專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼蔗糖pts酶ⅱ的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼蔗糖PTS酶II的DNA，PTS酶II是一種與棒桿菌細(xì)胞攝入蔗糖有關(guān)的蛋白質(zhì)。
PTS與跨膜運(yùn)輸和各種糖磷酸化(PTS糖)的調(diào)節(jié)、以及向這些碳源運(yùn)動(dòng)和很多代謝途徑有關(guān)。PTS催化下列反應(yīng)，其中PEP指磷酸烯醇丙酮酸PEP(胞內(nèi))+糖(胞外)--＞丙酮酸(胞內(nèi))+磷酸化糖(胞內(nèi))PTS催化一種通過(guò)將胞內(nèi)磷酸烯醇丙酮酸(以下稱(chēng)“PEP”)的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)給一種胞外糖而產(chǎn)生磷酸化糖和丙酮酸的反應(yīng)。糖的磷酸化與糖的細(xì)胞跨膜運(yùn)輸相關(guān)，這些過(guò)程所需的能量由作為糖酵解途徑中間體的PEP提供。
在大腸桿菌(Escherichia Coli)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)中，組成PTS的蛋白質(zhì)催化以下反應(yīng)(1)PEP+EI--＞P-EI+丙酮酸(2)P-EI+Hpr--＞P-Hpr+EI
(3)P-Hpr+EIIA--＞P-EIIA+Hpr(4)P-EIIA+EIIB--＞P-EIIB+EIIA(5)P-EIIB+糖(胞外)--＞EIIB+糖-P(胞內(nèi))在與上述反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)中，EI(酶I)和Hpr(組氨酸蛋白質(zhì))是與所有PTS糖的磷酸化有關(guān)的胞質(zhì)可溶蛋白質(zhì)，被稱(chēng)為PTS普遍蛋白。
另一方面，EII(酶II)是PTS糖特異性的，根據(jù)糖的不同由若干個(gè)結(jié)構(gòu)域或蛋白組成。例如，甘露糖醇特異性EII是由A、B和C三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的膜結(jié)合蛋白。葡萄糖特異性EII和蔗糖特異性EII由膜結(jié)合蛋白IIB和IIC以及可溶性的IIA蛋白組成。在任一情況下，PEP的磷酸基團(tuán)都是通過(guò)EI、HPr、EIIA和EIIB轉(zhuǎn)運(yùn)給糖。作為EII的膜內(nèi)部分，EIIC結(jié)構(gòu)域構(gòu)成轉(zhuǎn)運(yùn)通道且認(rèn)為可能是底物的特定結(jié)合位點(diǎn)。
在甘露糖PTS中發(fā)現(xiàn)了第三種EII。其A、B結(jié)構(gòu)域二者融合為單個(gè)可溶性多肽，而兩個(gè)膜內(nèi)蛋白(IIC和IID)與甘露糖的跨膜運(yùn)輸有關(guān)。
大腸桿菌和鼠傷寒門(mén)氏菌中，已對(duì)編碼EI(ptsI)的基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序(Saffen，E.W.等，J.Biol.Chem.，262，pp.16241-16253，1987；De Reuse，H.和Danchin，A.，J.Bacteriol.，170，pp.3827-3837，1988)。進(jìn)而還克隆了某些糖特異性的EII基因(Saffen，E.W.等，J.Biol.Chem.，262，pp.16241-16253，1987；Erni，B.和Zanolari，B.，J.Biol.Chem.，261，pp.16398-16403，1986；Nelson，S.O.等，EMBO J.，3，pp.1587-1593，1984)。
已知某些類(lèi)型的糖通過(guò)不需要PEP的非PTS系統(tǒng)攝入細(xì)胞。
本申請(qǐng)的發(fā)明者分離出了包含編碼棒桿菌蔗糖酶(轉(zhuǎn)化酶)的基因的DNA片段并測(cè)定了其結(jié)構(gòu)。他們還通過(guò)使用包含擴(kuò)增蔗糖酶基因的棒桿菌建立了一種生產(chǎn)氨基酸或核酸的方法(日本專(zhuān)利公開(kāi)(Japanese Patent Laid-open Publication(Kokai))第5-244958和8-196280號(hào))。在所述DNA片段中，在約6kb的SmaI片段中存在四個(gè)可讀框(ORF-F1，ORF-F2，ORF-F3和ORF-F4)。
然而，本發(fā)明的發(fā)明者在比較了其他蔗糖酶基因的基礎(chǔ)上，認(rèn)為前述ORF-F2不包含全長(zhǎng)蔗糖酶基因。亦即根據(jù)已知蔗糖酶基因估計(jì)，蔗糖酶氨基酸殘基數(shù)是466-511個(gè)(Gunaseakren，P.，J.Bacteriol.，172(12)，pp.6727-35，1990)，而ORF-F2可編碼的氨基酸序列包含424個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)較短。因此，又克隆了ORF-F2下游的序列并測(cè)定了其核苷酸序列。結(jié)果揭示包含前述蔗糖酶基因的DNA片段由兩個(gè)彼此連接的獨(dú)立克隆片段組成，而且發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼蔗糖PTS酶II的新基因位于蔗糖酶基因的下游。這樣完成了本發(fā)明。
