專利名稱：含修飾的多不飽和脂肪酸的植物的制作方法
引言本申請要求于1999年8月26日申請的美國臨時申請系列號為60/151,224和于1999年12月17日申請的美國臨時申請系列號為60/172,128的優(yōu)先權(quán)。
一種假定的獲得這些油類和/或改變脂肪酸成分的方法是通過植物基因工程的方法。然而，有必要識別能產(chǎn)生預期表型結(jié)果的合適的核酸序列以及能介導這些序列正確應用的調(diào)節(jié)區(qū)域等等。
高等植物似乎通過通常的代謝通路(脂肪酸合成通路)合成脂肪酸。在發(fā)育的種子中，脂肪酸連接到甘油主鏈上，形成甘油三酯，儲存作為進一步萌芽的能量來源，這時的FAS通路位于原質(zhì)體。最關(guān)鍵的步驟是通過乙酰-輔酶AACP轉(zhuǎn)?；?ATA)催化乙酰-輔酶A和ACP形成乙酰-ACP(?；d體蛋白)。將乙酰-ACP延長至16和18個碳原子脂肪酸包括以下反應系列的循環(huán)反應用二碳單位將丙二酰-ACP縮合形成β-酮脂酰ACP(β-酮脂酰ACP合酶)，縮酮形成乙醇(β-酮脂酰-ACP合酶)，脫氫形成烯酰-ACP(β羥酰-ACP脫氫酶)，最后將烯酰-ACP還原成延長的飽和酰基ACP(烯酰-ACP還原酶)。β-酮脂酰ACP合酶I催化延長成棕櫚酰-ACP(C160)，而β-酮脂酰ACP合酶II催化最終延長成硬脂酰ACP(C180)。在儲藏甘油三酯中常見的植物不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸和亞麻酸，來源于硬脂酰-ACP在由可溶性質(zhì)粒Δ-9去飽和酶(也叫“硬脂酰-ACP去飽和酶”)催化的反應中發(fā)生去飽和作用形成油?；?ACP(C181)。在去飽和過程中需要分子氧的參與，其中還原型鐵氧化還原蛋白作為電子的共供體。另外的去飽和作用繼續(xù)被膜結(jié)合性的Δ-12去飽和酶和Δ-15去飽和酶作用影響。因此，這些“去飽和酶”分別產(chǎn)生了單-或多不飽和脂肪酸。
獲得能產(chǎn)生表型結(jié)果的核酸序列—該表型可以經(jīng)脂肪酸合成(FAS)、脂肪酸去飽和作用和/或?qū)⒅舅嵴先敫视椭麈溡援a(chǎn)生一種油—須遭受多種障礙包括但不局限于，識別需要的代謝因子、用合適的動力特征選擇和鑒定酶的來源、將需要的蛋白純化至可以使氨基酸測序的水平、利用氨基酸序列數(shù)據(jù)獲得能用作探針提取需要的DNA序列的核酸序列、以及構(gòu)建體的制備、轉(zhuǎn)化和所獲植物的分析。
因此，需要另加的靶核酸和修飾脂肪酸成分的方法。特別是需要產(chǎn)生多種范圍的不同脂肪酸成分的構(gòu)建體和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明總體涉及基因組去飽和酶多核苷酸，特別是編碼催化在脂肪酰鏈從羧基末端數(shù)第12(Δ-12去飽和酶或fad2)或第15(Δ-去飽和酶或fad3)位碳的脂肪?；糠植迦腚p鍵的酶的基因組去飽和酶多核苷酸。另外，本發(fā)明提供了分離的這類基因組多核苷酸序列的非編碼區(qū)域，特別包括內(nèi)含子和啟動子區(qū)域。本發(fā)明還提供了包括來源于Δ-12和Δ-15去飽和酶啟動子和內(nèi)含子序列的部分或全部序列的特異寡核苷酸。雖然本公開的序列是從大豆植物中獲得的，但是，也可以考慮來源于與大豆去飽和酶序列同源或相同的去飽和酶基因組多核苷酸序列的內(nèi)含子和啟動子區(qū)域附加序列。所述的附加去飽和酶序列可以使用下面描述的標準方法從多種植物中獲得，尤其是從含油種子作物中獲得。
本發(fā)明的另外一個方面提供了在植物中用于改變脂肪酸成分的重組DNA構(gòu)建體，尤其是改變?nèi)ワ柡兔富蚧虻鞍祝绂?12和Δ-15去飽和酶，的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯(表達)。本發(fā)明尤其涉及包含來源于基因組克隆的內(nèi)含子或啟動子區(qū)域的序列的DNA構(gòu)建體，其中所述的序列在DNA構(gòu)建體中的方向是正義方向或反義方向。然后將這些DNA構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，產(chǎn)生使脂肪酸水平，尤其油酸、亞油酸和亞麻酸水平發(fā)生變化的植物。本發(fā)明尤其有計劃提供了下調(diào)Δ-12和Δ-15去飽和酶基因表達的構(gòu)建體和方法，以便增加油酸水平，降低亞油酸和亞麻酸水平。本發(fā)明還有計劃的改變了含油種子作物的種子組織中的脂肪酸成分。
通過Δ-12和Δ-15去飽和酶多核苷酸的表達獲得的修飾的植物細胞、植物、種子和油產(chǎn)品也被認為是本發(fā)明的一部分。而且，也可以有計劃地產(chǎn)生含有特定某一脂肪酸水平的油成分。一個優(yōu)選的實施方案包含至少大約80-85％的油酸、不超過1-2％的亞油酸以及不超過1-3％的亞麻酸；第二個優(yōu)選的實施方案包含至少大約50-75％的油酸、至少10-30％的亞油酸以及不超過大約3％的亞麻酸。發(fā)明的詳述本發(fā)明涉及去飽和酶基因組序列，尤其是從宿主細胞來源的基因組脂肪酸去飽和酶核酸序列分離的非編碼序列。本發(fā)明去飽和酶序列包括任何可以從一種細胞源獲得的核酸基因組序列，包括所有非編碼區(qū)域，該序列編碼來源于一種物質(zhì)如蛋白、多肽或肽的氨基酸，它能在植物宿主細胞，如在體內(nèi)，或類植物細胞環(huán)境，如在體外，催化雙鍵插入脂肪?；糠?。正如以下會更加詳細的描述的那樣，本發(fā)明還提供了能在脂肪酰鏈從羧基末端數(shù)第12(Δ-12去飽和酶)和第15(Δ-15去飽和酶)位碳插入雙鍵的特異基因組多核苷酸序列編碼的酶。另外，本發(fā)明還提供了這類基因組序列的特異非編碼區(qū)域。
術(shù)語“非編碼”指不編碼部分或全部表達蛋白的多核苷酸序列。非編碼序列包括但不限于內(nèi)含子、啟動子區(qū)域和5’非翻譯區(qū)。
這里使用的術(shù)語“內(nèi)含子”指本名詞的通常含義，意指不編碼部分或全部表達蛋白的多核苷酸片段，通常是DNA。
這里使用的術(shù)語“外顯子”指本名詞的通常含義，意指編碼部分或全部表達蛋白的多核苷酸片段，通常是DNA。
因此，術(shù)語“內(nèi)含子”指能轉(zhuǎn)錄進入RNA分子，但在RNA翻譯成蛋白之前就排除出RNA的基因區(qū)域。與之相反，術(shù)語“外顯子”指能轉(zhuǎn)錄進入RNA，繼之能翻譯進入蛋白的基因區(qū)域。
本發(fā)明提供了Δ-12去飽和酶和Δ-15去飽和酶序列以及從該序列獲得的內(nèi)含子和啟動子區(qū)域，這在序列表和實例中有詳細的描述。特別是，兩種Δ-12去飽和酶基因組克隆被鑒定并置于序列號1和23中。一種單獨的Δ-15去飽和酶基因組克隆被鑒定并置于序列號3中。從每一Δ-12去飽和酶基因組克隆中獲得了單獨的內(nèi)含子區(qū)域，其序列分別列于序列號2和24中。從每一個Δ-12去飽和酶基因組中克隆的啟動子區(qū)被分別包括在序列號1(堿基對1-1094)和序列號23(堿基對1-1704)中。Δ-15去飽和酶在編碼區(qū)包括7個內(nèi)含子(列于序列號4，5，6，7，8，25和26)。另外，以前的結(jié)果表明，在5’非翻譯區(qū)還有一個另外的內(nèi)含子。
雖然這里描述的序列是從大豆中獲得的，但也可以考慮從與大豆的去飽和酶序列同源或一致的去飽和酶基因組多核苷酸序列中獲得內(nèi)含子和啟動子區(qū)域。特別是，可以從其他植物，尤其是從含油種子作物中獲得這些序列。這些基因組序列可以使用標準方法獲得，它們中的某些會在以下進行描述。
本發(fā)明序列可以用來改變植物中的脂肪酸組成成分(見實施例3和表I)。具體地說，可以看出正義和反義抑制可以用于獲得更廣范圍的油酸、亞油酸和亞麻酸含量。尤其可以看出的是，油酸含量范圍是從大約26-80％，亞油酸含量范圍是從大約2.97-49.92％，以及亞麻酸含量范圍是從大約3.38-8.81％。然而，這些范圍僅僅代表所能獲得的最大范圍。而且，可以有計劃地將這些序列結(jié)合以獲得另外的脂肪酸組成成分。這些組成成分優(yōu)選依賴于所用油的用途。一個優(yōu)選的組合物包括至少大約50-75％的油酸，至少大約10-30％的亞油酸和不超過大約3％的亞麻酸。一個特別優(yōu)選的實例包括至少大約60-70％的油酸，至少大約15-20％的亞油酸和不超過大約3％的亞麻酸。
