括活性部位絲氨酸的?；饔?，接著是酯鍵的水解作用，其從活性部位Ser70直接地(Gibson等，1990)或通過(guò)水分子(Lamotte-Brasseur等，1991)轉(zhuǎn)移了一個(gè)質(zhì)子到Glu166的羧酸根基上。更多最近的研究(Damblon等，1996)表明在Glu166和Ser70的羧酸根氧之間的長(zhǎng)距離阻止了質(zhì)子的直接轉(zhuǎn)移，但是這些研究提出了橋接水分子參與轉(zhuǎn)運(yùn)了質(zhì)子。在青霉素?；D(zhuǎn)移酶的催化機(jī)理中(Duggleby等，1995)，一個(gè)橋接水介導(dǎo)了Serl的α-氨基的堿性，其中青霉素?；D(zhuǎn)移酶包含由N末端的絲氨酸組成的單獨(dú)的殘基催化中心。結(jié)果，Serl的Oγ原子具有其足以由末端氨基增強(qiáng)的親核性，并確保形成?；?酶中間體。
在cPLA2中，唯一能充當(dāng)通用堿基(general base)的殘基為Asp549，因?yàn)镾er228的Oγ原子的3.5半徑范圍內(nèi)沒(méi)有其它的支鏈。圖6顯示了所提出的cPLA2的催化機(jī)理的模型。一旦將所述酶結(jié)合到所述膜上，就有一個(gè)磷脂分子結(jié)合在所述活性部位上。所述首基的磷酸鹽部分(圖6中的HG)由所述Arg200支鏈穩(wěn)定。也顯示了由Gly197和Gly198的主鏈酰胺基形成的氧陰離子洞，其中所述氧陰離子洞能極化sn-2酯并穩(wěn)定在板B中形成的四面體中間體。在形成所述酶-底物的配合物之后，Asp549充當(dāng)催化堿基并吸收了來(lái)自活性Ser228的羥基質(zhì)子，其中所述質(zhì)子攻擊所述sn-2酯并通過(guò)穩(wěn)定的四面體中間體形成酰基酶。接著，所述?；赣伤肿?板C)水解，生成游離的溶血-磷脂，并且當(dāng)花生四烯酸基中間體的雙鍵坍塌之后，生成游離的花生四烯酸(圖6中的AA；板D和E)。然后可使cPLA2與所述膜界面分離或與另一個(gè)磷脂物質(zhì)結(jié)合并且重復(fù)該循環(huán)。因此，cPLA2為使用沒(méi)有完整催化三聯(lián)體的親核絲氨酸的第三個(gè)獨(dú)特的例子。討論盡管cPLA2晶體具有大的不對(duì)稱(chēng)單元(1498個(gè)氨基酸)和脆性，用MAD相成功地由得自單晶的數(shù)據(jù)制作了高質(zhì)量電子密度圖。這個(gè)成功主要(central to this success)為大Bijvoet和分散了各種不同類(lèi)型的鑭系原子的Lm邊界，并結(jié)合高級(jí)光源的高通量和波長(zhǎng)穩(wěn)定性(Berkeley，CA)。隨著第三代同步加速器的到來(lái)，常規(guī)上將采用MAD來(lái)解出大分子結(jié)構(gòu)。
正如使用缺乏cPLA2的小鼠證明的那樣，cPLA2對(duì)炎癥脂類(lèi)介質(zhì)的生物合成很重要(Bonventre等，1997；Uozumi等，1997)。因?yàn)榘准?xì)胞三烯、前列腺素和PAF在主要的公共壓力(major public impact)疾病的病理生理學(xué)中起了重要作用，所以必須了解它們的生物合成如何控制。cPLA2的結(jié)構(gòu)提供了對(duì)花生四烯酸基的選擇性和由磷酸化控制的原由新的理解。此外，它鑒定了脂肪酶的新折疊和新機(jī)理。cPLA2的結(jié)構(gòu)是僅有的第二個(gè)在整個(gè)蛋白的范圍內(nèi)可見(jiàn)到C2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。可見(jiàn)到在PLCδ1和cPLA2之間的顯著區(qū)別。
所述cPLA2折疊清楚地顯示所述酶由兩個(gè)獨(dú)特的、獨(dú)立的折疊結(jié)構(gòu)域組成?；谇捌诠ぷ骺善谕玫竭@個(gè)結(jié)果，在前期工作中，當(dāng)獨(dú)立表達(dá)CaLB和催化結(jié)構(gòu)域時(shí)，兩者都具備完整的功能。但是，令人驚奇的是所述結(jié)構(gòu)域間的接觸及潛在的彈性很少。雖然通常在信號(hào)分子中觀察到C2結(jié)構(gòu)域，但是只有PLCδ1的晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)報(bào)道在所述催化結(jié)構(gòu)域的范圍內(nèi)存在C2結(jié)構(gòu)域(Essen等，1996)。