也就是說(shuō)，本發(fā)明提供以下(A)或(B)定義的蛋白質(zhì)(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有包含取代、缺失、插入、添加或翻轉(zhuǎn)一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的序列表SEQ ID NO2氨基酸序列并具有結(jié)合蔗糖活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供編碼下列(A)或(B)定義的蛋白質(zhì)的DNA(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有其中包含取代、缺失、插入、添加或翻轉(zhuǎn)一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的序列表SEQ ID NO2氨基酸序列并具有結(jié)合蔗糖活性的蛋白質(zhì)。
上述DNA包括以下(a)或(b)定義的DNA(a)包含序列表SEQ ID NO1的核苷酸3779至5761的核苷酸序列的DNA；
(b)在嚴(yán)格條件下可與包含序列表SEQ ID NO1核苷酸3779至5761的核苷酸序列的核苷酸序列雜交并編碼具有結(jié)合蔗糖活性的蛋白質(zhì)的DNA。
圖2圖示pBCT4的構(gòu)建過(guò)程。
實(shí)施本發(fā)明最佳方式下文將詳細(xì)闡述本發(fā)明。
本發(fā)明的DNA通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增位于乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)染色體DNA蔗糖酶基因下游的區(qū)段獲得，見(jiàn)下文的實(shí)施例。
可以如下擴(kuò)增與染色體DNA已知區(qū)段相鄰的區(qū)段將序列盒(cassette)與包含所述區(qū)段的DNA片段連接，并用相當(dāng)于所述已知區(qū)段的引物和相當(dāng)于所述序列盒的引物進(jìn)行PCR。這時(shí)，如果事先將所述序列盒的5’端去磷酸化，就會(huì)在染色體DNA片段與所述序列盒5’端的連接位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)缺口。所以，從序列盒引物開(kāi)始的DNA合成將在此連接位點(diǎn)終止，只有從合成引物開(kāi)始合成的DNA可以用作模板，以便從序列盒引物開(kāi)始合成，從而形成互補(bǔ)鏈。因而可進(jìn)行特定的擴(kuò)增(序列盒連接介導(dǎo)的PCR方法(Molecular and Cellular Probes，6，pp.467-475))?？赏ㄟ^(guò)商業(yè)渠道購(gòu)得應(yīng)用此方法的試劑盒(體外克隆試劑盒TAKARA LA PCRTM，Takara Shuzo)，并可用以獲得本發(fā)明的DNA。
既然本發(fā)明的DNA及其相鄰區(qū)段的核苷酸序列已經(jīng)知道，則可用根據(jù)這些核苷酸序列合成的寡核苷酸作為引物，以及用棒桿菌染色體DNA作為模板，通過(guò)PCR對(duì)其直接進(jìn)行擴(kuò)增。這樣的引物實(shí)例包括具有SEQ ID NO10和21核苷酸序列的寡核苷酸。進(jìn)一步還可以用根據(jù)這些核苷酸序列合成的寡核苷酸作為探針通過(guò)雜交從染色體DNA文庫(kù)中分離出本發(fā)明的DNA。例如可用Saito等的方法(見(jiàn)Biochim.Biophys.Acta，72，pp.619-629，1963)或者K.S.Kirby的方法(Biochem.J.，64，p.405，1956)獲得棒桿菌染色體DNA。
此外，還可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)方法來(lái)制備染色體DNA、制備染色體DNA文庫(kù)、進(jìn)行雜交反應(yīng)、PCR、制備質(zhì)粒DNA、消化和連接DNA、轉(zhuǎn)化以及設(shè)計(jì)用作引物的寡核苷酸等等。這些方法見(jiàn)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等。
用來(lái)克隆本發(fā)明DNA以及制備染色體DNA文庫(kù)等的質(zhì)粒可以是能在諸如埃希氏菌屬(genus Escherichia)細(xì)菌的微生物中復(fù)制的質(zhì)粒，其具體實(shí)例包括pBR322、pTWV228、pMW119和pUC19等。
包含如上所述獲得的本發(fā)明DNA的DNA片段核苷酸序列實(shí)例見(jiàn)序列表SEQ ID NO1。包含該序列核苷酸3779至5761的核苷酸序列的區(qū)段編碼本發(fā)明蛋白蔗糖PTS酶II。在SEQ ID NO1核苷酸序列中，其核苷酸342至1505和核苷酸2338至3609分別相當(dāng)于包含蔗糖酶基因的DNA片段的ORF-F1和ORF-F2，所述蔗糖酶基因見(jiàn)日本專(zhuān)利公開(kāi)第8-196280號(hào)。進(jìn)一步比較SEQ ID NO1核苷酸序列和日本專(zhuān)利公開(kāi)第8-196280號(hào)介紹的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO1核苷酸序列中的核苷酸1至3687區(qū)段與日本專(zhuān)利公開(kāi)第8-196280號(hào)描述的核苷酸序列相同。因此說(shuō)明上述包含蔗糖酶基因的DNA片段由兩個(gè)獨(dú)立克隆片段組成。