雖然這里列舉的實例是利用正義或反義抑制來下調(diào)目的基因，也可以考慮使用其他改變基因表達的方法。尤其是可以考慮使用所設(shè)計的可以與這里識別的非編碼區(qū)域特異結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白或所設(shè)計的切除這類非編碼區(qū)域的核酶的方法下調(diào)基因的表達。另外，正如以下會有描述的那樣，也可以考慮使用其它本領(lǐng)域已知的下調(diào)基因表達的方法，并且可以與本發(fā)明的序列一起使用。
分離的多核苷酸、蛋白和多肽本發(fā)明一方面涉及分離的去飽和酶多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸序列包括可以從基因組核酸序列獲得的分離多核苷酸。
本發(fā)明提供了一種全長與序列表中所列序列相一致的多核苷酸序列。該多核苷酸包括非編碼序列，包括例如，但不局限于，非編碼5’和3’序列，如已轉(zhuǎn)錄、但不翻譯的序列，終止信號，核糖體結(jié)合區(qū)域，mRNA穩(wěn)定序列，內(nèi)含子，多聚腺苷酸信號以及編碼附加氨基酸的附加編碼序列。例如，可以包括有利于融合多肽純化的標志序列。本發(fā)明的多核苷酸還包括含有結(jié)構(gòu)基因和控制基因表達自然相關(guān)序列的多核苷酸。
本發(fā)明還包括以下通式的多核苷酸X-(R1)n-(R2)-(R3)n-Y其中，在5’端，X是氫，在3’端，Y是氫或一種金屬，R1和R3是任何核酸殘基，n是1至3000之間的整數(shù)，優(yōu)選在1至1000之間，R2是本發(fā)明的核酸序列，尤其是選自序列表中所列的核酸序列，優(yōu)選序列號1-8和23-29。在通式中，R2是有方向的，其5’端殘基在左，與R1結(jié)合，3’端殘基在右，與R3結(jié)合。由任何R基團表示的任何一段核酸殘基，其中R大于1，可以是雜聚物或均聚物，優(yōu)選雜聚物。
本發(fā)明進一步優(yōu)選的實例是其全長與本發(fā)明的一種多核苷酸至少有50％、60％或70％相同，以及與這些多核苷酸互補的多核苷酸。更優(yōu)選的是含有其全長與本發(fā)明多核苷酸至少有80％相同的一個區(qū)域的多核苷酸，以及與這些多核苷酸互補的多核苷酸。從這一點來看，尤其優(yōu)選其全長至少90％相同的多核苷酸，那些至少有95％相同的多核苷酸是特別優(yōu)選的。進一步來說，至少97％相同的是高度優(yōu)選的，至少98％和99％相同是特別更優(yōu)選的，其中至少99％相同是最優(yōu)選的。
優(yōu)選的實例是從基因組多核苷酸序列中獲得的多核苷酸，列于序列表中。
本發(fā)明進一步涉及與上述序列雜交的多核苷酸。本發(fā)明尤其涉及在嚴緊條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。這里使用的術(shù)語“嚴緊條件”和“嚴緊雜交條件”意指當序列之間至少有95％，優(yōu)選至少97％相同的時候就會發(fā)生雜交反應。嚴緊雜交條件的一個例子是在含50％甲酰氨、5XSSC(150mM NaCl，15mM枸櫞酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5X Denhardt液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升的變性、剪切鮭精子DNA的溶液中42℃孵育過夜，然后在0.1X SSC中在大約65℃洗脫。其它雜交和洗脫條件是已知的，并在Sambrook等人，分子克隆實驗手冊，第二版，cold Spring Harbor，紐約(1989)，特別是第二章中有例證。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，它實際上包括在嚴緊雜交條件下，用含所述多核苷酸序列或其片段的探針通過在含有全部基因的文庫中篩選序列表中所列的多核苷酸序列獲得的多核苷酸序列，以及分離所述的多核苷酸序列。有利于獲得這類多核苷酸的片段包括，例如，這里描述的探針和引物。
這里討論的關(guān)于本發(fā)明多核苷酸的測定，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以用來作為RNA，cDNA或基因組DNA的雜交探針以分離編碼多肽的全長cDNA或基因組克隆，以及分離具有與序列表中所列的多核苷酸序列高度相同的其它基因的cDNA或基因組克隆。這些探針通常包括至少15個堿基。優(yōu)選具有至少30個堿基的探針，也可以有至少50個堿基。特別優(yōu)選的是在30至50個堿基之間，包括30和50個堿基的探針。
通過使用序列表中提供的DNA序列來合成寡核苷酸探針，篩選分離某種含有或構(gòu)成序列表中所列的多核苷酸序列的基因區(qū)域。然后使用標記的、含本發(fā)明多核苷酸互補序列的寡核苷酸篩選cDNA、基因組DNA或mRNA文庫，識別與所選探針雜交的文庫中的成員。例如，制備符合去飽和酶啟動子和內(nèi)含子序列的合成寡核苷酸。在這種方法中由于低水平的雜交背景，尤其適用于在噬菌體載體文庫中篩選cDNA。
通常來說，使用核酸探針獲得的去飽和酶序列在靶去飽和酶序列和用作探針的編碼序列之間表現(xiàn)出60-70％的序列同源性。然而，也可以獲得只有50-60％序列同源性的較長的序列。核酸探針可以是核酸序列的長片段，或者可以是較短的寡核苷酸探針。當較長的核酸片段用作探針時(超過100堿基)，可以在次嚴格條件下進行篩選，以從靶樣品中獲得與用作探針的序列有20-50％偏差(即50-80％序列同源)的序列。寡核苷酸探針與編碼去飽和酶的整個核酸序列相比相對較短，但應該至少有大約10個堿基，優(yōu)選至少大約15個，更優(yōu)選至少大約20個的核苷酸。與使用較長的序列區(qū)域不同，使用較短的序列能有希望獲得更高程度的序列同源性。因此識別高度保守的氨基酸序列區(qū)域來設(shè)計寡核苷酸探針，以探測和復原其它相關(guān)的去飽和酶基因是可取的。較短的探針在進行多聚酶鏈反應(PCR)時常常特別有用，尤其是當可以識別高度保守序列時。(見Gould等人，美國PNAS(1989)861934-1938)“同源性”，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的那樣，是通過比較序列測定的兩個或多個多肽序列或兩個或多個多核苷酸序列之間的一種關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同源性”也指通過測定某種序列鏈之間的相配性，在多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度。“同源性”可以很容易地用已知的方法計算出來，這些方法包括，但不局限于，在計算分子生物學(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.編著，牛津大學出版社(Oxford University Press)，紐約(1988)；生物學計算(Biocomputing)信息學和基因組計劃(Informatics and GenomePro jects)，Smith，D.W.編著，學院出版社(Academic Press)，紐約，1993；序列數(shù)據(jù)的計算機分析。第一部分，Griffin，A.M.和Griffin H.G.編著，Humana出版社，新澤西(1994)；分子生物學的序列分析(SequenceAnalysis in Molecular Biology)，von Heinje，G.學院出版社(AcademicPress)(1987)；引物序列分析(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和Devereux，J.編著，Stockton出版社，紐約(1991)；以及Carillo，H.和Lipman，D.SIAM J Applied Math，481073(1988)中的描述?？梢栽O(shè)計測定序列同源性的方法以獲得測定序列之間的最大相配性。而且，測定同源性的方法已在可以公開獲得的程序上編輯成冊。用于測定兩序列之間同源性的計算機程序包括，但不局限于，GCG(Devereux，J等人，核酸研究(Nucleic Acid Research)12(I)387(1984)；5個BLAST配套程序，其中3個(BLASTN，BLASTX和TBLASTX)用于查詢核苷酸序列，2個(BLASTP和TBLASTN)用于查詢蛋白序列(Coulson，生物技術(shù)趨勢(Trends in Biotechnology)1276-80(1994)；Birren等人，基因組分析(Genome Analysis)，1543-559(1997))。BLASTX程序可以從NCBI和其它渠道公開獲得(BLAST手冊，Altschul，S等人，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894；Altschul，S等人，分子生物學雜志(J Mol Biol)，215403-410(1990))。眾所周知的Smith Waterman算法也可以用來計算同源性。