在這種情況下，幾乎在所述C2結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的一面的整個(gè)表面之間存在大量的疏水接觸。相反，在cPLA2的催化結(jié)構(gòu)域和CaLB結(jié)構(gòu)域之間的相互作用受到充分地限制，因此連接了不對(duì)稱(chēng)單元的不同單體中的兩個(gè)的多肽的構(gòu)象是獨(dú)特的。這個(gè)觀察結(jié)果具有機(jī)械學(xué)的重要性，因?yàn)闆](méi)有固定所述CaLB和催化結(jié)構(gòu)域的最佳取向，但是反而可在某些方式中受到控制。有趣的是可注意到，雖然包括對(duì)蛋白在細(xì)胞中的最佳活性很重要的Ser-505的蛋白的區(qū)是無(wú)序的，但是這個(gè)重要的MAP-激酶部位位于所述鉸合部區(qū)的附近。
詳細(xì)對(duì)比cPLA2和規(guī)則的α/β水解酶折疊的結(jié)構(gòu)，結(jié)果清楚地表明cPLA2包含新的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。但是，如前文提到的一樣，包含活性部位絲氨酸的β發(fā)夾結(jié)構(gòu)與所述α/β水解酶折疊的“親核肘”在結(jié)構(gòu)上相似。cPLA2催化結(jié)構(gòu)域的Blast檢查顯示PLBs與cPLA2α、β和γ間有相同的延長(zhǎng)區(qū)，其中該延長(zhǎng)區(qū)包括殘基～190-232。這種同源性具有重要的功能，因?yàn)樗ˋrg200、包含氧陰離子洞的主鏈區(qū)以及新的GXSXS脂肪酶的基序，在所述基序中，第二個(gè)絲氨酸代替了傳統(tǒng)的甘氨酸。也由基因組的結(jié)構(gòu)來(lái)解釋同源性“集中”在短區(qū)中，其中這些殘基由單獨(dú)的編碼序列(對(duì)應(yīng)殘基186-238)編碼。
cPLA2用由Ser-228和Asp-549組成的二分體來(lái)分裂sn-2酯，而不是在所述α/β水解酶中見(jiàn)到的包括絲氨酸、組氨酸、天冬氨酸/谷氨酸的催化三分體來(lái)分裂。Asp-549的羧酸根是唯一的為了親核進(jìn)攻而足夠靠近以活化絲氨酸的殘基。對(duì)于由A類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶催化酰胺的水解反應(yīng)已提出相似的催化二分體(Matagne等，1998)。但是，在這種情況下，谷氨酸支鏈通過(guò)混雜水分子活化了絲氨酸殘基。雖然很難評(píng)價(jià)二分體與三分體的可比的效率，但是值得注意的是，達(dá)到過(guò)渡態(tài)所需的活化能在催化中很重要。因此，有效的氧陰離子洞獲得的穩(wěn)定能抵消較不親核的絲氨酸。在這個(gè)晶體結(jié)構(gòu)中，適當(dāng)?shù)匕卜帕烁拾彼?97和198的主鏈酰胺基，使其充當(dāng)所述氧陰離子洞，其中所述主鏈酰胺基放置了起碼兩個(gè)來(lái)自關(guān)鍵性的Arg-200的殘基。Gly-229的主鏈NH也可幫助穩(wěn)定建立過(guò)渡態(tài)的氧陰離子并存在于所述四面體中間體中。所述氧陰離子洞的效率與NMR研究是一致的，在該研究中花生四烯酸基三氟甲基酮似乎結(jié)合到所述酶上作為離子化的半縮酮。
cPLA2的催化絲氨酸存在于靠近所述催化結(jié)構(gòu)域的中心的深的漏斗中。模擬所述磷脂進(jìn)入活性部位的嘗試證明目前所述活性部位漏斗的構(gòu)象不足夠大。因此，我們提議某些將其C-末端連到完全無(wú)序的23個(gè)氨基酸序列上的可移動(dòng)的蓋可在膜結(jié)合部位上面移動(dòng)，因此在所述漏斗頂部的附近提供了較大的可到達(dá)的體積以容納所述底物。同時(shí)存在和缺少底物/洗滌劑分子團(tuán)的胰脂肪酶/共脂肪酶的晶體結(jié)構(gòu)提供了這個(gè)模型的先例(van Tilbeurgh等，1993)。在這個(gè)例子中，存在分子團(tuán)或抑制劑時(shí)發(fā)生了顯著的構(gòu)象變化，該變化需要蓋移動(dòng)大至29的距離以暴露所述活性裂隙和疏水斑。在其它α/β水解蛋白中已經(jīng)注意到這種大的結(jié)構(gòu)變化。用這種在膜表面結(jié)合部位上的構(gòu)象變化來(lái)解釋界面活化的過(guò)程，其中脂肪酶的催化活性對(duì)存在于分子團(tuán)中的底物來(lái)說(shuō)比對(duì)以單體存在的底物的活性大幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