本發(fā)明DNA可以是編碼以下蔗糖PTS酶II的DNA所述蔗糖PTS酶II在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)存在一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位，前提是所編碼的蔗糖PTS酶II結(jié)合蔗糖的活性不降低。本文使用的術(shù)語(yǔ)“若干個(gè)”表示的數(shù)目可以根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置和氨基酸殘基的種類(lèi)而不同。這是因?yàn)榘被嶂写嬖诟叨认嗨频陌被崛绠惲涟彼岷屠i氨酸，這些氨基酸之間的差異基本上不影響蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。所以，所述蛋白質(zhì)可以是與組成蔗糖PTS酶II的完整氨基酸序列具有70％至80％或者更高同源性、優(yōu)選90％至95％同源性并具有結(jié)合蔗糖活性的蛋白質(zhì)。具體來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“若干個(gè)”是指2至180個(gè)，優(yōu)選2至60個(gè)，更優(yōu)選2至5個(gè)。
例如可如下獲得編碼與上述蔗糖PTS酶II大體相同蛋白質(zhì)的DNA通過(guò)定點(diǎn)誘變修飾核苷酸序列，從而使特定位點(diǎn)的氨基酸序列存在一個(gè)或若干個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、增加或倒位。此外，也可以通過(guò)傳統(tǒng)的誘變處理獲得上述修飾DNA。誘變處理方法的實(shí)例包括用羥胺等體外處理編碼蔗糖PTS酶II的DNA，以及通過(guò)紫外線(UV)照射或者用常規(guī)誘變處理使用的誘變劑(如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸)處理諸如埃希氏菌屬細(xì)菌的微生物，所述微生物包含編碼蔗糖PTS酶II的DNA。
上述核苷酸的取代、缺失、插入、增加或倒位等包括自然發(fā)生的突變(突變或變異)，例如在含蔗糖PTS酶II微生物的不同菌株、菌種或菌屬觀察到的突變等。
例如可以通過(guò)從編碼蔗糖PTS酶II的突變DNA或含有該DNA的細(xì)胞分離DNA獲得編碼與蔗糖PTS酶II大體相同蛋白質(zhì)的DNA，所分離的DNA在嚴(yán)格條件下可與具有序列表SEQ ID NO1核苷酸序列的3779至5761核苷酸序列的DNA雜交或者可與通過(guò)PCR等從具有所述核苷酸序列的DNA制備的探針雜交，而且所述分離的DNA編碼含有具有結(jié)合蔗糖活性的蔗糖PTS酶II的蛋白質(zhì)。這里所說(shuō)的“嚴(yán)格條件”是指形成所謂的特異性雜交分子而不能形成非特異性雜交分子的條件。很難用數(shù)值清楚定義這一條件。但是，舉例來(lái)說(shuō)，所述嚴(yán)格條件包括這樣的條件在該條件下，2種具有高度同源性的DNA分子，如同源性超過(guò)50％的2種DNA分子，可以相互雜交；而同源性低于50％的2種DNA分子不能相互雜交。另一方面，典型的嚴(yán)格雜交條件為以下列鹽濃度表示的雜交條件1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS，60℃；該雜交條件是DNA雜交中常用的洗滌條件。這里所指的同源性以Lipman-Pearson(Science，227，pp.1435-1441，1985)方法計(jì)算值或者Takashi & Gotoh(J.Biochem.，92，pp.1173-1177，1984)方法計(jì)算值表示?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法設(shè)計(jì)探針。
在所述條件下可雜交的基因包括具有所述基因產(chǎn)生的終止密碼子的基因，但通過(guò)使這些基因與可市售獲得的表達(dá)載體連接可以很容易去除這些基因，從而檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物的大小。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)是由本發(fā)明的DNA編碼的蛋白質(zhì)，它具有SEQID NO2氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以具有包含取代、缺失、插入、增加或倒位一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的相當(dāng)于序列表SEQ ID NO2氨基酸序列的氨基酸序列，前提是具有結(jié)合蔗糖的活性。
本發(fā)明的DNA可以用來(lái)增強(qiáng)棒桿菌等攝取蔗糖的能力。此外，因?yàn)镻TS消耗PEP將糖攝入細(xì)胞，所以認(rèn)為PTS不利于合成其生物合成系統(tǒng)在上游階段包含PEP的氨基酸。因此，認(rèn)為如果蔗糖PTS破壞而蔗糖可以通過(guò)不需要PEP的攝取系統(tǒng)攝入，則對(duì)蔗糖攝取率或氨基酸產(chǎn)率等方面都有利。在棒桿菌中，蔗糖特異性的非PTS系統(tǒng)不清楚，但是舉例來(lái)說(shuō)，如果蔗糖酶可以在胞外發(fā)揮作用，那么葡萄糖和果糖可以通過(guò)非PTS系統(tǒng)攝入細(xì)胞。
此外，如果將本發(fā)明的DNA加以修飾，使其編碼的蔗糖PTS酶II作用增強(qiáng)或減弱，或使其與表達(dá)控制序列如來(lái)自其他基因的啟動(dòng)子連接并導(dǎo)入棒桿菌中，從而可獲得蔗糖攝取能力增強(qiáng)或減弱的棒桿菌。具體來(lái)說(shuō)，將編碼作用增強(qiáng)的蔗糖PTS酶II的DNA分子導(dǎo)入自主復(fù)制載體或棒桿菌細(xì)胞染色體DNA。此外，將編碼作用減弱的蔗糖PTS酶II的DNA分子利用同源重組通過(guò)基因取代導(dǎo)入染色體DNA中。另一方面，利用含有溫度敏感型復(fù)制控制區(qū)段的質(zhì)粒通過(guò)基因取代可以獲得蔗糖PTS在低溫時(shí)起作用而在高溫時(shí)不起作用的棒桿菌(見(jiàn)日本專(zhuān)利公告第7-108228號(hào))。
