專利名稱：分離自丁香假單胞菌的抗真菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丁香假單胞菌(P.syringae)縮酚十肽類(depsidecapeptides)、產(chǎn)生這些肽類的方法、以及利用該肽類的抗真菌活性的方法。
背景真菌性感染是導(dǎo)致人類，特別是免疫損傷的病人生病、生活質(zhì)量降低以及死亡率升高的一個顯著原因。在過去20年里由于人類的真菌感染導(dǎo)致的發(fā)病率顯著上升。這種現(xiàn)象部分是由于免疫系統(tǒng)被器官移植、癌癥化療、AIDS、衰老、或其它類似的障礙或條件所削弱或破壞的人群數(shù)量的增加而引起的。這些病人易于受到真菌病原體的攻擊，這些病原體在人群中非常普遍但是受到功能正常的免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。這些病原體非常難于控制，因為目前的一些抗真菌制劑要么具有高毒性，要么僅僅抑制真菌活性。例如，多烯類物質(zhì)是一種殺菌劑但是具有毒性；而吡咯類物質(zhì)毒性小得多但是僅具有抑制真菌的作用。更為重要的，最近有關(guān)于假絲酵母屬的部分菌株具有吡咯和多烯抗性的報道，這樣就嚴重限制了對這些菌株的治療的選擇余地。
丁香假單胞菌能夠產(chǎn)生幾類具有抗真菌或抗生素活性劑，例如假單胞霉素(pseudomycin)、丁香霉素、丁香毒素(syringotoxin)和丁香因子(syringostatin)，這些物質(zhì)都屬于脂縮酚九肽(lipodepsinonapeptide)。丁香假單胞菌的天然菌株和轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的突變體能夠產(chǎn)生這些脂縮酚九肽。一些假單胞霉素和丁香霉素和其它的脂縮酚肽類抗真菌劑已經(jīng)被分離、化學(xué)表征以及顯示出很廣的抗真菌活性譜，包括抗對人類和植物重要的真菌病原體的活性。假單胞霉素、丁香霉素、丁香毒素和丁香因子代表了具有顯著結(jié)構(gòu)特征的抗真菌化合物族系。
還沒有任何一種丁香假單胞菌的脂縮酚九肽類物質(zhì)被投入市場用于抗真菌治療。不良副作用的發(fā)現(xiàn)、生產(chǎn)制劑、放大生產(chǎn)以及其它發(fā)展問題大大的妨礙了丁香假單胞菌脂縮酚九肽類物質(zhì)在抗影響動物、人類和植物的全部范圍的真菌方面的開發(fā)。目前存在對一種能夠用于抗特定感染的抗真菌制劑的需求，這種感染不能被現(xiàn)存的其它抗真菌制劑所治療，以及對抗動物、人類以及植物感染的應(yīng)用的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種由丁香假單胞菌產(chǎn)生的縮酚十肽，它含有不常見的氨基酸高絲氨酸(Hse)、脫氫氨基丁酸(Dhb)和脫氫丙氨酸(Dha)，作為一個縮酚十肽環(huán)的組成部分。更為具體的，丁香假單胞菌縮酚十肽包含一個縮酚十肽環(huán)結(jié)構(gòu)，該環(huán)含有精氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸、脫氫氨基丁酸和脫氫丙氨酸，以及一個由精氨酸的羧基基團和蘇氨酸的氨基基團形成的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。從丁香假單胞菌中分離后，縮酚十肽成為脂縮酚十肽一個與親脂性部分結(jié)合的環(huán)狀多肽。典型的該親脂性部分是通過酰胺鍵與蘇氨酸的氨基基團偶聯(lián)的脂肪酸。優(yōu)選的，該脂肪酸部分是一個n-十二烷酸。該脂縮酚十肽可以用式I表示 其中R是親脂性部分。親脂性部分包括C9-C15烷基、C9-C15羥烷基、C9-C15二羥烷基、C9-C15烯基或C9-C15二羥烯基。優(yōu)選的，親脂性部分是C11烷基。烷基、羥烷基、二羥烷基、烯基、羥烯基、二羥烯基基團可以具有分枝或沒有。優(yōu)選的，縮酚十肽環(huán)的氨基酸序列是蘇氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-谷氨酸胺-高絲氨酸-脫氫氨基丁酸-丙氨酸-脫氫丙氨酸-蘇氨酸-精氨酸，在此稱之為“25-B1十肽”或“Thr-Ala-Thr-Gln-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Thr-Arg(SEQ ID NO1)”。如此所用的術(shù)語“25-B1十肽抗真菌因子A”指的是特定的具有優(yōu)選氨基酸序列SEQ ID NO1和R＝不分支C11烷基(即R＝-(CH2)10CH3)的縮酚十肽分子。
本發(fā)明也涉及利用丁香假單胞菌縮酚十肽的方法，以在需要它的病人體內(nèi)抑制真菌活性或降低真菌感染癥狀。這樣的方法能夠殺死真菌、降低真菌感染的痛苦、降低過高的體溫以及改善病人的整體健康水平。因此，丁香假單胞菌縮酚十肽可以被用于制造一種治療如上所描述的病人的藥物。本發(fā)明的方法和藥物對諸如近平滑假絲酵母、白色假絲酵母、新生隱球酵母或莢膜組織胞漿菌的真菌效果顯著。
本發(fā)明介紹了在一種方法中應(yīng)用微生物以制取諸如丁香假單胞菌縮酚十肽，以及包括25-B1十肽等抗真菌劑。該方法包括在包含有3種或更少的氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)丁香假單胞菌以及從該培養(yǎng)物中回收一種或幾種丁香假單胞菌縮酚十肽的方法。在一個實施方案中，丁香假單胞菌的培養(yǎng)是在含有甘氨酸和一種脂類、一種馬鈴薯產(chǎn)品或它們的組合的培養(yǎng)基中于pH值約為4到6.5的環(huán)境下進行的，直到產(chǎn)生的一種或更多的丁香假單胞菌縮酚十肽的濃度至少達到10g/mL。另外，本發(fā)明提供了通過上述方法制備的丁香假單胞菌縮酚十肽。
本發(fā)明也提供了一種處理或防止真菌在植物中生長的方法，在該方法中一種真菌和上述的一種或更多丁香假單胞菌縮酚十肽相接觸。
詳細描述脂縮酚十肽抗真菌制劑如此處所用的“脂縮酚十肽抗真菌制劑”指的是一種抗真菌制劑，該制劑具有以內(nèi)酯結(jié)構(gòu)封閉的十肽環(huán)，以及一個附加的憎水基團，如脂肪酸部分。脂縮酚十肽抗真菌制劑是被丁香假單胞菌產(chǎn)生的。這一類化合物的一個代表，25-B1十肽抗真菌制劑A，已經(jīng)被分離純化而且其結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定。如此處所用的術(shù)語“丁香假單胞菌脂縮酚十肽”指的是一種由丁香假單胞菌產(chǎn)生的脂縮酚十肽抗真菌制劑，并且包括25-B1十肽抗真菌制劑A以及相關(guān)的類似物。
各種丁香假單胞菌脂縮酚十肽共同具有某些結(jié)構(gòu)特征。例如，這些抗真菌制劑中的每一個都包含有不常見氨基酸高絲氨酸(Hse)、脫氫氨基丁酸(Dhb)和脫氫丙氨酸(Dha)作為一個縮酚十肽環(huán)的組成部分。在每一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽中，精氨酸的羧基基團連接到N-末端蘇氨酸的羥基基團上，形成一個封閉該縮酚十肽環(huán)的內(nèi)酯。丁香假單胞菌脂縮酚十肽的縮酚十肽環(huán)的序列可以表示如下Thr-Xaa-Xbb-Xcc-Hse-Dhb-Xdd-Dha-Xee-Arg其中，每一個Xaa、Xbb、Xcc、Xdd和Xee分別是天然存在的氨基酸。不像假單孢菌素天然產(chǎn)物，本發(fā)明的脂縮酚十肽不含氯蘇氨酸，它被懷疑為是藥劑成分中含有假單孢菌素化合物藥物在注射位點產(chǎn)生刺激的原因。
縮酚十肽環(huán)通過與N-末端蘇氨酸的氨基形成酰胺鍵連接到一個親脂性部分上，如脂肪酸。該脂肪酸一般含有10、12、14或16個碳原子，典型的含有0、1或2個羥基基團。該脂肪酸可以是分支的或不分支的，而且也可以含有至少一個不飽和部份。優(yōu)選的脂肪酸部分包括n-癸酸部分、用一個或兩個羥基基團取代的n-癸酸部分、n-十二烷酸部分或用一個或兩個羥基基團取代的十二烷酸部分，n-十四烷酸部分或用一個或兩個羥基基團取代的n-十四烷酸部分。25-B1十肽抗真菌制劑如此處所用的，“25-B1十肽抗真菌制劑”指的是從細菌丁香假單胞菌中分離得到的抗真菌制劑家族中的一個或更多的成員。一種25-B1十肽抗真菌制劑是丁香假單胞菌脂縮酚十肽。特別的，一種25-B1十肽抗真菌制劑是具有縮酚十肽環(huán)的脂縮酚十肽，該環(huán)具有如下序列Thr-Ala-Thr-Gln-Hse-Dhb-Ala-Dha-Thr-Arg(SEQ ID NO1)每一種25-B1十肽抗真菌制劑具有同樣的環(huán)狀肽核心，但它們在相連的憎水側(cè)鏈上有所不同。25-B1十肽抗真菌制劑包括25-B1十肽抗真菌制劑A。
