專利名稱：應(yīng)用一類酶及其編碼基因增加轉(zhuǎn)基因生物的含油量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型酶及其用于轉(zhuǎn)化的編碼基因的用途。更具體地說，本發(fā)明涉及具有酰基輔酶A二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的酶的編碼基因的用途。在轉(zhuǎn)基因生物中單獨(dú)表達(dá)的該基因?qū)⒃黾铀a(chǎn)生的油(即三酰甘油)的總量。
結(jié)合更加了解三酰甘油生物合成的遺傳工程技術(shù)的開發(fā)，現(xiàn)在使得有可能將編碼參與三酰甘油生物合成的關(guān)鍵酶的基因從野生植物種或其它界的生物轉(zhuǎn)移到馴化油料種子作物中。這樣，可以以中等成本、高純度和數(shù)量來生產(chǎn)三酰甘油。
已知三酰甘油(TAG)在動物(Bell和Coleman，1983)和植物(Cao和Huang，1986，Martin和Wilson 1983)的脂肪積蓄組織中的生物合成以及油在微生物例如細(xì)菌(Ekundayo和Packter，1994)、酵母和其它真菌(Ratledge 1989)的積蓄可以通過?；o酶A二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DAGAT)來催化，所述酶使?；鶑孽；o酶A轉(zhuǎn)移到二酰甘油，從而生成TAG。
近幾年，已經(jīng)在以下生物中鑒定了編碼DAGAT的基因動物(Cases等，1998)、植物(Hobbs等，1999；Lardizabal等，2000)和微生物(Lardizabal等，1999)。這些DAGAT屬于兩個不相關(guān)的蛋白質(zhì)家族。
已經(jīng)鑒定的DAGAT的第一種類型一DAGAT A迄今僅在動物(Cases等，1998)和植物(Hobbs等，1999)中發(fā)現(xiàn)。這些基因與編碼?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)的基因顯示有序列相似性。小鼠DAGAT A與小鼠ACAT具有20％氨基酸序列同一性(Cases等，1998)。然而，來自植物和動物的DAGAT A相互之間比與ACAT更為相似。因此，小鼠DAGAT A與擬南芥(Arabidopsis thaliana)DAGAT A具有38％氨基酸序列同一性(Hobbs等，1999)。它也與據(jù)認(rèn)為參與TAG合成的人ACAT樣蛋白ARGP1(Oelkers等，1998)有大約80％相同，表明ARGP1是一種DAGAT A。
釀酒酵母(S.cerevisiae)含有兩個與ACAT具有序列相似性的基因，ARE1和ARE2(Yang等，1996)。所編碼的蛋白與小鼠ACAT具有大約24％總體氨基酸序列同一性，并且與來自小鼠的DAGAT A具有15％同一性。應(yīng)該注意到，它們兩者之間(45％氨基酸序列同一性)比與來自高等真核生物的或者ACAT或者DAGAT更為相似。因?yàn)樗鼈兣c兩組高等真核生物的酶的進(jìn)化距離是相似的，所以不可能僅根據(jù)序列相似性將它們分為推定的ACAT或DAGAT。然而，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，Are1和Are2均為ACAT，它們一起負(fù)責(zé)存在于酵母中的所有甾醇酯的合成(Yang等，1996；Yu等，1996)。對Are1和Are2可能參與TAG的合成也進(jìn)行了研究(Yang等，1996；Yu等，1996)。根據(jù)這些研究，可以斷定Are1和Are2不參與TAG的合成。因此，現(xiàn)有技術(shù)沒有說明Are1是一種TAG合成酶，也不可能根據(jù)已經(jīng)公布的與ACAT樣序列的同源性，斷定Are1是DAGAT(Lassner和Ruezinsky，1999)。
DAGAT酶的第二個家族—DAGATB家族與任何其它已知的蛋白質(zhì)不相關(guān)。這些酶顯示與小鼠和植物ACAT樣DAGATA蛋白(Lardizabal等，2000)或與任何其它已知的蛋白質(zhì)都沒有序列同源性。
DAGATA和DAGATB不是對TAG的生物合成產(chǎn)生影響的僅有的酶。TAG也可以通過?；o酶A獨(dú)立反應(yīng)來合成。因此，新發(fā)現(xiàn)的酶磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)通過使?；鶑牧字膕n-2位置轉(zhuǎn)移到DAG來催化TAG的生成(Dahlqvist等，1999；Sthl，1999)。
在第一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的TAG合成酶或其功能片段、衍生物、變異體、直向同源物或同工酶。
本發(fā)明還包括SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列以及所述基因組序列的部分、其cDNA序列、等位基因變異體、合成變異體和突變體。這包括編碼序列表中所示多肽的變異體(包括生物活性三酰甘油合成酶)的序列以及用作探針、轉(zhuǎn)化用載體或克隆中間體的序列。
本發(fā)明的另一方面涉及與SEQ ID NO 2具有至少60％同一性的那些多肽。優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽的多核苷酸。
在一個不同的方面，本發(fā)明涉及將這些核苷酸序列應(yīng)用于重組DNA構(gòu)建體中，以指導(dǎo)本發(fā)明的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶序列在宿主生物或其后代(包括油料種子、酵母和其它真菌)以及其它油積蓄性生物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于產(chǎn)生?；D(zhuǎn)移酶編碼序列而含有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的細(xì)胞和生物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