典型的多肽序列比較參數(shù)包括算法Needleman和Wunsch，分子生物學雜志(J Mol Biol)48443-453(1970)。
比較模板(matrix)BLOSSUM62，Hentikoff和Hentikoff，美國國家科學院(Proc.Natl.Acad.Sci USA)8910915-10919(1992)缺口補償12缺口長度補償4可以使用這些參數(shù)的程序可以從遺傳計算機集團(GeneticComputer Group)，Madison Wisconsin作為“缺口”程序公開獲得。末端缺口無補償?shù)纳鲜鰠?shù)是肽比較的默認參數(shù)。
多核苷酸序列比較參數(shù)包括算法Needleman和Wunsch，分子生物學雜志(J Mol Biol)48443-453(1970)。
比較模板(matrix)相配＝+10；不相配＝0缺口補償50缺口長度補償3可以使用這些參數(shù)的程序可以從遺傳計算機集團(GeneticComputer Group)，Madison Wisconsin作為“缺口”程序公開獲得。上述參數(shù)是核酸比較的默認參數(shù)。
對免疫學篩選來說，可以通過將純化蛋白或其一部分注射入兔或小鼠制備蛋白的抗體，這類制備抗體的方法在本領(lǐng)域是已知技術(shù)?？梢援a(chǎn)生單克隆抗體或多克隆抗體，雖然典型的多克隆抗體更利于基因分離?？梢杂肳estern分析通過抗體與編碼蛋白的交叉反應測定待測植物天然提取物中存在的相關(guān)蛋白。當觀察到交叉反應時，通過篩選代表待測植物的表達文庫分離編碼相關(guān)蛋白的基因。表達問庫可以構(gòu)建在多種商業(yè)上可以獲得的載體中，包括λgtll，如Sambrook等人描述。(分子克隆實驗手冊，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，紐約)。植物構(gòu)建體及使用方法本發(fā)明特別注重于使用重組DNA構(gòu)建體中的多核苷酸序列介導本發(fā)明去飽和酶基因組序列在宿主植物細胞中的轉(zhuǎn)錄。表達構(gòu)建體通常包括在宿主植物細胞中起作用的、有效連接至本發(fā)明核酸序列的啟動子和在宿主植物細胞中起作用的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解在植物細胞中起作用的有許多啟動子，在文獻中已有描述。特異的葉綠體和質(zhì)體啟動子，功能性葉綠體或質(zhì)體啟動子以及有效的葉綠體或質(zhì)體啟動子都可以考慮。
一類啟動子是結(jié)構(gòu)型的啟動子，如CaMV35S或FMV35S啟動子，它們在多數(shù)植物器官中產(chǎn)生了高水平的表達。CaMV35S和FMV35S啟動子的增加或復制本在本發(fā)明實踐中是有用的(Odell等人，自然(1985)313810-812；Rogers，美國專利號5,378,619)。另外，還可以使本發(fā)明的序列在特異的植物組織如葉、莖、根、管、種子、果實等中表達，且選擇的啟動子應該具有組織和發(fā)育上的特異性。
本發(fā)明特別注重于本發(fā)明核酸序列從轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的表達，優(yōu)選在植物種子組織中的表達。這類種子優(yōu)選轉(zhuǎn)錄起始序列的例子包括來源于編碼植物儲存蛋白基因序列或參與含油種子脂肪酸生物合成基因的那些序列。這些啟動子例子包括諸如napin(Kridl等人，種子科學研究雜志(Seed Sci Res J)209219(1991))、菜豆蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、ACP、硬脂酰-ACP去飽和酶、β-大豆共球蛋白的大豆α’亞單位(soy 7s(Chen等人，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，838560-8564(1986)))和油脂蛋白等基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)域。
介導去飽和酶蛋白定位于特定的細胞亞單位，例如定位在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、葉綠體或其它質(zhì)體單位可能是有益的。例如，本發(fā)明目的基因?qū)邢蛴谫|(zhì)體，如葉綠體，表達的地方，構(gòu)建體也會利用序列介導基因進入質(zhì)體。此處所述的這類序列如葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)或質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽(PTP)。以這種方式，在目的基因沒有被直接插入質(zhì)體的地方，表達構(gòu)建體會另外包含一段編碼轉(zhuǎn)運肽的基因介導目的基因進入質(zhì)體。葉綠體轉(zhuǎn)運肽可以來源于目的基因，或者可以來源于含有CTP的異源序列。這些轉(zhuǎn)運肽在本領(lǐng)域是已知的。見例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol Biol Rep.9104-126；Clark等人(1989)生物化學雜志(JBiol Chem.)26417544-17550；Della-Cioppa等人(1987)植物生理(Plant Physiol.)84965-968；Romer等人(1993)生物化學和生物物理學研究通訊(Biochem Biophys Res Commun.)1961414-1421；以及Shah等人。(1986)科學233478-481。
根據(jù)目的用途，構(gòu)建體可以含有整個基因組核酸序列或該序列的特別非編碼區(qū)或這類序列的一部分。例如，如果需要反義抑制所選去飽和酶蛋白就不需要完整序列。進一步來說，如果構(gòu)建體所用的去飽和酶序列是用作探針的話，僅制備含去飽和酶序列的一個特別部分的構(gòu)建體就可以了，例如，編碼高度保守去飽和酶區(qū)域的序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道有許多抑制宿主細胞內(nèi)源序列表達的方法。這些方法包括，但不局限于，反義抑制(Smith等人(1988)，自然，334724-726)，共同抑制(Napoli等人(1989)，植物細胞(Plant cell)2279-289)，核酶(PCT公開WO97/10328)，正義和反義結(jié)合(Waterhouse等人(1998)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)9513959-13964)，啟動子沉默(Park等人(1996)，植物雜志(Plant J)9(2)183-194)，DNA結(jié)合蛋白(Beerli等人(1997)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)9514628-14633；和liu等人(1998)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)945525-5530。抑制宿主細胞內(nèi)源序列的方法通常使用轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯至少一部分的被抑制序列。這些序列可能與內(nèi)源序列的編碼區(qū)以及非編碼區(qū)同源。