在cPLA2的例子中，用其溶血磷脂酶對(duì)比其對(duì)以單體或分子團(tuán)的部分存在的相同底物的活性。這種測(cè)量顯示cPLA2的活性增加了大約1500倍，而1-棕櫚酰-2-溶血磷脂酰膽堿的濃度僅增加了10倍；因此，cPLA2對(duì)以表面存在的底物活潑得多。我們的結(jié)構(gòu)顯示由彈性蓋的移動(dòng)支配的構(gòu)象變化發(fā)生在膜結(jié)合部位上方；這個(gè)觀察結(jié)果與先前界面活化的觀察結(jié)果一致。
除了移動(dòng)覆蓋所述活性部位的蓋之外，一些結(jié)構(gòu)顯示穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)的氧陰離子洞僅當(dāng)存在結(jié)合底物或抑制劑時(shí)才能完全形成(Cygler和Schrag，1997)。角質(zhì)素酶(cutinase)對(duì)這個(gè)通用規(guī)則是例外，因?yàn)樗鲅蹶庪x子洞在天然結(jié)構(gòu)中完全形成。重要地是，角質(zhì)素酶不顯示界面活化(Martinez等，1992)。
對(duì)包含花生四烯酸基的磷脂來(lái)說(shuō)，cPLA2的選擇性是一個(gè)不同的特征。低分子量sPLA2s不能從不同的脂肪酸區(qū)別開(kāi)來(lái)，但是在許多試驗(yàn)版本中，cPLA2對(duì)花生四烯酸基和其它在5和8位具有順-雙鍵的脂肪酸顯示出高的選擇性(Clark等，1995；Gelb aasn-1和sn-2，Gelb肼)。在確定結(jié)構(gòu)之前，不知道cPLA2選擇性的起因?？梢韵胂笏龃呋瘷C(jī)器位于酶的表面，在那里它能對(duì)sn-2酯起作用，同時(shí)沒(méi)有將所述脂類(lèi)從雙層中提取出。這與PI4激酶的壓扁的激酶結(jié)構(gòu)域類(lèi)似，對(duì)于PI4激酶認(rèn)為所述酶對(duì)脂類(lèi)的首基起作用，同時(shí)不提取出磷脂本身(Rao等，1998)。在cPLA2的例子中，我們期望所述選擇性歸因于由于更松地包裝了聚不飽和脂肪酸而導(dǎo)致更多地暴露了sn-2酯。但是，正如我們?cè)谒鼋Y(jié)構(gòu)中見(jiàn)到的那樣，所述磷脂必須結(jié)合進(jìn)入到所述深活性部位大約8-10。因此，所述選擇性必須歸因于花生四烯酸基部分和酶之間的相互作用?？蔀榕cα和γcPLA2不同的殘基(也就是位于活性部位和完全未保護(hù)的蓋區(qū)中)的突變提供信息以測(cè)定選擇性的不同。依照本發(fā)明鑒定的物質(zhì)的優(yōu)選給藥方法和劑量如在本文中的使用，“磷脂酶的酶活性”指在磷脂代謝試驗(yàn)(優(yōu)選在下文實(shí)施例2中描述的或在任何結(jié)合到本文中的參考文獻(xiàn)中描述的一種試驗(yàn))中的正活性。當(dāng)化合物在任何可得的酶活性試驗(yàn)(優(yōu)選在下文實(shí)施例70中描述的試驗(yàn))中抑制磷脂酶(優(yōu)選cPLA2)的活性時(shí)，它具有“磷脂酶的酶抑制活性”。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物具有以下三個(gè)值(1)在LysoPC試驗(yàn)中IC50值小于大約25μM；(2)在vesicle試驗(yàn)中IC50值小于大約50μM；和/或(3)在PMN試驗(yàn)中IC50值小于大約1μM。
本發(fā)明的化合物和熊果酸能有效抑制磷脂酶(優(yōu)選cPLA2)的活性，因此，用于“治療”(也就是治療、預(yù)防或改善)炎癥或與炎癥有關(guān)的疾病(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、氣喘、炎性腸疾病和其它由前列腺素、白細(xì)胞三烯或PAF作為介導(dǎo)的疾病)以及其它疾病，例如骨質(zhì)疏松、結(jié)腸炎、骨髓性白血病、糖尿病、萎縮病和動(dòng)脈粥樣硬化。
本發(fā)明既包括藥物組合物又包括使用本發(fā)明化合物治療或使用的治療方法。