特別有價值的是用優(yōu)先在植物種子組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。設(shè)想了可以合成所述基因序列，尤其是當(dāng)有意提供植物優(yōu)選密碼子時合成所述基因序列。
在一個不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及應(yīng)用編碼本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)的DNA序列增加不同生物的細(xì)胞內(nèi)的含油量的方法。
此外，本發(fā)明使得有可能提供一種生產(chǎn)三酰甘油的方法，所述方法包括使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或生物在以上所討論的任何核苷酸序列被表達(dá)的條件下生長，以便在這些細(xì)胞中產(chǎn)生一種具有使脂肪酸從?；o酶A轉(zhuǎn)移到二酰甘油能力的酶，從而生成三酰甘油。
此外，通過上述方法生產(chǎn)的三酰甘油包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
對本發(fā)明的特征可以基本上表述為以下方面1.應(yīng)用一種核酸序列生產(chǎn)三酰甘油(TAG)，所述核酸序列編碼催化脂肪酸從?；o酶A轉(zhuǎn)移到二酰甘油的酶，即通過用所述序列遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)油生物，以便在該生物體內(nèi)表達(dá)所述序列并且產(chǎn)生一種活性酶，以便增加該生物的含油量。
所述核酸序列來源于SEQ ID NO.1中所示的序列、釀酒酵母ARE1基因(基因組克隆或cDNA)，或者來源于所含有的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ.ID.NO.2中所示的氨基酸序列有60％或更多相同的核酸序列或cDNA。
2.轉(zhuǎn)基因生物，所述轉(zhuǎn)基因生物在其基因組內(nèi)或質(zhì)粒上包含通過重組DNA技術(shù)轉(zhuǎn)移的以上所述的核酸序列。所述轉(zhuǎn)基因生物選自真菌、植物和動物。最好是所述轉(zhuǎn)基因生物為農(nóng)作物，并且最好是所述核苷酸序列在貯藏器官特異性啟動子的控制下進(jìn)行表達(dá)?；蛘撸龊塑账嵝蛄性诜N子特異性啟動子的控制下進(jìn)行表達(dá)。
3.得自按照方面2的生物的油。
4.一種蛋白質(zhì)或其功能(酶活性)片段，所述蛋白質(zhì)由按照SEQ IDNO.1的DNA分子編碼。或者，在方面2中具體描述的生物中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有至少60％同源性的氨基酸序列。所述蛋白質(zhì)最好分離自釀酒酵母。
5.應(yīng)用方面4中具體描述的蛋白質(zhì)生產(chǎn)三酰甘油。
6.按照方面5的三酰甘油。發(fā)明詳述現(xiàn)在，參照以下附圖和實(shí)施例將更加容易地理解已概述的本發(fā)明，包括附圖和實(shí)施例僅為了說明目的，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
在TLC板上通過電子放射自顯影術(shù)(Instant Imager，Packard，US)顯現(xiàn)來自如下菌株的微粒體中所合成的放射性三酰甘油(TAG)雙重突變體H1226(泳道A)、三重突變體H1236(泳道B)和含有過量表達(dá)ARE1基因的質(zhì)粒的相同三重突變體(泳道C)。SEQ ID的簡述SEQ ID NO.1釀酒酵母ARE1基因ORF YCR048W的基因組DNA序列。
SEQ ID NO.2釀酒酵母可讀框YCR048W的氨基酸序列。
實(shí)施例實(shí)施例1-在缺乏ARE1基因的酵母細(xì)胞中三酰甘油積蓄減少材料和方法酵母菌株。用于本研究的酵母菌株與W303-1A(Thomas和Rothstein，1989)背景屬同類系。通過使兩個菌株SCY60(MATa are1-Δ∷HIS3 ade2-1 can1-100 leu2-3，112 trp1-1 ura3-1)和SCY61(MATaare2-Δ∷LEU2 ADE2 can1-100 his3-11，15 trp1-1 ura3-1)(Yang等，1996)雜交，然后分開四聯(lián)球菌，產(chǎn)生具有基因型MATαare1-Δ∷HIS3 ADE2can1-100 leu2-3，112 trp1-1 ura3-1的are1突變株H1111。作為野生型對照，我們使用SCY62(MATa ADE2 can1-100 his3-11，15 leu2-3 trp1-1 ura3-1)(Yang等，1996)。采用乙酸鋰方法，通過一系列酵母轉(zhuǎn)化，構(gòu)建分別在編碼酵母DAGAT B和PDAT的YNR008w和YOR245c中和ARE1基因被破壞的酵母突變株。如下產(chǎn)生用來破壞YOR245c和YNR008w基因的線型DNA片段。構(gòu)建對YOR245c特異性的引物(所述基因上游300堿基，CAGCATTGACGTAATGGGAA，和下游，AAAGCCAAAAAGAGAAGGACA)，從SCY62基因組DNA，采用PCR合成該基因。將PCR片段制成平端后連接到先前用限制性酶SmaI切割的pUC119中。然后將所得的質(zhì)粒YOR245c-pUC119用ClaI/StuI消化后去磷酸化，以防止重新連接。