25-B1十肽抗真菌制劑包含一個通過與N-末端蘇氨酸的氨基基團形成的酰胺鍵相連的脂肪酸。25-B1十肽抗真菌制劑A的該脂肪酸部分是一種n-癸酸部分。丁香假單胞菌脂縮酚十肽的生物學(xué)活性一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽，例如25-B1十肽抗真菌制劑A，具有一些生物學(xué)活性，包括殺死和抑制不同真菌，如植物和動物的真菌病原體，的活性，特別的，一種25-B1十肽抗真菌制劑是有效的抗引起免疫損傷病人機會性感染的真菌的抗真菌制劑。這些真菌包括新生隱球菌、莢膜組織胞漿菌和包括近平滑念珠菌和白色念珠菌在內(nèi)的各種不同種類的念珠菌。丁香假單胞菌丁香假單胞菌包括一般與植物相關(guān)的范圍很廣的細菌。一些丁香假單胞菌是植物病原體，而其它的僅僅是輕微致病或是腐生菌。很多不同的丁香假單胞菌的分離菌種產(chǎn)生一種或更多細胞毒性因子，這些制劑可以幫助該細菌在必須與真菌和其他細菌競爭的野外環(huán)境中生存。丁香假單胞菌產(chǎn)生的細胞毒性劑包括抗真菌劑，例如丁香假單胞菌脂縮酚十肽類，包括25B-1十肽抗真菌制劑A的、假單孢菌素、丁香霉素、丁香毒素和丁香因子。
經(jīng)過分離的，可以產(chǎn)生一種或更多假單孢菌素、丁香霉素、丁香毒素和丁香因子的假單胞菌菌株為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。野生型菌株MSU 174和通過轉(zhuǎn)座子作用產(chǎn)生的該菌株的一個突變體，MSU 16H(ATCC 67028)已經(jīng)在1996年11月9日授予G.Strobel等的美國專利號5.576.298的專利中、Harrison等人發(fā)表于《遺傳微生物雜志》1991年137期2857-2865頁的“Pseudomycins，a family of novelpeptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrumantifungal activity”一文中和Lamb等發(fā)表于Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987年84期6447-6451頁的“Transposon mutagenesis andtagging of fluorescent pseudomonasAntimycotic production isnecessary for control of Dutch elm disease”一文中進行了描述。培養(yǎng)各種不同的丁香假單胞菌菌株的方法以及其在生產(chǎn)諸如假單孢菌素的抗真菌劑中的作用也在Matthew D.Hilton等人的美國專利申請序號PCT/US00/08728的申請中進行了公開，該申請被命名為“Pseudomycin Production By Pseudomonas Syringae”，該申請與本專利申請同期提交，并在下文中進行了描述。本段引用的參考文獻的公開在此引入作為參考。
適于用作一種或更多諸如25-B1十肽抗真菌劑A的丁香假單胞菌脂縮酚十肽生產(chǎn)的丁香假單胞菌菌株能夠從包括植物，例如大麥植物、柑橘類植物和丁香類植物，在內(nèi)的環(huán)境資源中和森林地面落葉層、土壤、水、空氣和灰塵中分離得到。本發(fā)明包括一種菌株、一種分離物和一種以超過10μg/ml的數(shù)量，優(yōu)選的從最少約10μg/ml到約50μg/ml的數(shù)量，產(chǎn)生一種或更多諸如25-B1十肽抗真菌劑A的丁香假單胞菌脂縮酚十肽的生物學(xué)純化的丁香假單胞菌培養(yǎng)物。優(yōu)選的，該微生物生物學(xué)純化培養(yǎng)物是丁香假單胞菌菌株MSU 16H、25-B1、67H1、7H9-1或一種產(chǎn)生假單孢菌素的突變體，變種，分離菌或這些菌株的重組體。MSU 16H培養(yǎng)物保存在Montana StateUniversity(Bozeman，Montana，USA)，而且也可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Parklawn Drive，Rockville，MD，USA)保藏編號ATCC67028得到。
一株適于用作一種或更多諸如25-B1十肽抗真菌劑A的丁香假單胞菌脂縮酚十肽生產(chǎn)的丁香假單胞菌菌株能夠從包括植物，例如大麥植物、柑橘類植物和丁香類植物，在內(nèi)的環(huán)境資源中和森林地面落葉層、土壤、水、空氣和灰塵中分離得到。一株優(yōu)選的菌株是從植物中分離得到的。這些丁香假單胞菌的環(huán)境分離菌可以認為是野生型。如此處所用的，“野生型”指的是一種在普通丁香假單胞菌群體中自然發(fā)生的具有優(yōu)勢的基因型(即在自然界發(fā)現(xiàn)而不是通過實驗室操作產(chǎn)生的菌株或分離菌)。在與其它生物體作用的條件下，本發(fā)明采用的產(chǎn)生脂縮酚十肽的培養(yǎng)物，丁香假單胞菌株如MSU 174、MSU 16H、MSU206、25-B1和7H9的特征易于變異。因此，這些菌株的后代，例如，重組體、突變體和變種，可以通過為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法獲得。
丁香假單胞菌的突變體植株同樣也適于生產(chǎn)一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A。如此處所用的，“突變”指的是一個菌株表型發(fā)生的突然的可遺傳的改變，該改變可以是自發(fā)產(chǎn)生的也可以是被已知的誘變劑，包括輻射和各種化學(xué)物質(zhì)，所誘導(dǎo)的。本發(fā)明的丁香假單胞菌突變體能夠通過使用多種誘變劑包括諸如紫外線和X-射線在內(nèi)的輻射、化學(xué)誘變劑、位點專一性誘變和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的誘變得到。化學(xué)誘變劑的例子有乙基甲烷磺酸(EMS)、二環(huán)氧辛烷、N-甲基-N-硝基-N’-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸。
根據(jù)本發(fā)明的適于生產(chǎn)一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的丁香假單胞菌能夠通過用一定數(shù)量的，可以有效地產(chǎn)生突變體，該突變體過量產(chǎn)生一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A或在有利的生長條件下產(chǎn)生一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A，的一種誘變劑處理細菌。盡管所用誘變劑的種類和數(shù)量可以發(fā)生變化，一個優(yōu)選的方法是將NTG在約1到約100μg/mL的范圍內(nèi)進行系列稀釋。本發(fā)明優(yōu)選的突變體是那些過量產(chǎn)生25-B1十肽抗真菌劑A并且在基本培養(yǎng)基中生長的突變體。這些突變體過量表達丁香假單胞菌脂縮酚十肽，例如25-B1十肽抗真菌劑A，優(yōu)選的從至少10μg/mL到約50μg/mL。
環(huán)境分離菌、突變菌株和其它期望的丁香假單胞菌菌株能夠被用于選擇期望的生長習(xí)慣、生長介質(zhì)、營養(yǎng)來源以及氨基酸需求特性。優(yōu)選的，產(chǎn)生丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的丁香假單胞菌菌株被選擇在基本限定性培養(yǎng)基上生長。優(yōu)選的菌株在一種含有甘氨酸，可選的添加一種脂類、一種馬鈴薯產(chǎn)物或兩者的培養(yǎng)基中顯示出產(chǎn)生一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的特征。