適用于本發(fā)明的棒桿菌包括迄今分類(lèi)為短桿菌屬(genusBrevibacterium)但目前合并至棒桿菌屬的細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，而且包括與棒桿菌屬密切相關(guān)的短桿菌屬細(xì)菌。這樣的棒桿菌實(shí)例如下嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynbacterium acetoacidophilum)醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)Corynebacterium alkanolyticum美棒桿菌(Corynebacterium callunae)谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)(Corynebacterium lilium)Corynebacterium melassecola嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)谷氨酸棒桿菌(Brevibacterium divaricatum)黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)(Brevibacterium，flavum)(Brevibacterium immariophilum)乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)(Brevibacterium lactofermentum)玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)產(chǎn)氨短桿菌(產(chǎn)氨棒桿菌)(Brevibacterium ammoniagenes(Corynebacterium ammoniagenes))Brevibacterium albumBrevibacterium cerium嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)可在棒桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體實(shí)例包括pAM330(參見(jiàn)日本專(zhuān)利公開(kāi)第58-67699號(hào))、pHM1519(參見(jiàn)日本專(zhuān)利公開(kāi)第58-77895號(hào))等。而且，如果從所述載體切除可使質(zhì)粒在棒桿菌中自主復(fù)制的DNA片段并將其插入大腸桿菌載體中，則它們可用作在大腸桿菌和棒桿菌二者中均可自主復(fù)制的所謂穿梭載體。這樣的穿梭載體實(shí)例包括以下所述的載體。同時(shí)還分別列出了含有各載體的微生物，括號(hào)內(nèi)為其國(guó)際保藏處的保藏號(hào)。其中pHSC4質(zhì)粒包含溫度敏感型復(fù)制控制區(qū)段。pAJ655 大腸桿菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒桿菌SR8201(ATCC39135)pAJ1844 大腸桿菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒桿菌SR8202(ATCC39136)pAJ611 大腸桿菌AJ11884(FERM BP-138)pAJ3148 谷氨酸棒桿菌SR8203(ATCC39137)pAJ440 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)AJ11901(FERM BP-140)pHC4大腸桿菌AJ12617(FERM BP-3532)pHSC4 大腸桿菌AJ12571(FERM BP-3524)包含本發(fā)明DNA的重組載體可以根據(jù)迄今報(bào)道的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入棒桿菌中。例如，有以氯化鈣處理受體細(xì)胞以增加其對(duì)DNA通透性的方法，曾報(bào)道用這一方法處理大腸桿菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，1970)；以及用處于生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞、然后將所述DNA導(dǎo)入其中的方法，曾報(bào)道用這一方法用于枯草芽孢桿菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.，Gene，1，153，1977)。除此之外，還可使用的方法有一個(gè)方法是將DNA受體細(xì)胞制成容易吸收重組DNA的原生質(zhì)體或者原生質(zhì)球，然后將重組DNA導(dǎo)入DNA受體細(xì)胞，已知這一方法可以用于枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母菌(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet，168，111，1979；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398，1978；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75，1929，1978)；另一個(gè)方法是電脈沖法(見(jiàn)日本專(zhuān)利公開(kāi)第2-207791號(hào))。