通過SmaI/SacI消化質(zhì)粒pFA6a獲得標(biāo)記KanMX4。然后將平端的KanMX4片段連接到Y(jié)OR245c-pUC119載體的YOR245c可讀框內(nèi)的ClaI和StuI位點(diǎn)之間。通過用BamHI/NdeI切割最終獲得含有所得的YOR245c∷KanMX4破壞盒的線型片段。以與YOR245c∷KanMX4片段相似的方式，構(gòu)建用來破壞YNR008w基因的線型片段。用SCY62基因組DNA擴(kuò)增YNR008w基因，將其克隆到pBluescript載體(Dahlqvist等，2000)中，用限制性酶BbsI/MunI消化。然后將TRPl標(biāo)記連接在YNR008w-pBluescript質(zhì)粒的BbsI和MunI位點(diǎn)之間，通過BamHI/PstI消化獲得含有所述破壞盒的線型片段。通過用線型YNR008w∷TRP1片段轉(zhuǎn)化野生型菌株SCY62，產(chǎn)生具有基因型MATapdat-Δ∷TRP1 ADE2 leu2-3，112 ura3-1his3-11，15 trp1-1的單PDAT突變體H1079。以相同的方式，通過用線型YOR245c∷KanMX4片段轉(zhuǎn)化H1079，構(gòu)建具有基因型MATa pdat-Δ∷TRP1 dagat B-Δ∷KanMX4 ADE2 leu2-3，112 ura3-1 his3-11，15 trp1-1的PDAT DAGAT B雙重突變體H1226。通過用線型YNR008w∷TRP1片段轉(zhuǎn)化H1111，產(chǎn)生具有基因型MATαare1-Δ∷HIS3 pdat-Δ∷TRP1ADE2 can1-100 leu2-3，112 ura3-1 trp1-1的ARE1 PDAT雙重突變體H1224。通過用線型YOR245c∷KanMX4片段轉(zhuǎn)化H1224，構(gòu)建具有基因型MATα are1-Δ∷HIS3 pdat-Δ∷TRP1 dagat B-Δ∷KanMX4 ADE2leu2-3，112 ura3-1 trp1-1的三重突變體H1236。
酵母培養(yǎng)。在液體YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中在旋轉(zhuǎn)振蕩器上于28℃或30℃培養(yǎng)酵母細(xì)胞。讓轉(zhuǎn)化細(xì)胞在缺乏尿嘧啶而補(bǔ)充2％(體積/體積)甘油和2％(體積/體積)乙醇的合成培養(yǎng)基(Sherman等，1986)中生長。
脂質(zhì)分析。根據(jù)Dahlqvist等(2000)介紹的方法，測定酵母細(xì)胞的脂質(zhì)含量，并以nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵母表示。結(jié)果在不同的生長期對其中ARE1基因被破壞的酵母突變株(SCY60)的脂質(zhì)含量進(jìn)行分析，并將其與野生型酵母細(xì)胞(SCY62)進(jìn)行比較。在培養(yǎng)10小時后在指數(shù)期收獲的are1突變細(xì)胞中，以nmol FA/干重酵母測定的脂質(zhì)總量與野生型酵母沒有顯著差異(表1)，積蓄到TAG中的脂肪酸量在野生型和are1突變體之間也沒有明顯的不同。在一個實(shí)驗(yàn)中，酵母細(xì)胞在液體YPD培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)24小時后，分析are1破壞對穩(wěn)定期細(xì)胞中油積蓄的影響。然后收獲細(xì)胞，將其重懸于補(bǔ)充16g/l甘油的基本培養(yǎng)基(Meesters等，1996)中，至生長培養(yǎng)物的原始體積。在這種補(bǔ)充甘油的基本培養(yǎng)基中，酵母細(xì)胞在適合于TAG積蓄的條件下將進(jìn)入穩(wěn)定期。再培24小時后，收獲細(xì)胞，測定其脂質(zhì)組成。arel突變體中的總脂質(zhì)含量比野生型低15％。arel突變體中的TAG量幾乎比野生型低40％，而極性脂質(zhì)含量在arel突變體和野生型酵母之間沒有顯著不同(表1)。
最近已經(jīng)表明，兩種其它基因YNR008w和YOR254c(Sthl，1999；Dahlqvist等，2000；Lardizabal等，2000)參與酵母中的TAG合成。這些基因分別編碼PDAT蛋白和DAGATB蛋白。構(gòu)建所有三個基因(ARE1、YNR008w和YOR254c)均被破壞的酵母菌株以及僅PDAT基因和DAGAT B基因被破壞的酵母菌株，在此將它們分別稱為三重突變體和雙重突變體。雙重突變體的TAG含量為野生型的48％(表2)，而在三重突變體中積蓄的TAG量僅為野生型酵母水平的4％。通過比較雙重突變體和三重突變體中積蓄的TAG量，顯然Are1蛋白有助于酵母的TAG合成。
總之，這些實(shí)驗(yàn)清楚地表明，ARE1基因產(chǎn)物有助于酵母中TAG的積蓄。表1.ARE1突變型酵母細(xì)胞(SCY60)和野生型酵母細(xì)胞(SCY62)中的脂質(zhì)含量。在不同的生長期分析ARE1基因被破壞的酵母(are1突變體)中的脂質(zhì)積蓄，并將其與對照野生型酵母進(jìn)行比較。在YPD培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)10小時后，分析指數(shù)生長中細(xì)胞的脂質(zhì)組成。通過將細(xì)胞在液體YPD培養(yǎng)基中于28℃預(yù)培養(yǎng)24小時，制備穩(wěn)定期的酵母細(xì)胞，然后收獲細(xì)胞，重懸于補(bǔ)充16g/l甘油的基本培養(yǎng)基(Meesters等，1996)中，再于28℃培養(yǎng)24小時。測定甾醇酯、TAG、其它中性脂質(zhì)和極性脂質(zhì)的含量，表示為nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵母。