當(dāng)與藥學(xué)可接受的載體結(jié)合時(shí)，本發(fā)明的化合物可用于藥物組合物中。這種組合物也可包括(除了化合物或本發(fā)明的化合物和載體之外)稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和其它本領(lǐng)域已知的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”指不妨礙活性成分的生物活性的有效性的無(wú)毒物質(zhì)。載體的性質(zhì)依賴(lài)于給藥方式。本發(fā)明的藥物組合物也可包括細(xì)胞因子、淋巴因子或其它造血因子例如M-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、G-CSF、Meg-CSF、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子和紅細(xì)胞生成素。所述藥物組合物還可包括其它抗炎試劑。這些加入的因子和/或試劑可包括在所述藥物組合物中，從而與本發(fā)明的化合物一起產(chǎn)生協(xié)同作用，或盡可能減少由本發(fā)明的化合物引起的副作用。相反地，本發(fā)明的化合物可包括在具體的細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓劑或抗凝血因子或抗炎試劑的藥物制劑中以盡可能減少由細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓劑或抗凝血因子或抗炎試劑引起的副作用。
本發(fā)明的藥物組合物可為脂質(zhì)體形式，其中，將本發(fā)明的化合物與除其它藥學(xué)可接受的載體之外的兩親試劑例如以聚集體形式存在的脂類(lèi)合并，而聚集體形式如分子團(tuán)、不溶的單分子層、液晶或水溶液中的片層。適用于脂質(zhì)體制劑的脂類(lèi)包括但不限于甘油單酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽汁酸等。這些脂質(zhì)體制劑的制備方法是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的水平范圍內(nèi)，例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,235,871；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,501,728；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,837,028和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,737,323中的公開(kāi)，將它們?nèi)客ㄟ^(guò)引用結(jié)合到本文中。
如在本文中的使用，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指所述藥物組合物或方法中每種活性組分的總量，該量足以表現(xiàn)出有意義的病人利益，也就是治療、康復(fù)、預(yù)防或改善炎癥反應(yīng)或疾病，或提高治療、康復(fù)、預(yù)防或改善這些疾病的速度。當(dāng)應(yīng)用于單獨(dú)給藥的獨(dú)立的活性成分時(shí)，所述術(shù)語(yǔ)只是單指那個(gè)組分。當(dāng)應(yīng)用于組合物時(shí)，不管以組合物形式連續(xù)或同時(shí)給藥，所述術(shù)語(yǔ)指的是產(chǎn)生治療效果的活性組分的組合的總量。
在實(shí)施本發(fā)明的治療方法或使用方法時(shí)，將治療有效量的本發(fā)明的化合物給藥于待治療的帶病的哺乳動(dòng)物?？梢勒毡景l(fā)明，將本發(fā)明的化合物單獨(dú)給藥或者結(jié)合其它療法給藥，其它療法如使用其它抗炎試劑、細(xì)胞因子、淋巴因子或其它造血因子。當(dāng)與一種或多種其它的抗炎試劑、細(xì)胞因子、淋巴因子或其它造血因子共同給藥時(shí)，本發(fā)明的化合物可同時(shí)與其它的抗炎試劑、細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓劑或抗凝血因子一起給藥，或者依次給藥。如果依次給藥，主治醫(yī)生將決定本發(fā)明的化合物與其它的抗炎試劑、細(xì)胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶栓劑或抗凝血因子組合的適合給藥次序。