重組體菌株能夠通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法轉(zhuǎn)化丁香假單胞菌菌株來進行改良。通過使用重組技術(shù)，丁香假單胞菌菌株可以被轉(zhuǎn)化以表達除了這些菌株所表達的抗生素之外的多種基因產(chǎn)物。例如，可以用能夠使菌株獲得對原本敏感的抗生素抗性的重組載體轉(zhuǎn)化菌株。從而所獲得的轉(zhuǎn)化體將不僅產(chǎn)生丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A，而且產(chǎn)生獲得性抗性的酶從而允許從野生細胞中選擇轉(zhuǎn)化體。更進一步的，利用類似技術(shù)，可以修飾目前的菌株以導(dǎo)入外源脂縮酚十肽生物合成基因的多個拷貝，從而達到更高的脂縮酚十肽產(chǎn)量。保持了產(chǎn)生脂縮酚十肽特征的丁香假單胞菌菌株25-B1、67H1、和7H9-1的后代，即天然和誘導(dǎo)的變種、突變體和重組體是本發(fā)明的部分。丁香假單胞菌的生長如此處所述的，“水性營養(yǎng)介質(zhì)”指的是包含本發(fā)明所用的細菌生長必需的無機鹽和有機化合物及其鹽類的以水為基礎(chǔ)的組合物。優(yōu)選的營養(yǎng)介質(zhì)含有有效數(shù)量的3種或更少的氨基酸，優(yōu)選的是谷氨酸、甘氨酸、組氨酸或它們的一種組合。在一個實施方案中，介質(zhì)含有有效數(shù)量的甘氨酸和可選的一種或更多馬鈴薯產(chǎn)物和一種脂類。甘氨酸可以以一種單獨的氨基酸形式提供也可以作為一種氨基酸混合物如水解蛋白質(zhì)的組分的形式被提供。合適的脂類包括大豆油、脂肪酸或脂肪酸酯類。合適的馬鈴薯產(chǎn)物包括馬鈴薯葡萄糖肉湯、馬鈴薯糊精或商品化馬鈴薯泥混合食物制品。營養(yǎng)介質(zhì)中優(yōu)選的無機鹽包括在細胞培養(yǎng)和發(fā)酵中通常使用的鹽類混合物，如包含KCl、MgSO4和FeSO4的恰佩克無機鹽類。在營養(yǎng)介質(zhì)中的有機化合物優(yōu)選的包括葡萄糖以及可選的包括可溶性淀粉，其它類似的有機化合物也可以被包含在內(nèi)。介質(zhì)的pH值優(yōu)選的介于約4到約6.5之間，更為優(yōu)選的介于約4.5到約5.7之間，最優(yōu)選的是約5.2。
盡管營養(yǎng)肉湯中每一種組分的數(shù)量對細菌生長或丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的生產(chǎn)不是非常關(guān)鍵性的，但特定水平的營養(yǎng)物還是有利的。甘氨酸的優(yōu)選含量介于約0.1g/L到約10g/L，更為優(yōu)選的介于約0.3g/L到約3g/L，最優(yōu)選的是約1g/L。脂類的優(yōu)選含量對于諸如豆油的油類產(chǎn)品介于約1g/L到約10g/L，優(yōu)選的介于約0.5g/L到約2g/L。脂肪酸或脂肪酸酯類的優(yōu)選含量是介于約0.5g/L到約5g/L。馬鈴薯產(chǎn)品的優(yōu)選含量介于約12g/L到約36g/L。更為優(yōu)選的約24g/L馬鈴薯葡萄糖肉湯；約5g/L到約50g/L，優(yōu)選的約30g/L商品化粉碎的馬鈴薯混合物；約1g/L到約30g/L，優(yōu)選的約20g/L馬鈴薯糊精；和/或約1g/L到約10g/L，優(yōu)選的約4g/L馬鈴薯蛋白質(zhì)。一種優(yōu)選的營養(yǎng)介質(zhì)包含無機鹽，優(yōu)選的，KCl約0.02到約2g/L，更為優(yōu)選的約0.2g/L；MgSO4，優(yōu)選的為MgSO4·7H2O約0.02到約2g/L，更為優(yōu)選的約0.2g/L；FeSO4，優(yōu)選的為FeSO4·7H2O約0.4到約40mg/L，更為優(yōu)選的為約4mg/L。在加入的情況下可溶性淀粉優(yōu)選的介于約0.5到50g/L，更為優(yōu)選的為5g/L。葡萄糖優(yōu)選的介于約2到80g/L，更為優(yōu)選的為20g/L。
丁香假單胞菌在控制的或調(diào)控的pH和溫度條件下典型的生長于所述的介質(zhì)中。丁香假單胞菌在介于約15℃到約35℃，優(yōu)選的介于約20℃到約30℃，最優(yōu)選的為25℃的溫度下生長并且產(chǎn)生一種或更多細胞毒素。丁香假單胞菌在介于約4到約9，優(yōu)選的介于約4到約6，最優(yōu)選的介于4.5到5.5的pH條件下生長并且產(chǎn)生一種或更多細胞毒素。丁香假單胞菌的典型生長在溫度高于約37℃或低于約10℃或在pH高于約9或低于約4的條件下不發(fā)生。生產(chǎn)丁香假單胞菌脂縮酚十肽的方法為了從丁香假單胞菌的野生型或突變體菌株中生產(chǎn)一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A，將培養(yǎng)物以振蕩的方式在包含有有效數(shù)量的三種或更少的氨基酸的水性營養(yǎng)物介質(zhì)中進行培養(yǎng)。這三種或更少的氨基酸優(yōu)選的是谷氨酸、甘氨酸、組氨酸或它們的一種組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，氨基酸包括甘氨酸和可選的，一種或更多的某種馬鈴薯產(chǎn)品和一種脂類。培養(yǎng)過程是在對丁香假單胞菌的生長和所需的丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的生產(chǎn)有效的條件下進行的。有效的條件包括介于約22℃到約27℃的溫度條件和介于約36小時到約96小時的持續(xù)培養(yǎng)時間。當在如此處所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，丁香假單胞菌生長得到的細胞密度可以達到約10-15g/L細胞干重以及產(chǎn)生一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A達到總量至少約10μg/mL，優(yōu)選的達到至少約50μg/mL。
在丁香假單胞菌的培養(yǎng)中控制介質(zhì)中氧的濃度對丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的生產(chǎn)是有利的。優(yōu)選的，氧的水平被維持在約5％到約50％飽和度，更為優(yōu)選的在約30％飽和度。用空氣、純氧或包含氧氣的氣體混合物進行鼓泡通氣可以調(diào)節(jié)介質(zhì)中氧的濃度。進一步，振蕩速率的調(diào)整可以被用來調(diào)節(jié)氧氣傳遞速率。
在丁香假單胞菌的培養(yǎng)中控制介質(zhì)的pH值對丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的生產(chǎn)是有利的。培養(yǎng)介質(zhì)的pH值可以維持在低于約6并且高于約4。
丁香假單胞菌在批式培養(yǎng)中生長能夠產(chǎn)生丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A。不過，葡萄糖和可選的，用于控制pH的一種酸或堿，如氫氧化銨的分批進料或半連續(xù)進料提高丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的產(chǎn)量。丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的產(chǎn)量可以通過使用連續(xù)培養(yǎng)方法得到進一步加強，在該方法中葡萄糖和可選的，用于控制pH的一種酸或堿如氫氧化銨是自動進料的。pH值優(yōu)選的維持在約5到5.4，更為優(yōu)選的介于5.0到5.2。
丁香假單胞菌菌株的選擇會影響到在此書所述的條件下培養(yǎng)時產(chǎn)生的丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的產(chǎn)量和分布。例如，菌株25-B1能夠占優(yōu)勢的產(chǎn)生25-B1十肽抗真菌劑A。
丁香假單胞菌脂縮酚十肽類的環(huán)狀十肽核心能夠通過切割掉親脂性部分，如通過脫?；饔枚苽涞玫?。切割和脫酰基的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，例如通過使用脫?；浮６∠慵賳伟s酚十肽類的制劑和抗真菌作用丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A，顯示出在體外和體內(nèi)的活性，并且在對抗全身性真菌感染或皮膚真菌感染中是有用的。相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種抑制真菌活性的方法，包括將一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A，或它的一種藥劑學(xué)上可以接受的鹽類和真菌相接觸。一個優(yōu)選的方法包括抑制不同的真菌，例如新生隱球菌、莢膜組織胞漿菌和包括近平滑念珠菌和白色念珠菌在內(nèi)的各種念珠菌的生長和活性。如此處所用的使一種本發(fā)明的化合物“接觸”一種寄生物或真菌指的是本發(fā)明的一種化合物和一種寄生物或真菌形成的一個聯(lián)合體或結(jié)合體，或者明顯的接觸，或相互相接。但是，術(shù)語接觸并不意味著任何抑制性機制。