實(shí)施例下文中將詳細(xì)闡述本發(fā)明的實(shí)施例。實(shí)施例1分離編碼蔗糖PTS酶II的基因<1>應(yīng)用DNA雜交分析乳發(fā)酵短桿菌AJ12036(FERM BP-734)的染色體DNA乳發(fā)酵短桿菌AJ12036菌株于4ml M-CM2S培養(yǎng)基(含有5g/L蔗糖、10g/L聚胨、10g/L酵母抽提物、5g/L NaCl和0.1g/L DL-甲硫氨酸)中培養(yǎng)過(guò)夜，然后收集微生物細(xì)胞。利用細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒(Bacterial Geneomic DNA Purification Kit)(Advanced GeneticTechnologies)從所得的微生物細(xì)胞中抽提染色體DNA。用50μgTE緩沖液(成分10mM tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA-2Na)洗提染色體DNA。
根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)介紹的方法對(duì)上述抽提的染色體DNA進(jìn)行DNA雜交實(shí)驗(yàn)。分別用BamHI和SmaI兩種不會(huì)剪切ORF-F2 C末端側(cè)區(qū)段和ORF-F3 N末端側(cè)區(qū)段的內(nèi)切酶消化所述染色體DNA，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。以一個(gè)約3kb的片段作為探針，該探針片段是用BamHI從克隆在pSSM30質(zhì)粒(日本專(zhuān)利公開(kāi)第8-196280號(hào))上的6.9kb片段切除得到的，它包含的ORF-F2 C末端側(cè)和ORF-F3 N末端側(cè)的區(qū)段(日本專(zhuān)利公開(kāi)第8-196280號(hào)，序列表SEQ ID NO1649至4675的片段)。
結(jié)果雜交檢測(cè)到兩條帶，說(shuō)明ORF-F2和ORF-F3在染色體上并非毗鄰。所以，下面再試圖證實(shí)蔗糖酶基因下游存在的序列。<2>存在于蔗糖酶基因下游區(qū)段序列的測(cè)定為了測(cè)定蔗糖基因下游區(qū)段的核苷酸序列，首先將該下游區(qū)段通過(guò)PCR擴(kuò)增。使用TAKARA LA PCRTM體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)進(jìn)行PCR。具體如下進(jìn)行PCR。
用10種限制性?xún)?nèi)切酶(SpeI，EcoT14I，NheI，PstI，EcoT22I，BglII，BamHI，XhoI，SalI，AvaI)完全消化染色體DNA，產(chǎn)生與上述試劑盒附帶序列盒(序列表SEQ ID NO3至8)相同的切割末端。應(yīng)用這些各片段作為模板、表1所示的合成引物1和序列盒引物1(SEQ ID NO19)進(jìn)行PCR。因?yàn)樵谒鲂蛄泻械?’端沒(méi)有加入磷酸基，所以在染色體DNA片段和所述序列盒5’端的連接位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)缺口。因此從序列盒引物起始的DNA合成在該連接位點(diǎn)終止，而只有從合成引物合成的DNA用作由序列盒引物開(kāi)始合成的模板，形成互補(bǔ)鏈。
然后，應(yīng)用以上擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板、合成引物2和序列盒引物2(SEQ ID NO20)進(jìn)行PCR。其結(jié)果是，用EcoT14I，PstI，BglII，BamHI，XhoI或AvaI消化染色體DNA得到的DNA用作模板時(shí)，可擴(kuò)增得到片段。測(cè)定了用BamHI消化的DNA片段作為模板擴(kuò)增得到約1.8kb片段的核苷酸序列。表1合成引物的核苷酸序列和位置引物 核苷酸序列在SEQ ID NO1編碼 中的位置(核苷酸序號(hào))1CGTCTTGCGAGGATTCAGCGAGCT(3159至3183)G(SEQ ID NO9)2AGCTGGATTTCGGCCATGAATTCT(3179至3203)A(SEQ ID NO10)3GATCTGTTCGGTCCGCAATCACT (4189至4212)(SEQ ID NO11)4CACTGGTGGAGATGTTCCCTCAGA(4209至4233)T(SEQ ID NO12)5CATCTTCGCAACCGCATCCATGGC(4801至4825)C
(SEQ ID NO13)6CGCGCAGGGTGCAGCATGTTTGGC(4831至4854)(SEQ ID NO14)7GGGCCTTGCAGGTGCTTCAGGTGT(4888至4912)C(SEQ ID NO15)8CCGCTGTTCTTGGTATTACAGAGC(4914至4938)C(SEQ ID NO16)9GCAGCGTCAGCGATGCCATGTTTG(5322至5346)C(SEQ ID NO17)10 GCTTGGCTCAGGTGTTGCGATCGT(5356至5380)C(SEQ ID NO18)根據(jù)測(cè)定的序列合成合成引物3和4。按照上述相同的方法，應(yīng)用合成引物3和序列盒引物1組合以及合成引物4和序列盒引物2組合通過(guò)PCR連續(xù)擴(kuò)增上述片段。其結(jié)果是，用PstI或BamHI消化染色體DNA得到的DNA用作模板時(shí)，可擴(kuò)增得到片段。測(cè)定了基于PstI消化的DNA片段擴(kuò)增的片段的核苷酸序列。