本發(fā)明植物表達構(gòu)建體還提供了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)終止區(qū)域。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域可以由編碼去飽和酶的DNA序列或來源于異源基因的合適轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域提供，例如，與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域自然相關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道任何合適的能終止植物細胞轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域可以用于本發(fā)明構(gòu)建體。
或者是，可以直接從宿主細胞質(zhì)體制備構(gòu)建體介導去飽和酶序列的表達。這類構(gòu)建體和方法在本領(lǐng)域中是已知的，且有一般描述，例如，Svab等人(1990)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)878526-8530及Svab和Maliga(1993)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)90913-917以及美國專利號5,693,507。
其中被引入了含有表達構(gòu)建體的重組DNA構(gòu)建體的植物細胞、組織、器官或植物被認為是轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)基因的細胞、組織、器官或組織。轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化的細胞或植物還包括細胞或植物的子代及使用該轉(zhuǎn)基因植物作為親代雜交，因去飽和酶核酸序列存在導致改變的表型繁育產(chǎn)生的子代。
含有本發(fā)明去飽和酶多核苷酸作為DNA目的序列以增加或降低其表達的植物表達或轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體，可以用于較廣范圍的植物生長周期，尤其是參與具有可食性和工業(yè)用途的蔬菜油生產(chǎn)的植物生長周期。最優(yōu)選的是溫帶含油種子作物。相關(guān)植物包括，但不局限于，油菜籽(Canola andHigh Erucic Acid Varieties)、向日葵、紅花、棉花、大豆、花生、椰子、棕櫚油(coconut and oil palmx)和玉米。根據(jù)將重組構(gòu)建體導入宿主細胞的方法，可能需要其它的DNA序列。重要的是，本發(fā)明對類雙子葉或單子葉種屬是實用的，而且將會非常容易的應用于新的和/或改善的轉(zhuǎn)化和調(diào)節(jié)技術(shù)。
特別需要關(guān)注的是，在植物中使用植物去飽和酶啟動子和/或內(nèi)含子構(gòu)建體產(chǎn)生含修飾的脂肪酸成分的植物或植物的一部分，包括，但不局限于葉、莖、根、繁殖體和籽。在去飽和酶啟動子和/或內(nèi)含子構(gòu)建體中特別需要關(guān)注的是在正義或反義方向使用Δ-12和Δ-15去飽和酶基因組序列的啟動子和/或內(nèi)含子序列，以改變宿主細胞中脂肪酸組成成分。
本發(fā)明的多核苷酸可以用于制備在多種宿主細胞中使用的構(gòu)建體。本發(fā)明中可以使用的構(gòu)建體包括，但不局限于植物細胞、細菌細胞、真菌細胞(包括酵母)、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
例如，為了確定所識別的核酸序列即去飽和酶編碼的蛋白的活性和特異性，可以使用桿狀病毒表達系統(tǒng)對培養(yǎng)的昆蟲細胞進行了體外測試。這些桿狀病毒表達系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的，具體描述見Lee等人，美國專利號5,348,886，在此引入僅供參考。
獲得這類轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化方法對本發(fā)明來說并不是至關(guān)重要的，可以使用當前的多種植物轉(zhuǎn)化方法。進一步來說，正如新方法可以用于轉(zhuǎn)化植物那樣，這些新方法也可以在下文中直接應用。例如，許多自然存在的易被土壤桿菌屬感染的植物種屬可以通過土壤桿菌屬調(diào)節(jié)的三或二載體轉(zhuǎn)化方法成功轉(zhuǎn)化。在許多例子中都可以通過T-DNA將構(gòu)建體的一面或兩面連接起來，優(yōu)選左側(cè)和右側(cè)接壤，更優(yōu)選右側(cè)接壤。當構(gòu)建體使用根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化模式時，上述的接壤尤其有用，雖然T-DNA連接也可以用于其它轉(zhuǎn)化模式。另外，微注射、DNA微粒轟擊和電打孔技術(shù)也得到改善，使得多種單子葉植物和雙子葉植物都可以轉(zhuǎn)化。
一般說來，DNA構(gòu)建體可以包括具有必要的調(diào)節(jié)宿主細胞表達的區(qū)域以及提供選擇轉(zhuǎn)化細胞的結(jié)構(gòu)基因。該基因可能給毒性制劑，如抗生素、重金屬、毒素等等提供抗性，給營養(yǎng)缺陷型宿主互補提供原養(yǎng)，以及提供病毒免疫等等。根據(jù)宿主的類型，可以引入表達載體或其組成成分，可以使用一種或多種標記物，其中選擇不同的宿主使用不同的條件。
在那些使用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化植物細胞的情況中，可以使用一種載體，將該載體導入土壤桿菌屬宿主，用在土壤桿菌屬宿主中存在的T-DNA或Ti-或Ri-質(zhì)粒進行同源重組。含有用于重組的T-DNA的Ti-或Ri-質(zhì)?？梢杂屑娱L臂(能引起癭瘤形成)或沒有加長臂(不能引起癭瘤形成)，只要在轉(zhuǎn)化的土壤桿菌屬宿主中存在vir基因，后者就是容許的。有加長臂的質(zhì)粒可以產(chǎn)生正常植物細胞和癭瘤的混合體。
在一些實例中，當土壤桿菌屬用做轉(zhuǎn)化宿主植物細胞的工具時，T-DNA連接區(qū)域連接的表達或轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體將被插入具有更廣宿主范圍的載體，該載體能在大腸桿菌和土壤桿菌中復制，在文獻中有關(guān)于更廣宿主范圍載體的描述。通常使用的是pRK2或其衍生物，見，例如，Ditta等人(美國國家科學院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.(1980)777347-7351))和歐洲專利申請(EPA)0 120 515，在此引入以供參考?；蛘?，也可以將要在植物細胞中表達的序列插入含分離復制序列的載體中，該復制序列的其中一條穩(wěn)定了大腸桿菌中的載體，另外一條穩(wěn)定了土壤桿菌中的載體。見，例如，McBride和Summerfelt(植物分子生物學(Plant Mol.Biol.)(1990)14269-276)，其中利用了復制pRiHRI(Jouamin等人，分子基因的產(chǎn)生(Mol.Gen.Gener.)(1985)201370-374)的起始點，增加了宿主土壤桿菌屬細胞中植物表達載體的穩(wěn)定性。
在表達構(gòu)建體和T-DNA中包括一種或多種標志，該標志能選擇轉(zhuǎn)化的土壤桿菌或轉(zhuǎn)化的植物細胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多標志都可以用于植物細胞，如氯霉素、卡那霉素、氨基糖苷G418、潮霉素抗性或其它抗性。使用的特殊標志不是本發(fā)明的要點，優(yōu)選使用的一種或另一種標志取決于特殊的宿主和構(gòu)建的方式。