SCY62 SCY60(nmol FA/mg)(nmol FA/mg)10小時48小時10小時48小時甾醇酯 15241219三酰甘油6 448 28其它中性脂質(zhì)4 6 4 5極性脂質(zhì)65746374總脂質(zhì) 90148 87126表2.PDAT DAGATB雙重突變株(H1226)、PDAT DAGATB ARE1三重突變株(H1236)和野生型酵母細(xì)胞(SCY62)中的脂質(zhì)含量。在YNB培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同的酵母菌株(全部菌株都含有空表達(dá)質(zhì)粒pJN92(Ronne等，1991))，至A600為4時加入2％(體積/體積)半乳糖。再生長22小時后收獲細(xì)胞，測定甾醇酯、TAG、其它中性脂質(zhì)和極性脂質(zhì)的含量，表示為nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵母。
SCY62 H1226 H1236(nmol FA/mg)(nmol FA/mg) (nmol FA/mg)甾醇酯13 10 1三酰甘油 163 78 7其它中性脂質(zhì) 17 16 41極性脂質(zhì) 58 66 44總脂質(zhì)251 17087實(shí)施例2-在過量表達(dá)ARE1基因的酵母細(xì)胞中三酰甘油積蓄增加材料和方法為了誘導(dǎo)ARE1基因的過量表達(dá)，將來自質(zhì)粒YEP3-16(Yang等，1996)的2001 bp EheI/Ecl 136II片段克隆到GAL1表達(dá)載體pJN92(Ronne等，1991)的BamHI位點(diǎn)，由此產(chǎn)生pUS5。用pUS5轉(zhuǎn)化野生型酵母菌株SCY62(MATa ADE2 can1-100 his3-11，15 leu2-3 trp1-1 ura3-1)(Yang等，1996)，將其在缺乏尿嘧啶而補(bǔ)充2％(體積/體積)甘油和2％(體積/體積)乙醇的合成培養(yǎng)基(Sherman等，1986)中在旋轉(zhuǎn)振蕩器上于28℃進(jìn)行培養(yǎng)。生長43小時后，通過添加2％(重量/體積)終濃度的半乳糖來誘導(dǎo)GAL1啟動子。再生長24小時后收獲細(xì)胞。用空載體pJN92轉(zhuǎn)化并在相同條件下培養(yǎng)的野生型(SCY62)細(xì)胞用作對照。根據(jù)Dahlqvist等(2000)介紹的方法，測定酵母細(xì)胞的脂質(zhì)含量，并以nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵母表示。結(jié)果通過用含有在半乳糖誘導(dǎo)型GAL1啟動子控制下的ARE1基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型酵母(菌株SCY62)，來研究ARE1基因的過量表達(dá)對脂質(zhì)積蓄的影響(表3)。通過光密度測定法進(jìn)行測定，用該啟動子過量表達(dá)ARE1基因?qū)ιL率沒有強(qiáng)作用。然而，過量表達(dá)ARE1的酵母細(xì)胞中的總脂質(zhì)含量增加到用空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的對照酵母的1.4倍(表3)。與對照相比，過量表達(dá)ARE1的酵母細(xì)胞中脂質(zhì)含量的升高幾乎都是由于TAG含量增加50％所致，而在這些細(xì)胞中甾醇酯的量也顯著增加。這些結(jié)果清楚地證實(shí)，ARE1的基因產(chǎn)物，除其較早報道的參與甾醇酯的合成(Yang等，1996)外，也參與TAG的合成。在ARE1過量表達(dá)細(xì)胞中達(dá)到的升高的TAG水平也清楚地證實(shí)，ARE1基因在增加轉(zhuǎn)基因生物含油量方面的潛在用途。表3.過量表達(dá)ARE1基因的酵母細(xì)胞中的脂質(zhì)含量。按照材料和方法一節(jié)中所述的方法，培養(yǎng)用pJN92載體中在GAL1啟動子控制下的ARE1基因轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞(SCY62)。用空載體轉(zhuǎn)化并在相同條件下培養(yǎng)的酵母細(xì)胞(SCY62)用作對照。收獲細(xì)胞，測定甾醇酯、三酰甘油、其它中性脂質(zhì)和極性脂質(zhì)的含量，表示為nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵母。
SCY62 過量表達(dá)ARE1的SCY62(nmol FA/mg)(nmol FA/mg)甾醇酯 19 27三酰甘油160 239其它中性脂質(zhì)30 32極性脂質(zhì)48 56總脂質(zhì) 257 354實(shí)施例3-ARE1基因產(chǎn)物具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性材料和方法通過運(yùn)用以下方法之一，分析用酵母細(xì)胞制備的微粒體部分中的體外二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DAGAT)活性。