可使用各種通用的方法來(lái)服用用于所述藥物組合物的本發(fā)明的化合物或者來(lái)實(shí)踐本發(fā)明的方法，其中通用的方法的例子為口服、攝食、吸入或皮膚、皮下或靜脈注射。
當(dāng)將治療有效量的本發(fā)明的化合物口服給藥時(shí)，本發(fā)明的化合物可為片劑、膠囊劑、粉末劑、溶液劑或酏劑的形式。當(dāng)以片劑形式給藥時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物還可包含固體載體例如明膠或佐劑。所述片劑、膠囊劑和粉末劑包含大約5到95％的本發(fā)明化合物，優(yōu)選大約25到90％的本發(fā)明化合物。當(dāng)以液體形式給藥時(shí)，可加入液體載體例如水、石油、源于動(dòng)物或植物的油如花生油、礦物油、大豆油、或芝麻油或合成油。液體形式的藥物組合物還可包含生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖類(lèi)溶液，或二元醇類(lèi)物質(zhì)如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當(dāng)以液體形式給藥時(shí)，所述藥物組合物包括大約0.5到90％重量的本發(fā)明化合物，優(yōu)選大約1到50％的本發(fā)明化合物。
當(dāng)治療有效量的本發(fā)明化合物由靜脈、皮膚或皮下注射給藥時(shí)，本發(fā)明的化合物應(yīng)為無(wú)致熱原的、腸胃外可接受的水溶液的形式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知制備這種腸胃外可接受的蛋白溶液的方法，在制備中適當(dāng)?shù)乜紤]到pH值、等張性、穩(wěn)定性及類(lèi)似性質(zhì)。除了本發(fā)明的化合物之外，優(yōu)選用于靜脈、皮膚或皮下注射的藥物組合物還應(yīng)包括等滲媒介物如氯化鈉注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸鹽林格注射液或其它本領(lǐng)域已知的媒介物。本發(fā)明的藥物組合物也可包括穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑或本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的其它添加劑。
在本發(fā)明藥物組合物中本發(fā)明化合物的用量依賴(lài)于待治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性，并依賴(lài)于病人經(jīng)歷的前期治療的性質(zhì)。最終，主治醫(yī)生決定本發(fā)明化合物的用量以治療每個(gè)獨(dú)立的病人。初始時(shí)，主治醫(yī)生將給病人服用低劑量的本發(fā)明化合物并觀察病人的反應(yīng)。直到獲得病人的最佳治療效果后才給他服用較大劑量的本發(fā)明化合物，這時(shí)不再增加劑量?？紤]用于實(shí)施本發(fā)明方法的各種藥物組合物應(yīng)包括每公斤體重大約0.1μg到大約100mg(優(yōu)選大約100μg到大約50mg，更優(yōu)選大約100μg到大約5mg)的本發(fā)明化合物。
使用本發(fā)明的藥物組合物的靜脈療法的持續(xù)期依賴(lài)于每個(gè)獨(dú)立的病人的待治療的疾病的嚴(yán)重性和疾病以及可能的特異反應(yīng)而變化?？紤]每次使用本發(fā)明化合物的持續(xù)期為持續(xù)靜脈給藥12到24小時(shí)。最終，主治醫(yī)生將決定適當(dāng)?shù)氖褂帽景l(fā)明的藥物組合物的靜脈療法的持續(xù)期。
將全長(zhǎng)人類(lèi)cPLA2(殘基1-749)克隆到載體pMT2-EMC-cPLA2中并轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。如在Lin等(1992)中描述的那樣，所得的細(xì)胞系E5-CHO在包含10％體積的透析的胎牛血清和10μM氨甲蝶啉的α介質(zhì)(Gibco)中生長(zhǎng)。細(xì)胞小球一般溶解在pH值為9.0的緩沖液中并且隨后用硫酸銨沉淀上清液中的cPLA2。包括親合層析和大小排阻層析的多步驟產(chǎn)生適合結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的蛋白樣品。一般從100g小球得到的產(chǎn)量為15-25mg的純cPLA2。