為了使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞，外植體可以與轉(zhuǎn)化的土壤桿菌結(jié)合并孵育足夠的時間以利于轉(zhuǎn)化，在合適的選擇性介質(zhì)中，細菌被滅活，植物細胞得到培養(yǎng)。一旦愈傷組織形成，就可以根據(jù)已知技術(shù)通過使用合適的植物激素促進莖干形成，而且將莖干轉(zhuǎn)移到生根介質(zhì)以繁殖植物。然后植物會結(jié)種子，而種子可以用來產(chǎn)生重復性子代以及分離植物油。
為了改變宿主細胞內(nèi)不飽和脂肪酸的含量，根據(jù)本發(fā)明可以使用第二個表達構(gòu)建體。例如，可以將去飽和酶表達構(gòu)建體引入宿主細胞以便與含有編碼參與脂肪酸生物合成的蛋白的核酸序列的第二個表達構(gòu)建體連接。
有幾種可能的途徑可以用來獲得本發(fā)明含有多個表達構(gòu)建體的植物細胞。本發(fā)明包括任何產(chǎn)生植物的方法，該方法包括含有編碼本發(fā)明表達構(gòu)建體的DNA序列的構(gòu)建體以及至少一種含有另外一種編碼一種酶的DNA序列的其他構(gòu)建體。例如，表達構(gòu)建體可以用來轉(zhuǎn)化一種植物，同時第二個構(gòu)建體或者通過將兩個表達構(gòu)建體包含在單一轉(zhuǎn)化載體之中，或者通過使用不同的載體，而其中每一種載體都表達目的基因?？梢詫⒌诙€表達構(gòu)建體引入一株已被去飽和酶表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物，或者，可以將分別轉(zhuǎn)化的多株植物—其中一株表達去飽和酶構(gòu)建體，一株表達第二個構(gòu)建體—通過雜交將多個構(gòu)建體引入同一株植物。
以上僅對本發(fā)明進行了大體的描述，通過參考以下實施例將會更容易理解，以下實施例的目的僅僅為了闡明，而非限制本發(fā)明。
實施例實施例1去飽和酶基因序列的克隆1A.大豆Δ-12去飽和酶(fad2-1)通過使用大豆fad2-1 cDNA探針在大豆基因文庫中進行篩選，識別出大豆fad 2-1A序列。識別了三種公認的大豆fad2-1克隆，并進行了空斑純化。三個大豆fad2-1克隆中的兩個被連接入pBluescript IIKS+(Stratagene)并進行了測序。兩個克隆(14-1和11-12)是相同的，完全符合大豆fad2-1 cDNA。序列號1中提供了完整的fad2-1A克隆序列。
在獲得該全長克隆之前，使用PCR引物對fad2-1A基因組克隆的一部分進行了PCR擴增，該PCR引物是從5’未翻譯序列(引物12506，5’-ATACAA GCCACTAGGCAT-3’，序列號9)在cDNA(引物116985’-GATTGGCCATGCAATGAGGGAAAAGG-3’，序列號10)內(nèi)設(shè)計的。所獲得的PCR產(chǎn)物，其中含有fad2-1A內(nèi)含子，被克隆進入載體pCR2.1(Invitrogen)并進行了測序。通過使用Macvector中的Pustell比較程序比較大豆cDNA序列識別了大豆fad2-1A的部分基因組克隆(序列號27)及其內(nèi)含子區(qū)域(序列號2)。內(nèi)含子序列在ATG起始密碼子之后開始，長度為420堿基。
fad2-1基因家族的第二個成員也被識別并進行了克隆，在這里稱作fad2-1B。大豆fad2-1B部分基因組克隆(序列號23)含有啟動子(堿基對1-1074)；5’非翻譯區(qū)(堿基對1705-1782)；內(nèi)含子#1(堿基對1786-2190)；以及通過使用Macvector中的Pustell比較程序比較了大豆cDNA序列識別了一部分fad2-1B編碼區(qū)(堿基對1783-1785和2191-2463)及其內(nèi)含子區(qū)域(序列號24)。內(nèi)含子序列在ATG起始密碼子之后開始，長度為405堿基。1B.大豆Δ15去飽和酶(fad 3)使用引物106325’-CUACUACUACUACTCGAGACAAAGCCTTTAGCCTATG-3’(序列號11)和106335’-CAUCAUCAUCAUGGATCCCATGTCTCTCTATGCAAG-3’(序列號12)從大豆DNA中對部分大豆fad3基因組序列進行了PCR擴增。根據(jù)制造商的說明使用了延伸長模板PCR系統(tǒng)(Expand Long Template PCR System)(Boehringer Mannheim)。獲得的PCR產(chǎn)物被克隆進入載體pCR2.1(Invitrogen)并進行了測序。通過使用Macvector中的Pustell程序比較大豆fad 3 cDNA序列確定了大豆fad 3的部分基因組克隆序列以及內(nèi)含子區(qū)域。從識別的部分大豆基因組fad 3序列(序列號3)中識別了7個內(nèi)含子序列號4(內(nèi)含子#1)，序列號5(內(nèi)含子#2)，序列號6(內(nèi)含子#3A)，序列號7(內(nèi)含子#4)，序列號8(內(nèi)含子#5)，序列號25(內(nèi)含子#3B)以及序列號26(內(nèi)含子#3C)。內(nèi)含子#1長度為192個堿基對，定位于294和485位之間，內(nèi)含子#2長度為348個堿基對，定位于576和923位之間，內(nèi)含子#3A長度為142個堿基對，定位于991和1132位之間，內(nèi)含子#3B長度為98個堿基對，定位于1225和1322位之間，內(nèi)含子#3C長度為115個堿基對，定位于1509和1623位之間，內(nèi)含子#4長度為1231個堿基對，定位于1705和2935位之間，內(nèi)含子#5長度為626個堿基對，定位于3074和3699位之間。
使用fad2-1B部分基因組克隆(序列號23)作為模板，引物13883(5’-GCGATCGATGTATGATGCTAAATTAAATTGTGCCTG-3’(序列號30)和引物13876(5’-GCGGAATTCCTGTGTCAAAGTATAAAGA AG-3’(序列號31)，通過PCR擴增了大豆fad2-1B內(nèi)含子序列。獲得的擴增產(chǎn)物被克隆進入載體pCR2.1(Invitrogen)并進行了測序。大豆fad2-1B分別在正義和反義方向融合進質(zhì)粒pCGN5468(含有大豆7S啟動子融合進大豆fad2-1A內(nèi)含子(正義)和豌豆RBCS 3’)或pCGN5470(含有大豆7S啟動子融合進大豆fad2-1A內(nèi)含子(反義)和豌豆RBCS 3’)中的大豆fad2-1A內(nèi)含子的3’端。然后將獲得的內(nèi)含子融合體(intron comb fussion)分別引入pCGN9372，一種含由FMV啟動子調(diào)節(jié)的CP4基因的載體。使用以下描述的生物表(biolistic)方法將獲得的表達構(gòu)建體(pCGN5485，fad2-1A&B內(nèi)含子正義方向和pCGN5486，fad2-1A&B內(nèi)含子反義方向)用作大豆的轉(zhuǎn)化。
使用大豆fad 3部分基因組克隆作為模板，和以下引物內(nèi)含子#1，12568GATCGATGCCCGGGGTAATATTTTTGTGT(序列號15)和12569CACGCCTCGAGTGTTCAATTCAATCAATG(序列號16)；內(nèi)含子#2，引物125145’-CACTCGAGTTAGTTCATACTGGCT-3’(序列號17)和125155’-CGCATCGATTGCAAAATCCATCAAA-3’(序列號18)；內(nèi)含子#4，引物109265’-CUACUACUACUACTCGAGCGTAA ATAGTGGGTGAACAC-3’(序列號19)和109275’-CAUCAUCAUC AUCTCGAGGAATTCGTCCATTTTAGTACACC-3’(序列號20)；內(nèi)含子#5，引物109285’-CUACUACUACUACTCGAGGCGCGTACATTT TATTGCTTA-3’(序列號21)和109295’-CAUCAUCAUC AUCTCGAGGAATTCTGCAGTGAATCCAAATG-3’(序列號22)對從大豆fad 3基因組克隆中識別的7個內(nèi)含子中的4個進行了PCR擴增。獲得的每一內(nèi)含子的PCR產(chǎn)物被克隆進入載體pCR2.1(Invitrogen)并進行了測序。內(nèi)含子#1、#2、#4和#5在正義和反義方向被分別引入pCGN3892。pCGN3892含有大豆7S啟動子和豌豆RBCS3’。這些融合體被引入pCGN9372，一種含由FMV啟動子調(diào)節(jié)CP4基因轉(zhuǎn)化進入大豆的載體。使用以下描述的生物表(biolistic)方法將獲得的表達構(gòu)建體(pCGN5455，fad3內(nèi)含子#4內(nèi)含子的正義方向；pCGN5459，fad3內(nèi)含子#4內(nèi)含子的反義方向；pCGN5456，fad3內(nèi)含子#5內(nèi)含子的正義方向；pCGN5460，fad3內(nèi)含子#5內(nèi)含子的反義方向；pCGN5466，fad3內(nèi)含子#2內(nèi)含子的反義方向；pCGN5473，fad3內(nèi)含子#1內(nèi)含子的反義方向)用作大豆的轉(zhuǎn)化。