根據(jù)測(cè)定的序列合成合成引物5和6。應(yīng)用合成引物5和序列盒引物1組合以及合成引物6和序列盒引物2連續(xù)進(jìn)行PCR。其結(jié)果是，用EcoT14或PtI消化的染色體DNA用作模板時(shí)，能夠證實(shí)所擴(kuò)增的片段。測(cè)定了前一種情況片段的核苷酸序列。
進(jìn)而，合成了合成引物7和8，且進(jìn)行了與上述過(guò)程同樣的操作。其結(jié)果是，EcoT14消化的染色體DNA用作模板時(shí)，可以證實(shí)所擴(kuò)增的片段。測(cè)定了這一擴(kuò)增片段的核苷酸序列。根據(jù)上述序列合成引物9和10，且進(jìn)行了與上述過(guò)程同樣的操作。其結(jié)果是，SpeI消化的染色體DNA用作模板時(shí)，可以證實(shí)所擴(kuò)增的片段。測(cè)定了這一擴(kuò)增片段的核苷酸序列。
關(guān)于核苷酸序列測(cè)定，可使用ABI生產(chǎn)的一種測(cè)序試劑盒按照其操作說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)，然后通過(guò)熒光標(biāo)記法測(cè)定所擴(kuò)增片段的核苷酸序列。
上述結(jié)果見(jiàn)序列表SEQ ID NO1。發(fā)現(xiàn)在該核苷酸序列的3684號(hào)核苷酸后存在一個(gè)新的ORF。推測(cè)該ORF由1983 bp核苷酸序列組成，相當(dāng)于核苷酸3779至5761，而且測(cè)定的核苷酸序列翻譯所得的蛋白質(zhì)由661個(gè)氨基酸殘基組成。關(guān)于ORF，對(duì)GENBANK CDS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了同源性檢索，結(jié)果見(jiàn)表2，所述ORF編碼的蛋白質(zhì)與蔗糖攝取特異性蛋白蔗糖PTS酶II具有高度同源性。在下文中這個(gè)ORF稱(chēng)為ptsIIsuc基因。表2新ORF的同源性檢索結(jié)果細(xì)菌及基因名稱(chēng) 同源已知蛋白質(zhì) 同源性(％)P.pentsaceus scrA酶IIscr 48.8枯草芽孢桿菌 treP海藻糖特異性酶IIBC43.4S.xylosus scrA酶IIscr 52.2S.mutans scrA酶IIscr 45.4S.typhimurium scrA酶IIscr 37.6質(zhì)粒pUR400實(shí)施例2蔗糖PTS酶II基因破壞菌株的制備制備ptsIIsuc基因被破壞的乳發(fā)酵短桿菌菌株。首先制備該基因破壞的質(zhì)粒(見(jiàn)


圖1)。以乳發(fā)酵短桿菌AJ12036的染色體作為模板、引物2(SEQ ID NO10)和具有下文所示的核苷酸序列的引物11(SEQID NO21)通過(guò)PCR擴(kuò)增ptsIIsuc基因片段，利用TA克隆試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行克隆，質(zhì)粒稱(chēng)為pCRS2。(引物11)CGCTACTGCTGAACGAACATGTCC(相當(dāng)于SEQ ID NO1的5947至5924核苷酸)將XbaI和SpeI消化pCRS2切除的片段與pHSG399的XbaI末端連接構(gòu)建成p399S2。再以HpaI和BamHI消化該質(zhì)粒，得到的片段(相當(dāng)于SEQ ID NO1的4385至4798核苷酸)與SmaI和BamHI消化的pHSG299連接，以制備質(zhì)粒pdSB。接著以BamHI消化pdSB，并將之與一個(gè)溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)連接，以制備質(zhì)粒pdSBT，所述復(fù)制起點(diǎn)為用BamHI消化質(zhì)粒pBCT4得到并可以在棒桿菌中復(fù)制(參見(jiàn)日本專(zhuān)利公告第7-108228號(hào))。該質(zhì)粒包含缺失5’端和3’端的ptsIIsuc基因。在約10℃至32℃下pdSBT質(zhì)粒可在棒桿菌中自主復(fù)制，而在約34℃或更高的溫度下不能自主復(fù)制。
如下構(gòu)建pBCT4以限制性酶BamHI和KpnI消化日本專(zhuān)利公告第7-108228號(hào)介紹的溫度敏感型載體pHSC4，以得到一個(gè)約3kb包含所獲得的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的DNA片段。用T4 DNA聚合酶使所得DNA片段的兩端平端化。使該DNA片段與BamHI接頭連接后再用BamHI消化。然后，將之與以BamHI消化的pHSG399連接得到pBCT4(圖2)。
以pdSBT轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌AJ12036菌株，然后用含25μg/ml卡那霉素的CM2S平板選擇轉(zhuǎn)化體。通過(guò)電脈沖法進(jìn)行轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)日本專(zhuān)利公開(kāi)第2-207791號(hào))。所得轉(zhuǎn)化體稱(chēng)為AJ12036/pTSBT。將AJ12036/pTSBT菌株稀釋后以每板103至105cfu涂布在含25μg/ml卡那霉素的M-CM2S平板上。轉(zhuǎn)化體在平板上于34℃培養(yǎng)過(guò)夜，獲得的抗藥性菌株為包含摻入其染色體的質(zhì)粒的菌株。通過(guò)PCR證實(shí)所得菌株帶有通過(guò)同源重組摻入宿主染色體的pTSIIsuc基因的載體質(zhì)粒。該整合菌株稱(chēng)為YdS1。