在18℃使用PEG1000為沉淀劑使用12mg/ml蛋白質(zhì)由蒸汽擴(kuò)散得到cPLA2的晶體。一般，過(guò)夜后出現(xiàn)平板形晶體并且在一星期內(nèi)，可繼續(xù)生長(zhǎng)出最大尺寸為0.6mm×0.5mm×0.1mm的晶體。通過(guò)將天然和滲入重原子的晶體轉(zhuǎn)移到不斷增加量PEG 400和DMSO中進(jìn)行低溫防護(hù)。通過(guò)在低溫溶液中浸泡天然晶體過(guò)夜，用250μM GdCl2或TbCl2代替CaCl2來(lái)制備重原子改性的晶體。收集數(shù)據(jù)之前把用低溫保護(hù)的晶體在100K的液氮流中快速冷卻。
在高級(jí)光源的光束(beamline)5.0.2使用Quantum 4 CCD檢測(cè)器(面檢測(cè)器系統(tǒng))收集天然的、浸泡Gd和Tb的cPLA2晶體的衍射數(shù)據(jù)。由于晶體敏感性，用STRATEGY(R.Ravelli)分析每個(gè)數(shù)據(jù)組的第一個(gè)圖象，以計(jì)算出一個(gè)完整數(shù)據(jù)組所要求收集的數(shù)據(jù)的最少量。當(dāng)確定了最佳起點(diǎn)后，經(jīng)90°掃描收集數(shù)據(jù)，此后旋轉(zhuǎn)所述晶體至離起點(diǎn)180°的位置并收集第二次90°的掃描以最大化Bijvoet對(duì)的積累。在收集接近100°數(shù)據(jù)后，晶體表現(xiàn)出輻射敏感性，這使得必須在波長(zhǎng)變化之間沿旋轉(zhuǎn)軸解釋這些數(shù)據(jù)。這個(gè)方法學(xué)證明從顯示相似統(tǒng)計(jì)結(jié)果的三個(gè)不同波長(zhǎng)收集數(shù)據(jù)組是成功的。在100K收集所有數(shù)據(jù)并用DENZO/SCALEPACK(Otwinowski，1993)進(jìn)行處理。重原子部位-兩個(gè)Tb部位都由反常Patterson圖的視覺(jué)檢查鑒定，其中反常Patterson圖使用在Tb Lm邊緣的最大波長(zhǎng)收集的衍射數(shù)據(jù)(見(jiàn)表1)，確認(rèn)先前在內(nèi)部Raxis IV檢測(cè)器(Molecular Structure Corp.)中收集的較低分辨率的鋱和鎘的數(shù)據(jù)組的結(jié)果。用SHARP(de la Fortelle& Bricogne，1997)完成重原子參數(shù)的精修及定相。如在SHARP中執(zhí)行一樣，在SOLOMON(CCP4)中完成密度修改。高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)性3.2電子密度圖應(yīng)考慮整個(gè)CaLB結(jié)構(gòu)域的位置以及所述催化結(jié)構(gòu)域(QUANTA)的初始蹤跡和序列排布；這個(gè)方法幫助計(jì)算包圍所述蛋白區(qū)的面層(mask)，該面層包括在更多的計(jì)算中。這些包括柱形圖匹配(histogrm matching)(Zhang和Main，1990)、雙重非結(jié)晶學(xué)的對(duì)稱(chēng)平均(symmetry averging)以及用在DM中的天然衍射數(shù)據(jù)由3.2至2.5的相擴(kuò)展(phase extension)(Cowtan等，1996)。用REFMAC實(shí)施相循環(huán)的結(jié)合和精修(Murshudov等，1997)，產(chǎn)生能鑒定大部分模型的圖，包括所述彈性蓋的中心殘基。精修-使用重建的循環(huán)以及在XPLOR中(Brünger，1992b)位置與熱參數(shù)的精修來(lái)改進(jìn)所述模型，在Rfree下降低于32％之后(Brünger等，1992a)進(jìn)行模擬退火精修(12-2.5)。如同在BUSTER(Bricogne，1993)中完成那樣，在通過(guò)最相似的精修生成的省略圖(omit map)的幫助下，實(shí)施隨后的建立模型的步驟。精修也包括均勻的總?cè)軇┬Ｕ?uniform bulk solvent correction)(Bsol＝23.82；Ksol＝0.305e-/3)和非晶體學(xué)對(duì)稱(chēng)性限制的應(yīng)用。