方法A用含有在GAL1啟動子控制下的ARE1基因的質(zhì)粒(pUS5)轉(zhuǎn)化野生型酵母(菌株SCY62)(實(shí)施例2的材料和方法中介紹的)。該轉(zhuǎn)化酵母在缺乏尿密啶的已知成分的YNB培養(yǎng)基中于28℃進(jìn)行培養(yǎng)。生長8小時后通過添加2％(體積/體積)半乳糖誘導(dǎo)ARE1基因的表達(dá)，再生長17小時后收獲細(xì)胞。在加有4ml玻璃珠(直徑0.45-0.5mm)的12ml玻璃試管中，通過將1g酵母(鮮重)重懸于8ml冰冷緩沖液(20mM Tris-Cl，pH7.9，10mM MgCl2、1mM EDTA、5％(v/v)甘油、1mMDTT、0.3M硫酸銨)中，由該轉(zhuǎn)化酵母制備微粒體膜。用MSK細(xì)胞勻漿器(B.Braun Melsungen AG，德國)劇烈振搖(3×60s)該玻璃試管。懸液以20000g于6℃離心15分鐘，所得上清液以100000g于6℃離心2小時。將含有微粒體膜的所得沉淀重懸于0.1M磷酸鉀(pH7.2)緩沖液中，貯藏于-80℃。其中加有在含有190mM HEPES-NaOH，pH7.5、125mM MgCl2、30mM CHAPS、2.5mg/ml BSA和2nmol[14C]-棕櫚酰輔酶A(2775dpm/nmol)的50μl緩沖液中乳化的1μmol二油酰-PG和0.25μmol二油酰-DAG、相當(dāng)于10nmol磷脂酰膽堿的等份微粒體膜(50μl)中，分析DAGAT活性。反應(yīng)混合物于30℃孵育30分鐘。然后在氯仿中抽提脂質(zhì)，采用薄層層析在硅膠60板上在己烷/二乙醚/乙酸(80∶20∶1)中進(jìn)行分離。在所述板上通過電子放射自顯影術(shù)(InstantImager，Packard，US)顯現(xiàn)放射性脂質(zhì)并對其進(jìn)行定量。
方法B用空表達(dá)質(zhì)粒(pJN92)轉(zhuǎn)化實(shí)施例1的材料和方法中介紹的PDAT DAGATB雙重突變體(H1226)和PDA TDAGATB ARE1三重突變體(H1236)。通過用質(zhì)粒pUS5轉(zhuǎn)化三重突變體H1236(實(shí)施例2的材料和方法中介紹的)，產(chǎn)生在GAL1啟動子的控制下表達(dá)ARE1基因的轉(zhuǎn)化子。將所有酵母轉(zhuǎn)化子在YNB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至A600為4時加入2％(體積/體積)半乳糖。再生長6小時后收獲細(xì)胞，運(yùn)用Dahlqvist等(2000)方法的改進(jìn)方法制備微粒體。在含有0.2ml玻璃珠(直徑0.45-0.5mm)的2ml Eppendorf管中，將酵母細(xì)胞(0.2g)重懸于1.5ml冰冷緩沖液(20mM Tris·Cl，pH7.9、10mM MgCl2、1mM EDTA、5％(vol/vol)甘油、1mM DTT、0.3M硫酸銨)中。在細(xì)胞勻漿器(MiniBead Beater)中劇烈振搖(3×60s)該管。勻漿酵母以1350×g于4℃離心20分鐘，隨后將所得上清液以150000×g于4℃離心1小時。將沉淀重懸于0.1M磷酸鉀(pH7.2)中，貯藏于-80℃。將溶于氯仿的二己酰-DAG(5nmol)加到微量管中，在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)氯仿。將相當(dāng)于150μg蛋白質(zhì)的微粒體部分在由50mM HEPES(pH7.2)、5mM MgCl2和1mg/ml BSA組成的緩沖液中的等份樣品(90μl)加到該管中，將懸浮液充分混勻。最后，加入10μl[14C]-棕櫚酰輔酶A(20nmol、5000dpm/nmol，混合物于30℃孵育15分鐘。將反應(yīng)混合物中的脂質(zhì)萃取到氯仿中(Bligh和Dyer，1959)，然后在硅膠60板(Merck)上通過TLC進(jìn)行分離。TLC板首先在氯仿/甲醇/乙酸/水(85∶15∶10∶3.5)中展開80mm。然后將經(jīng)干燥的板在己烷/二乙醚/乙酸(80∶20∶1.5)中展開180mm。在所述板上通過電子放射自顯影術(shù)(Instant Imager，Packard)顯現(xiàn)放射性脂質(zhì)并對其進(jìn)行定量。結(jié)果按照材料和方法中的方法A，測定用過量表達(dá)ARE1基因的轉(zhuǎn)化酵母和用空質(zhì)粒(pJN92)轉(zhuǎn)化的對照酵母制備的微粒體膜的DAGAT活性。與對照酵母相比，用AREl過量表達(dá)子制備的微粒體膜中從[14C]-棕櫚酰輔酶A合成的放射性標(biāo)記TAG的量增加66％(


圖1)。也測定了用PDAT DAGAT B雙重突變株(H1226)細(xì)胞和PDAT DAGAT B ARE1三重突變株(H1236)細(xì)胞(方法B)制備的微粒體膜的DAGAT活性。在具有功能性ARE1基因的雙重突變體中，從加入的二己酰-DAG和[14C]-棕櫚酰輔酶A合成具有兩條己酰鏈和一條[14C]棕櫚酰鏈的TAG。在其中ARE1基因被破壞的三重突變體(圖2)中幾乎檢測不到這種合成。然而，在用表達(dá)ARE1基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的三重突變細(xì)胞中TAG的體外合成得到恢復(fù)。這清楚地表明，TAG在這些酵母突變體中的體外合成與功能性ARE1基因的存在相關(guān)，并且由ARE1基因編碼的蛋白質(zhì)具有DAGAT活性。實(shí)施例4-在表達(dá)ARE1基因的擬南芥種子中三酰甘油積蓄增加材料和方法采用校讀酶聚合酶pfu(Promega)，從酵母基因組擴(kuò)增ARE1基因。將EcoR1和Xba1限制性酶位點(diǎn)分別導(dǎo)入該片段的5’端和3’端中，使得可以定向克隆該片段。將PCR片段克隆到載體pBluescript(Stratagene)中。然后將得自該質(zhì)粒的插入片段克隆到載體pPGTV-KAN(Becker等，1993)中的napin啟動子片段(Stlberg等，1993)的下游。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)菌株GV3301中。然后用轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌屬細(xì)胞，轉(zhuǎn)化來自擬南芥的根外植體(Valvekens等，1992)。通過脂肪酸的甲基化測定擬南芥種子中的脂質(zhì)含量。