本發(fā)明進一步提供了一種治療真菌感染的方法，包括對一個需要治療的主體給與有效劑量的一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A，或其藥劑學(xué)上可以接受的鹽類。一個優(yōu)選的方法包括治療由不同的真菌，例如新生隱球菌、莢膜組織胞漿菌和包括近平滑念珠菌和白色念珠菌在內(nèi)的各種念珠菌菌株引起的感染。以有效劑量方式使用一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽的一種制劑，如25-B1十肽抗真菌劑A，減輕了真菌感染的痛苦，減輕了與真菌感染有關(guān)的癥狀，并且導(dǎo)致了真菌感染的消除。
一些需要用一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽的一種制劑，如25-B1十肽抗真菌劑A進行抗真菌治療的病人，存在嚴重的感染癥狀，如高燒，并且可能處于加強或重癥護理狀態(tài)。各種不同的真菌能夠引起如此嚴重的感染。例如，念珠菌引起粘膜和嚴重的全身感染，而且可能以吡咯和多烯類抗性菌株的形式存在。曲霉菌引起威脅生命的全身感染。隱球酵母是腦膜炎的成因。如此嚴重的真菌感染可以在免疫受損的病人體內(nèi)發(fā)生，例如那些接受器官或骨髓移植、接受癌癥化療、從大手術(shù)中恢復(fù)、或受HIV感染的病人。對這樣的病人，抗真菌治療典型的包括靜脈注射幾天一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽的一種制劑(例如-B1十肽抗真菌劑A)，以阻止或消除感染。
考慮到抗真菌活性，術(shù)語“有效劑量”指的是能夠抑制真菌生長或活性、或減輕真菌感染癥狀的本發(fā)明的化合物的一定劑量。對大多數(shù)真菌感染，感染癥狀的減輕包括退燒、蘇醒和本人整體狀況的改善。優(yōu)選的，通過殺死真菌以消除感染或使感染恢復(fù)到病人可以忍受的水平或被病人的免疫系統(tǒng)所控制以達到癥狀的減輕。如此處所用的“抑制”指的是抑制真菌活性，包括停止、阻止或預(yù)防性的阻礙或阻止真菌生長，或任何真菌存在特征和由真菌存在導(dǎo)致的結(jié)果。
典型的，組合物被以有效劑量使用到需要的病人身上(人類或其它動物，包括諸如貓、馬和牛的哺乳動物以及鳥類)以抑制真菌感染。用藥的劑量將根據(jù)諸如感染真菌種類和感染的嚴重性、年齡和宿主的一般健康狀態(tài)和宿主對抗真菌劑的耐受性等因素發(fā)生變化。特殊的劑量方案同樣可以根據(jù)這樣的因素發(fā)生變化而且可以每天服藥一次或多次服藥進行給藥。治療方案可以持續(xù)從約2-3天到約2-3周或更長。一個典型的每日劑量(以一次服藥或多次服藥方式給藥)含有的劑量水平從約0.01mg/kg到約100mg/kg體重的本發(fā)明的一種活性化合物。優(yōu)選的每日劑量一般從約0.1mg/kg到約60mg/kg，而理想的劑量從約2.5mg/kg到約40mg/kg體重。對嚴重感染，該化合物可以通過靜脈輸液方式，采用例如0.01到10mg/kg/hr的活性成分。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明的抗真菌化合物用藥的藥劑學(xué)制劑。相應(yīng)的，本發(fā)明也提供了一種包括一種或更多藥劑學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、媒介物、賦形劑、或其它添加劑和一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的藥劑學(xué)制劑。該制劑中的活性成分包含了從0.1％到99.9％的制劑重量，更為一般的從10％到30％的制劑重量。通過“藥劑學(xué)可接受的”代表了載體、稀釋劑或賦刑劑可與制劑中的其它成分相容，并且對接受者無害。
制劑中可以包括例如各種油類的添加劑，包括那些石油、動物、植物或人造來源的油類，例如，花生油、大豆油、礦物油和芝麻油。合適的藥物賦形劑包括淀粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸、氯化鈉、干粉脫脂牛奶、甘油、丙二醇、水和乙醇。該組合物可以被用于傳統(tǒng)藥劑學(xué)措施，如滅菌而且可以含有傳統(tǒng)的藥劑學(xué)添加劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、潮濕或乳化劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類和緩沖劑。適當?shù)乃巹W(xué)載體和其制劑在Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”15th Ed.；Mack Publishing Co.Easton(1975)一書中的例如1405-1412和1461-1487頁中進行了描述。
如此處所用的，術(shù)語“藥劑學(xué)可接受的鹽類”指的是基本上對活體無毒性的上述制劑復(fù)合物中的鹽類。典型的藥劑學(xué)可接受鹽類包括那些通過將本發(fā)明的化合物與一種無機或有機酸或一種無機堿反應(yīng)而制備的鹽類。這樣的鹽類稱為酸加成或堿加成鹽類。
通常用于形成酸加成鹽類的酸類是諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸和磷酸的無機酸，以及諸如p-甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸和乙酸的有機酸。這樣的藥劑學(xué)可以接受的鹽類的例子有硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、鹽酸鹽、溴化鹽、碘化鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、延胡索酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁炔-1，4-dioate、己炔-1，6-dioate、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、napththalene-2-磺酸鹽和扁桃酸鹽。優(yōu)選的藥劑學(xué)可接受酸加成鹽是那些用無機酸如鹽酸和氫溴酸處理形成的鹽類和那些用有機酸如順丁烯二酸和甲磺酸處理形成的鹽類。
堿加成鹽類包括那些來源于無機堿，如銨或強堿或堿性的金屬氫氧化物、碳酸鹽和碳酸氫鹽。這樣的在制備本發(fā)明的鹽類中有用的堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鈣和碳酸鈣。鉀鹽和鈉鹽形式是特別優(yōu)先選用的。
應(yīng)該認識到的是形成本發(fā)明的任何一種鹽的組成部分的特定平衡離子不具有關(guān)鍵性的本質(zhì)，只要該鹽作為一個整體在藥劑學(xué)上是可以接受的而且只要該平衡離子對鹽作為整體不起非所希望的作用。
丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A，可以通過腸道外給藥，例如，使用肌肉內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射，經(jīng)鼻或口途徑。除了這些給藥方法之外，丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A可以被局部應(yīng)用于表面皮膚感染或抑制粘液中真菌的生長。
對于非腸道給藥方式，制劑包含一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A和一種生理學(xué)可接受的稀釋劑，如去離子水、生理鹽水、5％葡萄糖和其他常用稀釋劑。該制劑可以含有一種環(huán)糊精和/或一種增溶劑，如聚乙烯乙二醇或聚丙烯乙二醇或其它已知的增溶劑。這樣的制劑可以在含有干粉或凍干粉末形式的抗真菌劑和賦形劑的無菌小瓶中配置。在使用之前，要加入一種生理學(xué)上可接受的稀釋液并且將溶液用注射器抽出用于對病人注射。
本發(fā)明的藥劑學(xué)制劑是通過已知的步驟，使用已知而且常見的成分進行制備的。在制造本發(fā)明的組合物時，活性成分通常和一種載體進行混合，或者用一種載體進行稀釋，或者包裝在一種載體內(nèi)，其形狀可以是膠囊、小袋、紙或其它容器。當載體用作稀釋劑時，它可以是固體、半固體或液體材料，以作為活性成分的媒介物、賦形物或介質(zhì)。因此，該組合物的形狀可以是片劑、丸劑、粉末、錠劑、小袋、膠囊劑、配劑、懸浮液、乳劑、溶液、糖漿、氣霧劑(作為固態(tài)或在液態(tài)介質(zhì)中)，例如，含有重量超過10％的活性化合物的軟膏、軟或硬的明膠膠囊、栓劑、無菌的注射用溶液或無菌包裝的粉末。