在整個(gè)精修過(guò)程中，使用除了10％隨機(jī)選擇的用于計(jì)算Rfree的試驗(yàn)組之外的所有F＞2.0的衍射數(shù)據(jù)。使用Fo-Fc圖定位水分子，其中水分子位于顯示出密度＞3.0σ的部位并且顯示出合理的沒(méi)有空間沖突的蛋白-溶劑氫鍵的距離。最終模型包括1285個(gè)殘基(分子A9-433、456-500、537-727)和40個(gè)水分子，并顯示了良好的立體化學(xué)，具有平均分別偏離理想幾何學(xué)0.010和1.38°的鍵長(zhǎng)和鍵角。使用12和2.5(表I)之間的衍射數(shù)據(jù)，總自由R值為29.7％并且所述R值為24.3％。[有意留的空白頁(yè)]Rsym＝∑|Ih-<Ih>|/∑Ih，其中<Ih>為平均強(qiáng)度與對(duì)稱(chēng)當(dāng)量之比。
￡Friedel對(duì)分離(Friedel pairs separate)。
相位能＝∑|FH|/∑||FPHobs|-|FPHcalc||R＝∑||Fo|-|Fc|/∑|Fo|，其中計(jì)算Rfree為隨機(jī)挑選的10％反射并且計(jì)算Rfactor為剩余的90％的用于結(jié)構(gòu)精修的反射(F＞2.0)。
將坐標(biāo)存入Brookhaven蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。
此處所有引用的參考文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中來(lái)，就如在此完全闡述一樣。
權(quán)利要求
1.結(jié)晶cPLA2。
2.權(quán)利要求1的結(jié)晶cPLA2，其中所述cPLA2為人類(lèi)cPLA2。
3.權(quán)利要求1的結(jié)晶cPLA2，其中所述cPLA2為來(lái)自非哺乳動(dòng)物物種的cPLA2。
4.權(quán)利要求1的結(jié)晶cPLA2，其中所述cPLA2為重組的cPLA2。
5.權(quán)利要求1的結(jié)晶cPLA2，其中所述cPLA2包含天然存在的cPLA2的成熟序列。
6.一種包含cPLA2的結(jié)晶組合物，所述結(jié)晶組合物與第二種化學(xué)物種締合。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述第二種化學(xué)物種選自cPLA2活性的潛在抑制劑和cPLA2結(jié)合的潛在抑制劑。
8.一種cPLA2的結(jié)構(gòu)模型，所述模型包含具體體現(xiàn)cPLA2結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)組。
9.權(quán)利要求8的模型，其中所述數(shù)據(jù)組由cPLA2的晶體學(xué)分析確定。
10.權(quán)利要求8的模型，其中所述數(shù)據(jù)組由cPLA2的NMR分析確定。
11.權(quán)利要求8的模型，其中所述數(shù)據(jù)組具體體現(xiàn)了cPLA2的整體結(jié)構(gòu)。
12.權(quán)利要求8的模型，其中所述數(shù)據(jù)組具體體現(xiàn)了cPLA2的部分結(jié)構(gòu)。
13.權(quán)利要求12的模型，其中所述部分為cPLA2的活性部分。
14.權(quán)利要求12的模型，其中所述部分為cPLA2的CaLB結(jié)構(gòu)域。
15.一個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)硬件和權(quán)利要求8的模型。
16.一種鑒定為cPLA2的活性或結(jié)合的激動(dòng)劑或拮抗劑的物種的方法，所述方法包括(a)提供權(quán)利要求8的模型；(b)研究候選物種與這個(gè)模型的相互作用，和(c)選擇預(yù)期可充當(dāng)所述激動(dòng)劑或拮抗劑的物種。
17.一種經(jīng)過(guò)按照權(quán)利要求16的方法鑒定的物質(zhì)。
18.一種鑒定抑制cPLA2活性或結(jié)合的物質(zhì)的方法，所述方法包括確定候選物質(zhì)與cPLA2的結(jié)構(gòu)模型之間的相互作用。
19.一種鑒定模擬cPLA2活性或結(jié)合的物質(zhì)的方法，所述方法包括確定候選物質(zhì)與cPLA2的結(jié)構(gòu)模型之間的相互作用。