大豆fad3內(nèi)含子#3C和#4也從fad3基因家族的第二個成員進行了PCR擴增，這里稱為fad3-1B。大豆fad3-1B內(nèi)含子#3C和#4從大豆DNA進行了PCR擴增，使用了以下的引物，5’-CATGCTTTCT GTGCTTCTC-3’(序列號32)和5’-GTTGATCCAA CCATAGTCG-3’(序列號33)。PCR產(chǎn)物被克隆進入載體pCR2.1(Invitrogen)并進行了測序。大豆fad3-1B內(nèi)含子#3C和#4的序列見序列號28和29。實施例3植物轉(zhuǎn)化和分析通過McCabe等人(1988)生物/技術(shù)(Bio/Technology)6923-926描述的方法將含有正義和反義表達的Δ-12和Δ-15去飽和酶內(nèi)含子表達構(gòu)建體的線性DNA片段穩(wěn)定引入大豆(Asgrow variety A4922)。轉(zhuǎn)化的大豆植物通過在含草甘膦的介質(zhì)上選擇鑒定。
使用氣相色譜法對用大豆內(nèi)含子表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆系種子進行脂肪酸成分分析。T2合并的種子(庫ed seed)和單獨T2種子含油成分分析表明，與未轉(zhuǎn)化的大豆種子相比，轉(zhuǎn)基因大豆系種子油中單和多不飽和脂肪酸成分有了改變。表1提供了使用所述的構(gòu)建體獲得的簡要結(jié)果。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，去飽和酶基因非編碼區(qū)的正義和反義表達導致脂肪酸成分的改變。這些數(shù)據(jù)還表明，內(nèi)含子可以用于獲得含有不同脂肪酸成分的多種植物系。根據(jù)所需要的脂肪酸成分的不同選擇相關(guān)的植物系。另外，由于每一內(nèi)含子都能使脂肪酸水平進行某種程度的改變，可以考慮根據(jù)所需脂肪酸成分的不同，結(jié)合使用這些內(nèi)含子。
表1
本說明書中提及的所有公開和專利申請都屬于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的水平。所有公開和專利申請在此引入供參考的程度是，假定每一公開或?qū)＠暾埗际敲鞔_地和個別地引入供參考。
雖然以闡述和實施例的方式對本發(fā)明進行了一些具體描述，其目的是為了更清楚地理解本發(fā)明，顯而易見的改變和修改都在本發(fā)明附屬的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號1的多核苷酸；b)一種具有與序列號1全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號1全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號1全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號1全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號1序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
2.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號2的多核苷酸；b)一種具有與序列號2全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號2全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號2全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號2全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號2序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，選自以下群體包括a)包含序列號3的多核苷酸；b)一種具有與序列號3全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號3全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號3全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號3全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號3序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
4.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號4的多核苷酸；b)一種具有與序列號4全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號4全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號4全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號4全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號4序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
5.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號5的多核苷酸；b)一種具有與序列號5全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號5全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號5全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號5全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號5序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
6.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號6的多核苷酸；b)一種具有與序列號6全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號6全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號6全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號6全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號6序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
7.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號7的多核苷酸；b)一種具有與序列號7全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號7全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號7全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號7全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號7序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