將所述YdS1菌株在以葡萄糖或蔗糖為糖源的基本培養(yǎng)基(20g/L葡萄糖或蔗糖、5g/L 硫酸銨、2g/L 尿素、1g/L KH2PO4、0.5g/LMgSO4·7H2O、0.002g/dl FeSO4、0.002g/dl MnSO4、100μg/L生物素、2000μg/L維生素B1、10mg/dl DL-甲硫氨酸和15g/L瓊脂，pH6.6)中于34℃培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)表3。因?yàn)閅dS1菌株可以在只以葡萄糖為碳源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而不能在只以蔗糖為碳源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此可以肯定ptsIIsuc基因是編碼蔗糖攝取中的蔗糖特異性蛋白酶II的基因。
表3在基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況菌株 碳源蔗糖葡萄糖AJ12036 能夠生長(zhǎng) 能夠生長(zhǎng)YdS1 不能生長(zhǎng) 能夠生長(zhǎng)工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種編碼棒桿菌蔗糖PTS酶II的基因以及一種其蔗糖PTS不起作用的棒桿菌菌株。所述基因和菌株可以用來(lái)培育蔗糖攝取率升高或者氨基酸、核酸等產(chǎn)率提高的菌株。
說(shuō)明書(shū)的核苷酸和氨基酸序列表序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.(味之素株式會(huì)社)<120>編碼蔗糖PTS酶II的DNA<130>B644MSOP1027<150>JP 11-189512<151>1999-07-02<160>21<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>5969<212>DNA<213>乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)<220><221>CDS<222>(3779)..(5761)<400>1agtccgtcga cgccaccatt gatgtggtgg tcaccgagct tgcggaggct ttctacatct 60acgctcccgt cggcgtggag tggggtcatt acgggtggga tcacgccggt gaaagttgcg 120gaacccatgg tgttccttgt gggttgaggg aacgagtgcg ggtgagaagt ttttcaagtg 180tctgcagttt ttaagttatg catcatcagc ttggaaggct gaggtaattc agtagacctg 240caacagcagg cctcaagtcc gaagataatt aacctagatc cgtagacata agacatcata 300cgtcctatgc ttgctggaag gaaccaaata acctcagaaa gatggcagaa gtggtgcatt 360atcaagaaaa tgcaggtcaa gcagttaaaa aaattgaggg aagaattgtt ccccccctcg 420gggtgattga tggctttctc caactcgaaa acggcatcat cacggaactc tctggagaac 480cagcacctaa aaacgcagga ttccaccccg aactccccac gattgttccc ggttttattg 540atcttcataa tcacggtgga aacggtggcg cgtttcctac gggaacgcag gaccaggcga 600ggaacaccgc gcagtatcac cgcgaacatg gcacgaccgt 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1500tactttaagt acgagtaaaa ctatcctgat tttaaaggag tcccaccatg gaaatcacta 1560tctgcaaaga cgagcaagaa gtcggcaaag cagttgcagt cctaatcgca cccttcgcca 1620acaagggtgg aaccttgggg cttgcaacag gatcctcacc actgagtacc taccaagagc 1680tcattcgcat gtatgaagct ggggaagtgt cattcaagaa ctgcaaggca ttcttgttgg 1740atgaatacgt gggactaacc cgtgacgatg aaaacagcta ctttaaaacc attcgcaaag 1800agttcactga ccacatcgac atcgttgatg aagaggtcta cagcccagat ggtgcaaacc 1860ctgatccata cgaagcagct gcagagtatg aggcaaagat cgctgcagaa tccgttgaag 1920ttcaaatcct tggcatcggc ggaaacggca catcgctttc attgaaccat catcttctct 1980gtcaggactg acaaaggtcc aggcgctgca ccctaaaact gtggaggaca acgctcgatt 2040cttcaacacc atcgaagagg tcccaaccca cgccgtcacc cagggtttgg gcactttgtc 2100ccgcgcgcaa aacatcgtgt tggtggcaac