對于經(jīng)口給藥方式，抗真菌復(fù)合物被填充到明膠膠囊中或形成片劑。這樣的片劑也可以含有一種結(jié)合劑，一種分散劑或其它合適的賦形劑，該賦形劑適合用于制備一種對于劑量和丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A大小適當?shù)钠瑒?。對于兒科或老年人使用，該抗真菌?fù)合物可以設(shè)計成有甜味的液體懸浮液、溶液或乳劑。一種優(yōu)選的口服制劑是亞油酸、cremophor RH-60和水，優(yōu)選的比例(體積比)為8％亞油酸、5％cremophor RH-60、87％無菌水和一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A，其數(shù)量從約2.5到約40mg/ml。
對于局部使用，該抗真菌復(fù)合物可以以干粉末進行設(shè)計以用于皮膚表面或者它可以被設(shè)計成包含一種增溶性水性液體或非水性液體，例如，醇或二元醇(glycol)的制劑。丁香假單胞菌脂縮酚十肽制劑的應(yīng)用本發(fā)明也包括一套含有本發(fā)明的藥劑學(xué)制劑而且和本發(fā)明的方法一起使用的試劑盒。該試劑盒可以含有一個小玻璃瓶，該瓶中有干粉或液體狀的本發(fā)明的一種制劑和合適的載體。該試劑盒還可以包括貼于瓶壁上的標簽形式和/或包含于小瓶包裝盒內(nèi)的插入條形式的說明書，用于說明該復(fù)合物的用途和給藥。該說明書也可以印刷在小瓶的包裝盒上。該說明書包含了諸如足夠的劑量和用藥信息在內(nèi)的信息，使得該領(lǐng)域的工作人員使用該藥。我們預(yù)期該領(lǐng)域的工作人員包括可能使用該藥的任何醫(yī)生、護士或技術(shù)人員。
本發(fā)明也涉及一種藥劑學(xué)組合物，其包含一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的一種制劑，且該組合物適于用作注射給藥。根據(jù)本發(fā)明，一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的一種制劑可以被用于制造一種適合于注射用藥的組合物或藥劑。本發(fā)明也涉及制造適合于口服或局部用藥方式的組合物的方法，該組合物包括一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的一種制劑。例如，一種液體或固體制劑可以使用傳統(tǒng)工藝按幾種方法制造。一種液體制劑可以通過將一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A在合適的pH條件下溶解于合適的溶劑，例如水中，該溶劑包含了緩沖劑和其它賦形劑。
農(nóng)業(yè)上的用途由丁香假單胞菌NRRL B-12050產(chǎn)生的抗生素已經(jīng)被證實可以有效地治療荷蘭榆樹病(見，例如，U.S.專利號4,342,746和4,277,462)。特別的，丁香假單胞菌MSU 16H已經(jīng)被顯示出相比野生型菌株能夠使被Ceratocystis ulmi，引起荷蘭榆樹病的病因感染的榆樹獲得更大的保護(見，例如，Lam等，Proc.Natl.Sci.USA，84，6447-6451(1987))。對野外生長的榆樹進行得更為廣泛的實驗證實了在預(yù)防水平上的生物控制現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的脂縮酚十肽可以用于作為荷蘭榆樹病的防治性處理手段。假單孢菌素已經(jīng)被顯示出對包括Rynchosporium secalis、Ceratocystis ulmi、Rizoctonia solani、Sclerotinia scleraotiorum、Verticillium alboatrum、Verticillium dahliae、Thielaviopis basicola、Fusariumoxysporum和Fusarium culmorum在內(nèi)的廣譜植物病原體真菌具有毒性(見HarrisonL.等，“Pseudomycins，a family of novel peptidesfrom Pseudomonas syringae possessing broad-spectrumantifungal activity.”普通微生物學(xué)雜志，7，2857-2865(1991)。因此，一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A(包括其氫氧化物、溶劑化物和酯類)在治療植物真菌(特別是V.albo-atrum Rhizoctonia solani和F.oxysporum)感染中可能是有用的，要么直接治療或者作為預(yù)防性處理。一般的，被感染的植物是通過注射或噴灑一種脂縮酚十肽化合物水相懸浮液到植物中或在植物表面而進行治療的。注射的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(例如，鑿孔槍)。任何一種噴灑懸浮液的方法都可以被用來散布有效數(shù)量的活性物質(zhì)到植物表面。該懸浮液也可以包括其它通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的添加劑，例如，增溶劑、穩(wěn)定劑、增濕劑和它們的組合。
對植物的治療也可以通過使用含有一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1十肽抗真菌劑A的一種干粉組分來完成。該干粉制劑可以通過任何一種為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法被應(yīng)用到植物表面，例如從容器中噴灑或搖落。
通過參考下面的實例可以更好的理解本發(fā)明。這些例子意圖被用來代表本發(fā)明的特定實施方案，而不是被作為本發(fā)明范圍的限制。
實例保存的生物材料丁香假單胞菌MSU 16H可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ParklawnDrive，Rockville，MD，USA)公開得到，其編號是ATCC 67028。丁香假單胞菌菌株25-B1、7H9-1和67 H1于2000年3月23日保存在美國典型培養(yǎng)物保存中心，它們被指定為如下的編號25-B1 保藏編號PTA-16227H9-1 保藏編號PTA-162367 H1 保藏編號PTA-1621例1-25-B1抗真菌劑A的生產(chǎn)用于在一種丁香假單胞菌菌株的發(fā)酵肉湯中生產(chǎn)脂縮酚十肽抗真菌劑，25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的發(fā)酵方法被進行了改進。材料和方法接種物制備將一份保存在液氮氣相中的丁香假單胞菌菌株25-B1的等份試樣復(fù)蘇并接種到兩個900毫升CSM肉湯中。CSM肉湯由以下成分組成(g/L)葡萄糖(5)、麥芽糖(4)、Difco胰蛋白酶大豆湯(30)、Difco酵母提取物(3)和MgSO4·7H2O(2)。約0.5毫升細胞分別被用于接種保存在兩個2升燒瓶里的各900毫升培養(yǎng)基。燒瓶在25℃條件下?lián)u動培養(yǎng)24小時。兩個燒瓶的內(nèi)含物被混合在一起，然后接種一個含有115升生物菌發(fā)酵肉湯的150升發(fā)酵罐。
發(fā)酵階段發(fā)酵肉湯由以下部分溶于自來水中組成(g/L)葡萄糖(20)、可溶性淀粉(5)、Basic American Foods Country StylePotato Pearls即食馬鈴薯泥(30)、丙二醇(1)、MgSO4·7H2O(0.2)、KCl(0.2)和FeSO4·7H2O(0.004)。滅菌前將pH值調(diào)節(jié)到5.2。發(fā)酵過程在25℃條件下進行68小時。通過空氣流量和攪拌轉(zhuǎn)速的連續(xù)調(diào)節(jié)將溶氧保持在30％空氣飽和度或以上。通過加入H2SO4或NaOH將pH值維持在介于4.0到5.4。
簡單批式培養(yǎng)的一些變化也被發(fā)現(xiàn)以產(chǎn)生該新的環(huán)狀肽產(chǎn)物。葡萄糖在接種后的頭24小時內(nèi)可以以每小時60毫升的速率加入到發(fā)酵罐中。在整個發(fā)酵過程中加料可以是連續(xù)的。可選的，一種程序，在接種后的頭24小時，溶氧保持在5％的空氣飽和度并一直持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束曾經(jīng)被采用。溶氧維持在5％是通過在通入發(fā)酵罐的空氣中加入惰性的氮氣而實現(xiàn)的。在所有情況下，氣體是通過開口位于發(fā)酵罐的底部攪拌器渦輪下的單一浸沒式分布器管供應(yīng)的。結(jié)果和結(jié)論一些發(fā)酵方法可從丁香假單胞菌產(chǎn)生25-B1縮酚十肽抗真菌劑A。