8.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號8的多核苷酸；b)一種具有與序列號8全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號8全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號8全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號8全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號8序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
9.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號23的多核苷酸；b)一種具有與序列號23全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號23全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號23全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號23全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號23序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
10.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號24的多核苷酸；b)一種具有與序列號24全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號24全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號24全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號24全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號24序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
11.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號25的多核苷酸；b)一種具有與序列號25全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號25全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號25全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號25全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號25序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
12.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號26的多核苷酸；b)一種具有與序列號26全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號26全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號26全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號26全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號26序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
13.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號27的多核苷酸；b)一種具有與序列號27全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號27全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號27全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號27全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號27序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
14.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號28的多核苷酸；b)一種具有與序列號28全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號28全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號28全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號28全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號28序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
15.一種分離的多核苷酸，選自以下群體a)包含序列號29的多核苷酸；b)一種具有與序列號29全長上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；c)一種具有與序列號29全長上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；d)一種具有與序列號29全長上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；e)一種具有與序列號29全長上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；f)一種在嚴緊條件下與序列號29序列或其片段雜交的多核苷酸序列；以及g)一種與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
16.從選自以下群體的基因組多核苷酸序列獲得的內(nèi)含子a)在序列號1全部編碼區(qū)域上與序列號1的編碼區(qū)域具有至少70％相同的基因組多核苷酸序列；b)在序列號1全部編碼區(qū)域上與序列號1的編碼區(qū)域具有至少80％相同的基因組多核苷酸序列；c)在序列號1全部編碼區(qū)域上與序列號1的編碼區(qū)域具有至少90％相同的基因組多核苷酸序列；以及d)在序列號1全部編碼區(qū)域上與序列號1的編碼區(qū)域具有至少95％相同的基因組多核苷酸序列；
17.從選自以下群體的基因組多核苷酸序列獲得的內(nèi)含子a)在序列號3全部編碼區(qū)域上與序列號3的編碼區(qū)域具有至少70％相同的基因組多核苷酸序列；b)在序列號3全部編碼區(qū)域上與序列號3的編碼區(qū)域具有至少80％相同的基因組多核苷酸序列；c)在序列號3全部編碼區(qū)域上與序列號3的編碼區(qū)域具有至少90％相同的基因組多核苷酸序列；以及d)在序列號3全部編碼區(qū)域上與序列號3的編碼區(qū)域具有至少95％相同的基因組多核苷酸序列；
18.從選自以下群體的基因組多核苷酸序列獲得的內(nèi)含子a)在序列號23全部編碼區(qū)域上與序列號23的編碼區(qū)域具有至少70％相同的基因組多核苷酸序列；b)在序列號23全部編碼區(qū)域上與序列號23的編碼區(qū)域具有至少80％相同的基因組多核苷酸序列；c)在序列號23全部編碼區(qū)域上與序列號23的編碼區(qū)域具有至少90％相同的基因組多核苷酸序列；以及d)在序列號23全部編碼區(qū)域上與序列號23的編碼區(qū)域具有至少95％相同的基因組多核苷酸序列；