將約2-3mg種子的油中的脂肪酸在2ml2％(vol/vol)H2SO4的干燥甲醇溶液中于90℃甲基化90分鐘。用己烷萃取脂肪酸甲酯，并經(jīng)GLC通過50m×0.32mm CP-Wax58-CB熔融石英柱(chrompack)對其進(jìn)行分析，十七酸甲酯用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果用napin啟動子控制下的ARE1基因轉(zhuǎn)化擬南芥，該啟動子是種子特異性的并且在油積蓄的主要階段有活性。分析得自4個獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的單個T2植株種子中的含油量(表4)。結(jié)果表明，與對照植株種子中的含油量相比，在3個品系中，50％-100％T2植株產(chǎn)生的種子中的含油量的上升具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在表達(dá)ARE1的種子中，含油量升高達(dá)18％1個系(28-1)與對照植株種子的含油量相同。表4.用ARE1基因轉(zhuǎn)化的擬南芥種子中的油積蓄在可控條件下在生長室中培育用napin啟動子控制下的ARE1基因轉(zhuǎn)化的T2植株和用空載體轉(zhuǎn)化的對照植株。通過GLC分析測定這些植株成熟種子中的含油量，并以nmol脂肪酸(FA)/mg種子表示。
*在α＝5時，根據(jù)4株對照植株的平均含油量，用平均差雙側(cè)檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。
參考文獻(xiàn)Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1993)Plant Mol Biol.20，1195-7Bell，R.M.和Coleman，R.A.(1983)，載于The Enzymes(Boyer，P.D.編著)，第16卷，第87-111頁，Academic Press，OrlandoBligh，E.G.和Dyer，W.J.(1959)Can.J.Biochem.Physiol.37，911-917Cao，Y.-Z.和Huang，A.H.C.(1986)Plant.Physiol.82，813-820Cases，S.，Smith，S.J.，Zheng，Y.-W.，Myers，H.M.，Lear，S.R.，Sande，E.，Novak，S.，Collins，C.，Welch，C.B.，Lusis，A.J.，Erickson，S.K.和Farese，R.V.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95，13018-13023Dahlqvist，A.，Sthl，U.，Lenman，M.，Banas，A.，Ronne，H.和Stymne，S.(1999)催化轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)的酶參與三酰甘油的合成(Enzymes catalysing atransacylation reaction involved in triacylglycerol synthesis)。刊登于Biochem，Mol.Biol.Plant Fatty Acids Glycerolipids Symp.，South LakeTahoe，Calif,USADahlqvist，A.，Sthl，U.，Lehman，M.，Banas，A.，Lee，M.，Sandager，L.，Ronne，H.和Stymne，S.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97，6487-6492Ekundayo，R.O.和Packter，N.M.(1994)Microbiology140，931-943Hobbs，D.H.，Lu，C.和Hills，M.J.，(1999)FEBS Letters452，145-149Lardizabal KD，Hawkins D，Thompson GA.(2000)，國際專利第WO00/01713號Lardizabal，K.，Hawkins，D.，Mai，J.和Wagner，N.(1999)新型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因家族的鑒定(Identification of a new diacylglycerolacyltransferase gene family)。刊登于Biochem，Mol.Biol.Plant FattyAcids Glycerolipids Symp.，South Lake Tahoe，Calif，USALassner，M.W.，Ruezinsky，DM.(1999)，國際專利第WO99/63096號Martin，B.A.和Wilson，R.F.(1983)Lipids18，1-6Meesters，P.A.E.P.，Huijberts，G.N.M.和Eggink，G.(1996)Appl.Microbiol.Biotechnol.45，575-579Oelkers，P.，Behari，A.，Cromley，D.，Bilbeimer，J.T.和Sturley，S.L.(1998)J.Biol.Chem.273，26765-26771Ratledge，C.(1 989)，載于Microbial Lipids(Ratledge，C.和Wilkinson，S.G.編著)2，567-668，Academic Press，LondonRonme，H.，Carlberg，M.，Hu，G.-Z.和Nehlin，J.O.(1991)Mol.Cell.Biol.11，4876-4884Sherman，F(xiàn).，F(xiàn)ink，G.R.和Hicks，J.B.