20.一種通過(guò)合理的藥物設(shè)計(jì)鑒定cPLA2活性的抑制劑的方法，所述方法包括(a)基于cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)，設(shè)計(jì)與cPLA2的活性部位中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸形成非共價(jià)鍵的潛在抑制劑；(b)合成所述抑制劑；并且(c)確定所述潛在抑制劑是否能抑制cPLA2的活性。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)得自空間群P21212的cPLA2晶體，其中a＝153.59埃，b＝95.49埃和c＝139.13埃。
22.權(quán)利要求20的方法，其中設(shè)計(jì)所述抑制劑與cPLA2活性部位中的所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)原子相互作用，并且其中所述一個(gè)或多個(gè)原子選自Ser228的CB和Oγ原子；Asp549和Asp575的Oδ1和Oδ2原子；Arg200、Arg413和Arg579的CB、CG、CD、NE、CZ、NH1和NH2原子；Trp393的主鏈羰基氧；Asn555的Nδ2和Oδ1原子；Phe397、Phe681、Phe683和Phe199的CD1、CE1、CG、CZ、CE2和CD2原子；Trp232和Trp393的CG、CD1、NE1、CE2、CZ2、CH2、CZ3、CE3和CD2；Ser577的CB和Oγ原子；Cys331的CB和Sγ原子；Glu589的OE1和OE2原子；Lys588的CB、CG、CD、CE和NZ原子；Thr680的Oγ1原子；Glu418和Glu422的OE1和OE2原子；Met417的CB、CG、SD和CE原子；Leu400和Leu421的CB、CG、CD1和CD2原子；Ile424的CB、CG1、CG2或CD1原子；Ala578的主鏈NH和羰基氧原子；和His639的CB、CG、ND1、CE1、NE2和CD2原子。
23.一種通過(guò)合理的藥物設(shè)計(jì)鑒定cPLA2膜結(jié)合的抑制劑的方法，所述方法包括(a)基于cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)，設(shè)計(jì)與cPLA2的靜電斑區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸形成非共價(jià)鍵的潛在抑制劑；(b)合成所述抑制劑；并且(c)確定所述潛在抑制劑是否能抑制cPLA2的膜結(jié)合。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)得自空間群P21212的cPLA2晶體，其中a＝153.59埃，b＝95.49埃和c＝139.13埃。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸選自Arg467、Arg485、Lys488、Lys544和Lys543。
26.一種由權(quán)利要求20的方法鑒定的激動(dòng)劑或拮抗劑。
27.一種由權(quán)利要求23的方法鑒定的激動(dòng)劑或拮抗劑。
28.一種由權(quán)利要求18的方法鑒定的物質(zhì)。
29.一種由權(quán)利要求19的方法鑒定的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)晶的cPLA2。用這種材料也解出了cPLA2的晶體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了基于這種晶體結(jié)構(gòu)的模型。本發(fā)明還公開(kāi)了使用這種模型來(lái)鑒定cPLA2活性和膜結(jié)合的抑制劑的方法。
文檔編號(hào)C12N9/20GK1348502SQ00806185
公開(kāi)日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2000年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月15日
發(fā)明者A·德森, W·S·索默斯, M·L·斯塔爾, J·S·塞拉 申請(qǐng)人:遺傳研究所有限公司