例2-25-B1抗真菌劑A的分離和純化從丁香假單胞菌的一個菌株的發(fā)酵肉湯中分離和純化一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽，25-B1十肽抗真菌劑A的方法被進行了改進。材料和方法根據(jù)例1得到的全部發(fā)酵肉湯，收獲后通常為100升，被通過MembraloxTM陶瓷濾器(0.45μm)進行過濾。得到的固體漿用等體積含有0.1％TFA的丙酮進行提取90分鐘。丙酮提取物通過過濾分離并在真空中蒸發(fā)得到水相溶液。
該溶劑和從陶瓷濾器得到的全肉湯的濾出液混合并加到一根填充在水里的AmberchromTMCG 300sd樹脂柱上(4升)。該柱最初用0.2％的乙酸(pH4.8)洗滌直到流出物顯示pH4.5，接著用10L含有0.2％乙酸(pH4.8)的22％的乙腈洗滌。然后，將該柱用含有0.2％乙酸的22-35％線性梯度乙腈(32升)和含有0.2％乙酸的35％乙腈(8升)以400毫升/分鐘的速度進行洗脫。組分11-16被合并(4.8升)，在真空中濃縮到100毫升并離心。
將上清液分離并在一根Amberchrom CG 300sd柱(1升)上用含有0.2％乙酸(pH 4.8)，線性梯度為25-35％的乙腈以50毫升/分鐘的速度進行色譜分離。組分20到25(1.2升)被混合并在一根反相柱(NovaPak C18，6μm，40×300mm，流速40毫升/分鐘，含有0.2％乙酸的線性梯度為30-60％的乙腈)再次進行色譜分離以得到21mg的一種化合物(紫外檢測純度為89％)。
ESIMS數(shù)據(jù)顯示在m/z 1165.7有一個可能的[M+H]-峰，這個特征與到目前為止已經(jīng)從丁香假單胞菌發(fā)現(xiàn)的已知的抗真菌劑不同。1H NMR譜顯示出的信號使人聯(lián)想起假單孢菌素類似的脂肽，但是也顯示出存在超過一種的化合物。為了獲得高純度的25-B1縮酚十肽抗真菌劑A用于結(jié)構(gòu)確定和抗真菌活性，另外一種來自4×100升發(fā)酵的肉湯按照上述方法進行處理，另外，最后的純化步驟在一根反相柱[Rainin C18，6μm，24×250mm，0.1％TFA-乙腈-MeOH(8∶1∶1到4∶3∶3)梯度洗脫60分鐘；(4∶3∶3到10∶45∶45)梯度洗脫30分鐘]以產(chǎn)生42mg25-B1縮酚十肽抗真菌劑A(紫外檢測純度為93％)。結(jié)果和結(jié)論類似于用于純化其他縮酚十肽抗真菌劑方法的HPLC方法導(dǎo)致了25-B1縮酚十肽抗真菌劑A從發(fā)酵肉湯中的純化。
例3-25-B1抗真菌劑A的結(jié)構(gòu)確定質(zhì)譜和NMR確定了脂縮酚十肽抗真菌劑，25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的結(jié)構(gòu)。材料和方法25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的分子式通過高分辨率FABMS確定為C52H88N14O16[m/z 1165.6581對C52H89N14O16(M+H)，Δ+0.9ppm]。
與該分子式相一致，13C和DEPT NMR譜顯示了50個獨立的共振峰，包括了12個羰基碳、5個烯基碳和6個甲基碳4個氧化SP3碳，8個典型的氨基酸2-碳原子，15個亞甲基碳和6個甲基碳。其中，甲基碳原子之一在16.7產(chǎn)生信號，亞甲基碳之一在28.9產(chǎn)生信號，它們各構(gòu)成一系列兼并碳原子，從而導(dǎo)致在分子式中觀察到的52個碳原子。
1H、13C和2D NMR(DQCOSY、TOCSY、HMQC、HMBC和ROESY)數(shù)據(jù)的詳細分析使我們能夠確定25-B1縮酚十肽抗真菌劑A(IA)的結(jié)構(gòu)和明確的指定所有的質(zhì)子和碳原子(表1)。 表1.25-B1縮酚十肽抗真菌劑A在DMSO-d6中的1H和13C NMR化學(xué)位移
在35℃條件下于DMSO-d6中測量得到的1H、DQCOSY和TOCSY數(shù)據(jù)揭示了7個天然存在的氨基酸殘基-2個丙氨酸、1個精氨酸、1個谷氨酰胺和3個蘇氨酸以及3個天然存在較少的氨基酸-1個脫氫丙氨酸(Dha)、1個脫氫氨基丁酸(Dhb)和1個高絲氨酸的自旋系統(tǒng)的存在。天然存在較少的氨基酸殘基，即Dha、Dhb和高絲氨酸，是通過分別觀察到的在TCCSY譜中從9.01(brs)、9.07(brs)和8.22共振的酰胺質(zhì)子到5.86、5.61(C106.4)、6.40(δC128.5)、1.61(δC12.9)和4.22(δC51.4)、1.82、1.76(δC34.0)、3.47(δC57.3)共振的酰胺質(zhì)子的交叉峰進行鑒定的。與此相一致，13C NMR譜顯示了對飽和氨基酸殘基的8個質(zhì)子結(jié)合-碳原子信號以及對非飽和氨基酸Dha和Dhb的兩個四元-碳原子信號。在12個酰胺或酯羰基中，9個被確定為8個飽和氨基酸殘基(2個為谷氨酰胺)、兩個(δ164.0和163.7ppm)為Dha和Dhb。余下的一個羰基基團被確定到十二烷酰側(cè)鏈，其存在是從末端甲基信號(δH0.83和δC13.9)和13C NMR譜中的10個亞甲基信號(表1)而鑒別出來的。
該分子式需要16級的不飽和度。占15個非飽和度位點的10個氨基酸和12烷酰側(cè)鏈顯示出25-B1縮酚十肽抗真菌劑A是一個單環(huán)十肽。比較蘇氨酸的β-質(zhì)子的化學(xué)位移(δH4.94、4.11和4.00)顯示出在δ4.94處共振的質(zhì)子是連在一個被修飾為酯或內(nèi)酯的甲醇上。如此結(jié)果和25-B1縮酚十肽抗真菌劑A是縮酚酞被HMBC和ROESY數(shù)據(jù)所證實。這些數(shù)據(jù)也確定了25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的氨基酸序列和該十二烷酰側(cè)鏈的位置。
以精氨酸作為起始點，在HMBC譜中觀察到在酰胺質(zhì)子和相鄰的氨基酸羰基和或α-碳原子(見下面


圖1)的長程1H-13C相關(guān)性明確的確定了氨基酸序列精氨酸-NH/蘇氨酸-CO、蘇氨酸-NH/脫氫丙氨酸-CO、脫氫丙氨酸-NH/丙氨酸-CO、丙氨酸-NH/脫氫氨基丁酸-CO、脫氫氨基丁酸-NH/高絲氨酸-CO、高絲氨酸-NH/谷氨酸-CO、谷氨酸-NH/蘇氨酸-CO、蘇氨酸-NH/丙氨酸-CO和丙氨酸-NH/蘇氨酸-CO。
圖1HMBC(H-C)相關(guān)性與丙氨酸相鄰的蘇氨酸NH沒有顯示出與精氨酸殘基的羰基之間具有長程1H-13C相關(guān)性，而是顯示出對確定為十二烷酰側(cè)鏈的羰基之間的相關(guān)性。該蘇氨酸-NH/精氨酸-CO相關(guān)性的缺乏以及蘇氨酸-β-H(δH4.94、δC70.5)/精氨酸-CO相關(guān)性的存在明確的確定了在蘇氨酸-β-H和精氨酸-COOH之間存在酯連接。與這些確定結(jié)果一致的是在酰胺質(zhì)子和相鄰氨基酸α-質(zhì)子R之間觀察的OESY相關(guān)性(見下圖II)。 圖II選擇的ROESY相關(guān)性結(jié)論化合物25-B1縮酚十肽抗真菌劑A代表了一類新的脂縮酚十肽，其具有一些在其它任何一種由丁香假單胞菌的不同分離株產(chǎn)生的假單孢菌素、丁香菌素、丁香毒素和丁香因子中都不存在的氨基酸殘基。該新的縮酚酞有10個氨基酸組成，這也與僅具有9個氨基酸殘基的假單孢菌素和丁香菌素不同。不像假單孢菌素天然產(chǎn)物，該新的縮酚酞不含有氯蘇氨酸，它被懷疑為是藥劑制劑中含有假單孢菌素化合物的藥物在注射位點產(chǎn)生刺激的原因。
例4-25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的抗真菌活性抗真菌研究是通過使用根據(jù)臨床實驗室標準國家委員會的指導(dǎo)方針的微量滴定肉湯稀釋技術(shù)方法在96孔微量滴定板中進行的。薩布羅和葡萄糖肉湯被調(diào)整到含有2.5×104孢子/毫升。試驗化合物被溶解于水中并以兩倍稀釋濃度進行試驗，起始最高濃度為20□g/ml。平板在35℃條件下培養(yǎng)48小時。表2中的結(jié)果顯示了該化合物的最低抑制濃度(MIC)，與未處理對照組相比完全抑制生長。