(1986)Laboratory Course Manualfor Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，Plainview，NYStlberg，K.，Ellerstrm，M.，Josefsson，L.G.和Rast，L.(1993)Plant MolBiol.23，671-83Sthl，U.(1999)參與三酰甘油合成的磷脂酶和轉(zhuǎn)?；?Phospholipases and transacylases involved in triacylglycerol synthesis)?？怯?3rdWorld Congress and Exhibition of the International Society forFat Research(ISF)，Brighton，UKThomas，B.J.和Rothstein，R.(1989)Cell56，619-630Valvekens，D.，van Lijsebettens，M.和van Montagu，M.(1992)，載于Plant Tissue Culture.(Lindsey K.)，Kluwer Academic Publishers.NLYang，H.，Bard，M.，Bruner，D.A.，Gleeson，A.，Deckelbaum，R.J.，Aljinovic，G.，Pohl，T.M.，Rothstein，R.和Sturley，S.L.(1996)Science 272，1353-1356Yu，C.，Kennedy，N.J.，Chang，C.Y.G.和Rothblatt，J.A.(1996)J.Biol.Chem.271，24157-24163
序列表1一般資料i)申請人斯堪的納維亞生物技術(shù)研究公司(Scandinavian BiotechnologyResearch AB)ii)發(fā)明名稱應(yīng)用一類酶及其編碼基因增加轉(zhuǎn)基因生物的含油量iii)序列數(shù)22)SEQ ID NO1的信息i)序列特征A)長度1833個堿基B)類型核酸C)鏈型單鏈D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性ii)分子類型DNAiii)序列描述SEQ ID NO1ATGACGGAGA CTAAGGATTT GTTGCAAGAC GAAGAGTTTC TTAAGATCCG50CAGACTCAAT TCCGCAGAAG CCAACAAACG GCATTCGGTC ACGTACGATA100ACGTGATCCT GCCACAGGAG TCCATGGAGG TTTCGCCACG GTCGTCTACC150ACGTCGCTGG TGGAGCCAGT GGAGTCGACT GAAGGAGTGG AGTCGACTGA200GGCGGAACGT GTGGCAGGGA AGCAGGAGCA GGAGGAGGAG TACCCTGTGG250ACGCCCACAT GCAAAAGTAC CTTTCACACC TGAAGAGCAA GTCTCGGTCG 300AGGTTCCACC GAAAGGATGC TAGCAAGTAT GTGTCGTTTT TTGGGGACGT 350GAGTTTTGAT CCTCGCCCCA CGCTCCTGGA CAGCGCCATC AACGTGCCCT 400TCCAGACGAC TTTCAAAGGT CCGGTGCTGG AGAAACAGCT CAAAAATTTA 450CAGTTGACAA AGACCAAGAC CAAGGCCACG GTGAAGACTA CGGTGAAGAC 500TACGGAGAAA ACGGACAAGG CAGATGCCCC CCCAGGAGAA AAACTGGAGT 550CGAACTTTTC AGGGATCTAC GTGTTCGCAT GGATGTTCTT GGGCTGGATA 600GCCATCAGGT GCTGCACAGA TTACTATGCG TCGTACGGCA GTGCATGGAA 650TAAGCTGGAA ATCGTGCAGT ACATGACAAC GGACTTGTTC ACGATCGCAA 700TGTTGGACTT GGCAATGTTC CTGTGCACTT TCTTCGTGGT TTTCGTGCAC 750TGGCTGGTGA AAAAGCGGAT CATCAACTGG AAGTGGACTG GGTTCGTTGC 800AGTGAGCATC TTCGAGTTGG CTTTCATCCC CGTGACGTTC CCCATTTACG 850TCTACTACTT TGATTTCAAC TGGGTCACGA GAATCTTCCT GTTCCTGCAC 900TCCGTGGTGT TTGTTATGAA GAGCCACTCG TTTGCCTTTT ACAACGGGTA 950TCTTTGGGAC ATAAAGCAGG AACTCGAGTA CTCTTCCAAA CAGTTGCAAA 1000AATACAAGGA ATCTTTGTCC CCAGAGACCC GCGAGATTCT GCAAAAAAGT 1050TGCGACTTTT GCCTTTTCGA ATTGAACTAC CAGACCAAGG ATAACGACTT 1100CCCCAACAAC ATCAGTTGCA GCAATTTCTT CATGTTCTGT TTGTTCCCCG 1150TCCTCGTGTA CCAGATCAAC TACCCAAGAA CGTCGCGCAT CAGATGGAGG 1200TATGTGTTGG AGAAGGTGTG CGCCATCATT GGCACCATCT TCCTCATGAT 1250GGTCACGGCA CAGTTCTTCA TGCACCCGGT GGCCATGCGC TGTATCCAGT 1300TCCACAACAC GCCCACCTTC GGCGGCTGGA TCCCCGCCAC GCAAGAGTGG 1350TTCCACCTGC TCTTCGACAT GATTCCGGGC TTCACTGTTC TGTACATGCT 1400CACGTTTTAC ATGATATGGG ACGCTTTATT GAATTGCGTG