tggtgaagga aaagccgacg ccatccgcgg 2160aactgtggaa ggcccagtga ctgcttcttg cccaggttcc atcctgtaga tgcacaacat 2220gccaccatca tcgttggatg aagcagcagt atccaagctg gaaaacgctg atcactaccg 2280tctcatggag caattaaagc tgcgctagaa acaaaaagga aagtactgtg tggggctatg 2340cacacagaac tttccagttt gcgccctgcg taccatgtga ctcctccgca gggcaggctc 2400aatgatccca acggaatgta cgtcgatgga gataccctcc acgtctacta ccagcacgat 2460ccaggtttcc ccttcgcacc aaagcgcacc ggctgggctc acaccaccac gccgttgacc 2520ggaccgcagc gattgcagtg gacgcacctg cccgacgctc tttacccgga tgcatcctat 2580gacctggatg gatgctattc cggtggagcc gtatttactg acggcacact taaacttttc 2640tacaccggca acctaaaaat tgacggaaag cgccgcgcca cccaaaacct tgtcgaagtc 2700gaggacccaa ctgggctgat gggcggcatt catcgccgtt cgcctaaaaa tccgcttatc 2760gacggacccg ccagcggttt cacaccccat taccgcgatc ccatgatcag ccctgatggt 2820gatggttgga acatggttct tggggcccaa cgcgaaaacc tcaccggtgc agcggttcta 2880taccgctcga cagatcttga aaactgggaa ttctccggtg aaatcacctt tgacctcagt 2940gatgcacaac ctggttctgc tcctgatctc gttcccgatg gctacatgtg ggaatgcccc 3000aaccttttta cgcttcgcga tgaagaaact ggcgaagatc tcgacgtgct gattttctgt 3060ccacaaggat tggaccgaat ccacgatgag gttactcact acgcaagctc tgaccagtgc 3120ggatatgtcg tcgacaagct tgaaggaacg accttccgcg tcttgcgagg attcagcgag 3180ctggatttcg gccatgaatt 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1.一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為以下(A)或(B)定義的蛋白質(zhì)(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有包含取代、缺失、插入、增加或倒位一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的序列表SEQ ID NO2氨基酸序列并具有結(jié)合蔗糖活性的蛋白質(zhì)。
2.一種DNA，該DNA編碼以下(A)或(B)定義的蛋白質(zhì)(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有包含取代、缺失、插入、增加或倒位一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的序列表SEQ ID NO2氨基酸序列并具有結(jié)合蔗糖活性的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的DNA，它是以下(a)或(b)定義的DNA(a)包含序列表SEQ ID NO1的核苷酸3779至5761的核苷酸序列的DNA；(b)在嚴(yán)格條件下可與包含序列表SEQ ID NO1的核苷酸3779至5761的核苷酸序列的核苷酸序列雜交并編碼具有結(jié)合蔗糖活性的蛋白質(zhì)的DNA。
全文摘要
一種基因,該基因編碼組成棒桿菌蔗糖PTS系統(tǒng)的蛋白質(zhì),應(yīng)用序列盒－連接介導(dǎo)的PCR方法擴(kuò)增棒桿菌蔗糖酶基因下游的結(jié)構(gòu)域,因此獲得一種編碼蔗糖PTS酶II的DNA,從而提供所述基因,所述蔗糖PTS酶II是以下(A)或(B)描述的蛋白質(zhì):(A)具有序列表SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白質(zhì);(B)具有序列表SEQ ID NO:2氨基酸序列因?yàn)槿〈⑷笔А⒉迦?、增加或倒位一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生的氨基酸序列并具有結(jié)合蔗糖活性的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/54GK1371419SQ00812102
公開(kāi)日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2000年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月2日
發(fā)明者泉井正子, 杉本雅一, 中松亙, 倉(cāng)橋修 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社