表2抗真菌活性生物體 MIC(μg/ml)白色念珠菌 10近平滑念珠菌 10新生隱球菌 1.25煙曲霉 ＞20莢膜組織胞漿菌 20一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的存在或數(shù)量可以通過測量一種制劑的抗真菌活性來確定。體外抗真菌活性可以通過使用標準瓊脂稀釋試驗或圓盤擴散試驗獲得制劑的最低抑制濃度(MIC)來確定。一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的一種制劑可以是細胞培養(yǎng)物的提取物、或一種更為純化的混合物。測定抗真菌活性中一種常用的真菌是白色念珠菌。如果該測試制劑引起白色念珠菌x657接種的瓊脂平板產(chǎn)生10-12mm直徑的抑制區(qū)，則抗真菌活性被認為是顯著的。
例5-丁香假單胞菌分離、表征和誘變丁香假單胞菌的環(huán)境分離菌和突變體被產(chǎn)生和用來生產(chǎn)抗真菌劑。材料和方法菌株MSU 174和MSU 16-H是按照1996年11月9日授予G.Strobel等的美國專利號5.576.298的專利、Harrison等人發(fā)表于《遺傳微生物雜志》1991年137期2857-2865頁的“Pseudomycins，a family ofnovel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity”一文和Lamb等發(fā)表于Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987年84期6447-6451頁的“Transposonmutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonasAntimycotic production is necessary for control of Dutch elmdisease”一文進行分離和表征的。本段引用的參考文獻的公開在此引入作為參考。
其它附加的菌株是來自如野生型菌株和通過化學(xué)誘變作用產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座子突變體。受到誘變的菌株包括MSU 174、MSU 16H和25-B1。要受誘變的菌株在含有馬鈴薯產(chǎn)品的培養(yǎng)基上生長，然后分到含有0、1、2、4、16或32μM化學(xué)誘變劑1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG或MNNG)的培養(yǎng)基中。這些細胞隨后被凍存以進行進一步的篩選和選擇。
誘變的細胞被選擇能夠適應(yīng)期望的生長條件和/或產(chǎn)生一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1縮酚十肽抗真菌劑A?；瘜W(xué)誘變的丁香假單胞菌細胞，如誘變的菌株25-B1，復(fù)蘇后在N21SM培養(yǎng)基中稀釋到6細胞/毫升(表3)。該培養(yǎng)基有時含有一種或多種用于選擇的組分，例如不同濃度的磷酸鹽。每50μl體積的誘變細胞被分配到96孔圓底微滴定板的一個孔中，以運送平均0.3細胞/孔。典型的，每孔中要加入硅油以減少蒸發(fā)。該平板在25℃條件下?lián)u動培養(yǎng)6到12天。
表3-N21SM培養(yǎng)基的組成
經(jīng)過培養(yǎng)后，從每一孔中取出一般為5μL的等份試樣進行系列稀釋，(例如，1∶56、1∶196、1∶320、1∶686、和/或1∶1715)并且評估在液體微滴定板生物技術(shù)中對白色念珠菌的活性。該平板在37℃條件下培養(yǎng)過夜，并對各孔進行白色念珠菌生長一致的評估。合適的菌株被挑選出來，在CSM培養(yǎng)基(表4)中培養(yǎng)，在25℃條件下生長1到3天。
表4.鏈霉菌完全培養(yǎng)基(CSM)組分 濃度(g/l)葡萄糖5麥芽糖4Difco胰蛋白酶大豆湯 30Difco酵母提取物 -MgSO4·7H2O2不進行pH調(diào)整 -所選擇的菌株被保存并接種到含有13ml N21SM培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，在25℃條件下生長約66個小時。從該發(fā)酵物中取出一份試樣，加入等體積的乙腈提取1個小時，離心，輕輕倒出用于對一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1縮酚十肽抗真菌劑A進行HPLC分析，如例1-3所描述的步驟。產(chǎn)生一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的菌株被再次分離、再次發(fā)酵并準備用于在更大規(guī)模生長。結(jié)果顯示出產(chǎn)生一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1縮酚十肽抗真菌劑A特性的菌株用上述方法被生產(chǎn)出來。結(jié)論此處所公開的選擇方法和準則對生長于基本培養(yǎng)基上并且產(chǎn)生一種或更多丁香假單胞菌脂縮酚十肽，如25-B1縮酚十肽抗真菌劑A的丁香假單胞菌菌株的生產(chǎn)是有效的。
例6-包含丁香假單胞菌脂縮酚十肽的制劑下面的制劑實例僅僅起到說明作用，并不準備用于限制本發(fā)明在任何一方面的范圍。術(shù)語“活性成分”指的是一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽或它的一種藥劑學(xué)上可接受的鹽類。制劑1硬明膠膠囊使用如下成分制備
制劑2片劑是用以下制劑制備的。所有成分進行混合然后壓縮形成每片重665mg的片劑。
制劑3一種含有如下成分的氣溶膠溶液被制備?；钚猿煞峙c乙醇混合，混合物添加到壓縮氣體22的一部分，在-30℃冷卻并轉(zhuǎn)移到裝填裝置中。所需要的量被輸送到不銹鋼容器中并用壓縮氣體的剩余部分稀釋。然后將閥門單元安裝到容器上。
制劑4每一片含有60mg活性成分的片劑按如下制造
活性成分、淀粉和纖維素通過No.45目的美制篩子并進行充分混合。含有聚乙烯吡咯烷酮的水相溶液和得到的粉末混合，然后將混合物通過No.14目的美制篩子。得到的微粒在50℃下干燥，并通過No.18目的美制篩子。羧甲基鈉淀粉、硬脂酸鎂和滑石粉事先通過No.60目的美制篩子，然后加到微粒中，混合后，一起在制片機中壓縮產(chǎn)生重量為150mg片劑。制劑5每顆含有80mg活性成分的膠囊，按以下步驟制造
有效成份、纖維素、淀粉、硬脂酸鎂混合，通過No.45目的美制篩子，然后按200mg的質(zhì)量填充到硬明膠膠囊中。制劑6每劑含有225mg有效成份的栓劑，按以下步驟制造
活性成份通過No.60目的美制篩子，然后懸浮在飽和脂肪酸甘油酯中，該甘油酯事先用盡可能少的熱量融化，然后將混合物倒入標稱為2g容量的栓劑模子中，并冷卻。制劑7每5ml劑量含有50mg活性成分的懸浮液，按以下步驟制造
活性成份通過No.45目的美制篩子，并與羧甲基鈉纖維素和糖漿混合形成細膩的糊狀物。苯甲酸溶液、香料和顏料用一部分水稀釋，在攪拌狀態(tài)下加入到糊狀物中。加入足夠的水以達到所需體積。制劑8靜脈內(nèi)制劑可以按如下步驟制備。這些成分的溶液一般是以每分鐘1ml的速度靜脈內(nèi)注射到患者體內(nèi)。
本發(fā)明是參考不同的特效藥和優(yōu)選實施方案和技術(shù)而進行表述的。不過，應(yīng)該理解的是在保持在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可能進行很多的變化和修改。
序列表<110>Eli Lilly and Company<120>分離自丁香假單胞菌的抗真菌劑<130>X-11015 序列表<140><141><150>60/129,446<151>1999-04-15<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>10<212>PRT<213>Pseudomonas syringae<214>丁香假單胞菌<220><223>位置5的Xaa是高絲氨酸<220><223>位置6的Xaa是脫氫氨基丁酸<220><223>位置8的Xaa是脫氫丙氨酸<400>1Thr Ala Thr Gln Xaa Xaa Ala Xaa Thr Arg15 10
權(quán)利要求
1.一種分離的丁香假單胞菌縮酚十肽，或一種其藥劑學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物，其含有一個縮酚十肽環(huán)，其中縮酚十肽環(huán)含有精氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸、脫氫氨基丁酸和脫氫丙氨酸，和一個由精氨酸的羧基與蘇氨酸的羥基形成的內(nèi)酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的丁香假單胞菌縮酚十肽，其縮酚十肽環(huán)具有如下序列Thr-Ala-Thr-Gln-Hse-Dhb-Ala-Dha-Thr-Arg(SEQ ID NO1)