19.從選自以下群體的基因組多核苷酸序列獲得的內(nèi)含子a)在序列號27全部編碼區(qū)域上與序列號27的編碼區(qū)域具有至少70％相同的基因組多核苷酸序列；b)在序列號27全部編碼區(qū)域上與序列號27的編碼區(qū)域具有至少80％相同的基因組多核苷酸序列；c)在序列號27全部編碼區(qū)域上與序列號27的編碼區(qū)域具有至少90％相同的基因組多核苷酸序列；以及d)在序列號27全部編碼區(qū)域上與序列號27的編碼區(qū)域具有至少95％相同的基因組多核苷酸序列；
20.包含至少一種如權(quán)利要求1-19所述的多核苷酸序列的重組DNA構(gòu)建體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述的多核苷酸序列是一段內(nèi)含子序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述的內(nèi)含子序列的方向選自正義和反義方向。
23.一種含有權(quán)利要求20所述的DNA構(gòu)建體的植物細胞。
24.一種包括權(quán)利要求24所述細胞的植物。
25.一種修飾植物細胞內(nèi)脂肪酸成分的方法，所述的方法包括用權(quán)利要求21所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化一個植物細胞，和在啟動所述的多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的條件下培植所述細胞，由此改變了所述細胞的所述脂肪酸成分。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的改變選自增加油酸，降低亞麻酸以及降低亞油酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的多核苷酸序列是一段內(nèi)含子序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的內(nèi)含子序列的方向選自正義和反義方向。
29.一種通過權(quán)利要求25所述的方法產(chǎn)生的植物細胞。
30.一種抑制植物細胞內(nèi)基因表達的方法，包括以下步驟用含有被抑制基因的非編碼區(qū)在正義方向被占位的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞；以及在啟動所述的非編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄的條件下培植所述細胞，由此抑制所述基因的表達。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的非編碼區(qū)域選自內(nèi)含子、啟動子區(qū)域、5’非翻譯區(qū)以及這些序列的某些部分。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的非編碼區(qū)域選自以下群體序列號2、序列號24、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7、序列號8、序列號25、序列號26、序列號28和序列號29。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的基因編碼去飽和酶。
34.一種抑制植物細胞內(nèi)去飽和酶表達的方法，包括以下步驟用含有編碼去飽和酶基因的非編碼區(qū)在反義方向被占位的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化一個植物細胞；以及在啟動所述的非編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄的條件下培植所述細胞，由此抑制所述的去飽和酶表達。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的非編碼區(qū)域選自內(nèi)含子、啟動子區(qū)域、5’非翻譯區(qū)和這些序列的某些部分。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的非編碼區(qū)域選自以下群體序列號2、序列號24、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7、序列號8、序列號25、序列號26、序列號28和序列號29。
37.一種根據(jù)權(quán)利要求34所述方法產(chǎn)生的植物細胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的植物細胞，其中所述的細胞包括含有至少大約80-85％的油酸、不超過大約1-2％的亞油酸和不超過大約1-3％的亞麻酸的油成分。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的植物細胞，其中所述的細胞包括含有至少大約50-75％的油酸、不超過大約10-30％的亞油酸和不超過大約1-3％的亞麻酸的油成分。
40.一種修飾植物細胞內(nèi)脂肪酸成分的方法，包括以下步驟用含有編碼去飽和酶基因的非編碼區(qū)域在正義或反義方向被占位的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞；以及在啟動所述的非編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄的條件下培植所述的細胞，由此抑制所述的去飽和酶的表達。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的非編碼區(qū)域選自內(nèi)含子、啟動子區(qū)域、5’非翻譯區(qū)和這些序列的某些部分。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的非編碼區(qū)域選自以下群體序列號2、序列號24、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7、序列號8、序列號25、序列號26、序列號28和序列號29。
43.一種根據(jù)權(quán)利要求40所述方法產(chǎn)生的植物細胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的植物細胞，其中所述的細胞包括含有至少大約80-85％的油酸、不超過大約1-2％的亞油酸和不超過大約1-3％的亞麻酸的油成分。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的植物細胞，其中所述的細胞包括含有至少大約50-75％油酸、不超過大約10-30％的亞油酸和不超過大約1-3％的亞麻酸的油成分。
46.一種抑制植物細胞內(nèi)去飽和酶表達的方法，包括以下步驟用含有能結(jié)合或切除編碼去飽和酶基因非編碼區(qū)的核酸序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化一個植物細胞；以及在啟動所述的核酸序列轉(zhuǎn)錄的條件下培植所述的細胞，由此抑制所述的去飽和酶的表達。
47.一種根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法產(chǎn)生的植物細胞。
48.一種含油種子成分，包括至少大約50-75％的油酸，不超過大約10-30％的亞油酸和不超過大約1-3％的亞麻酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的核酸序列,其中所述的核酸序列是植物去飽和酶編碼序列的基因組序列。本發(fā)明還提供了去飽和酶基因組序列的啟動子和內(nèi)含子序列。本發(fā)明進一步提供了使用多核苷酸序列的重組DNA構(gòu)建體,以及在宿主植物細胞內(nèi)改變脂肪酸成分的方法。
文檔編號C12N15/29GK1378602SQ00814073
公開日2002年11月6日 申請日期2000年8月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月26日
發(fā)明者J·J·菲勒蒂 申請人:卡爾根尼有限公司