3.根據(jù)權(quán)利要求1的丁香假單胞菌縮酚十肽，其中的丁香假單胞菌縮酚十肽是一種丁香假單胞菌脂縮酚十肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的丁香假單胞菌縮酚十肽，其中的丁香假單胞菌脂縮酚十肽包含一個與蘇氨酸的氨基通過酰胺鍵結(jié)合的脂肪酸部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的丁香假單胞菌縮酚十肽，其中的脂肪酸部分是一種癸酸部分、一種用一個或兩個羥基基團取代的癸酸部分、一種十二烷酸部分、一種用一個或兩個羥基基團取代的十二烷酸部分、一種十四烷酸部分或一種用一個或兩個羥基基團取代的十四烷酸部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的丁香假單胞菌縮酚十肽，其中的脂肪酸部分是一種n-十二烷酸部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的丁香假單胞菌縮酚十肽，其中的丁香假單胞菌脂縮酚十肽由如下分子式表示 其中R是一種親脂部分，或它的一種藥劑學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的丁香假單胞菌縮酚十肽，其中的親脂部分是選自C9-C15烷基、C9-C15羥烷基、C9-C15二羥烷基、C9-C15烯基、C9-C15羥烯基和C9-C15二羥烯基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的丁香假單胞菌縮酚十肽，其中的親脂性部分是C9-C15烷基。
10.一種分離的丁香假單胞菌縮酚十肽具有如下分子式 或一種其藥劑學(xué)上可接受的鹽、酯或水合物。
11.一種通過將真菌和一種根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的分離的丁香假單胞菌縮酚十肽相接觸而抑制真菌活性的方法。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的真菌包括近平滑念珠菌、白色念珠菌、新生隱球菌或莢膜組織胞漿菌。
13.一種減輕需要其的病人體內(nèi)真菌感染癥狀的方法，該方法包括給與病人有效劑量的一種包含根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的分離的丁香假單胞菌縮酚十肽的組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中減輕癥狀包括降低真菌感染的痛苦。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中的真菌感染包括被近平滑念珠菌、白色念珠菌、新生隱球菌或莢膜組織胞漿菌感染。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，進一步包括如下步驟確定對給與分離的丁香假單胞菌縮酚十肽的需要；監(jiān)控病人真菌感染癥狀的減輕。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中的給藥包括每天腸道外給藥約0.1到約5mg/kg分離的丁香假單胞菌縮酚十肽約1到3次/天。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中的減輕真菌感染的癥狀包括降低體溫和提高病人的整體狀態(tài)。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的分離的丁香假單胞菌縮酚十肽的在一種用于治療真菌感染的藥物的制備中的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中的真菌感染包括被近平滑念珠菌、白色念珠菌、新生隱球菌或莢膜組織胞漿菌感染。
21.生產(chǎn)一種或更多丁香假單胞菌縮酚十肽的方法包括如下步驟在pH值約4到6.5條件下于含有三種或更少氨基酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種生物學(xué)純的丁香假單胞菌培養(yǎng)物，直到一種或更多丁香假單胞菌縮酚十肽的濃度達到至少約10μg/ml；并且從培養(yǎng)物中收回一種或更多丁香假單胞菌縮酚十肽，或一種其在藥劑學(xué)上可以接受的鹽、酯或水合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的氨基酸包括谷氨酸、甘氨酸、組氨酸或它們的一個組合。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中的氨基酸包括甘氨酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中的營養(yǎng)培養(yǎng)基進一步包含可溶性淀粉、酵母提取物或它們的組合和一種脂類。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的營養(yǎng)培養(yǎng)基包含一種馬鈴薯制品和一種選自大豆油、脂肪酸和脂肪酸酯的脂類。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中的馬鈴薯制品包括馬鈴薯葡萄糖肉湯、馬鈴薯泥混合物、馬鈴薯糊精、馬鈴薯蛋白或它們的一個組合。
27.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中在發(fā)酵步驟中溶氧濃度保持在約5％到30％。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的發(fā)酵過程進一步包括葡萄糖、氫氧化銨或其組合的進料。
29.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中產(chǎn)生的丁香假單胞菌縮酚十肽是一種根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的丁香假單胞菌縮酚十肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的丁香假單胞菌包括來自菌株MSU 16H、MSU 174或MSU 206的一個菌株。
31.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的丁香假單胞菌包括菌株MSU16H、菌株25-B1、菌株67H1或菌株7H9-1。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中的丁香假單胞菌包括菌株25-B1。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求7的、通過權(quán)利要求21、22、23、24、25、26、27、28、30、31或32制備的丁香假單胞菌縮酚十肽。
34.一種治療或阻止真菌在植物中生長的方法，該方法包括將真菌和一種根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的丁香假單胞菌縮酚十肽相接觸。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中的真菌是Rynchosporiumsecalis.Ceratocystis ulmi、Rizoctonia solani、Sclerotiniascleraotiorum、Verticillium albo-atrum、Verticillium dahliae、Thielaviopis basicola、Fusarium oxysporum或Fusariumculmorum。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中的真菌是Verticilliumalbo-atrum、Rizoctonia solani或Fusarium oxysporum。
全文摘要
本發(fā)明涉及丁香假單胞菌縮酚十肽類、產(chǎn)生這些肽類的方法、以及利用該肽類的抗真菌活性的方法。丁香假單胞菌縮酚十肽包括一種具有特定分子式(a)的化合物,其中的R是一個親脂性部分,或它的一種藥劑學(xué)上可接受的鹽、酯類或水合物。
文檔編號C12P21/04GK1347421SQ00806260
公開日2002年5月1日 申請日期2000年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月15日
發(fā)明者P·古蘭塔伊夫爾, M·D·貝爾洛, J·W·馬丁, D·J·澤克內(nèi)爾 申請人:伊萊利利公司