GCGGAGTTGA 1450CCAGGTTTGC GGACAGATAT TTCTACGGCG ACTGGTGGAA TTGCGTTTCG 1500TTTGAAGAGT TTAGCAGAAT CTGGAACGTC CCCGTTCACA AATTTTTACT 1550AAGACACGTG TACCACAGCT CCATGGGCGC ATTGCATTTG AGCAAGAGCC 1600AAGCTACATT ATTTACTTTT TTCTTGAGTG CCGTGTTCCA CGAAATGGCC 1650ATGTTCGCCA TTTTCAGAAG GGTTAGAGGA TATCTGTTCA TGTTCCAACT 1700GTCGCAGTTT GTGTGGACTG CTTTGAGCAA CACCAAGTTT CTACGGGCAA 1750GACCGCAGTT GTCCAACGTT GTCTTTTCGT TTGGTGTCTG TTCAGGGCCC 1800AGTATCATTA TGACGTTGTA CCTGACCTTA TGA 18332)SEQ ID NO2的信息i)序列特征A)長度610個氨基酸B)類型氨基酸D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性ii)分子類型蛋白質(zhì)iii)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Glu Thr Lys Asp Leu Leu Gln Asp Glu Glu Phe Leu Lys Ile1 5 10 15Arg Arg Leu Asn Ser Ala Glu Ala Asn Lys Arg His Ser Val Thr Tyr20 25 30Asp Asn Val Ile Leu Pro Gln Glu Ser Met Glu Val Ser Pro Arg Ser35 40 45Ser Thr Thr Ser Leu Val Glu Pro Val Glu Ser Thr Glu Gly Val Glu50 55 60Ser Thr Glu Ala Glu Arg Val Ala Gly Lys Gln Glu Gln Glu Glu Glu65 70 75 80Tyr Pro Val Asp Ala His Met Gln Lys Tyr Leu Ser His Leu Lys Ser85 90 95Lys Ser Arg Ser Arg Phe His Arg Lys Asp Ala Ser Lys Tyr Val Ser100 105 110Phe Phe Gly Asp Val Ser Phe Asp Pro Arg Pro Thr Leu Leu Asp Ser115 120 125ALa Ile Asn Val Pro Phe Gln Thr Thr Phe Lys Gly Pro Val Leu Glu130 135 140Lys Gln Leu Lys Asn Leu Gln Leu Thr Lys Thr Lys Thr Lys Ala Thr145 150 155 160Val Lys Thr Thr Val Lys Thr Thr Glu Lys Thr Asp Lys Ala Asp Ala165 170 175Pro Pro Gly Glu Lys Leu Glu Ser Asn Phe Ser Gly Ile Tyr Val Phe180 l85 190Ala Trp Met Phe Leu G1y Trp Ile Ala Ile Arg Cys Cys Thr Asp Tyr195 200 205Tyr Ala Ser Tyr Gly Ser Ala Trp Asn Lys Leu Glu Ile Val Gln Tyr210 215 220Met Thr Thr Asp Leu Phe Thr Ile Ala Met Leu Asp Leu Ala Met Phe225 230 235240Leu Cys Thr Phe Phe Val Val Phe Val His Trp Leu Val Lys Lys Arg245 250 255Ile Ile Asn Trp Lys Trp Thr Gly Phe Val Ala Val Ser Ile Phe Glu260 265 270Leu Ala Phe Ile Pro Val Thr Phe Pro Ile Tyr Val Tyr Tyr Phe Asp275 280 285Phe Asn Trp Val Thr Arg Ile Phe Leu Phe Leu His Ser Val Val Phe290 295 300Val Met Lys Ser His Ser Phe Ala Phe Tyr Asn Gly Tyr Leu Trp Asp305 310 315 320Ile Lys Gln Glu Leu Glu Tyr Ser Ser Lys Gln Leu Gln Lys Tyr Lys325 330 335Glu Ser Leu Ser Pro Glu Thr Arg Glu Ile Leu Gln Lys Ser Cys Asp340 345 350Phe Cys Leu Phe Glu Leu Asn Tyr Gln Thr Lys Asp Asn Asp Phe Pro355 360 365Asn Asn Ile Ser Cys Ser Asn Phe Phe Met Phe Cys Leu Phe Pro Val370 375 380Leu Val Tyr Gln Ile Asn Tyr Pro Arg Thr Ser Arg Ile Arg Trp Arg385 390 395 400Tyr Val Leu Glu Lys Val Cys Ala Ile Ile Gly Thr Ile Phe Leu Met405 410 415Met Val Thr Ala Gln Phe Phe Met His Pro Val Ala Met Arg Cys Ile420 425 430Gln Phe His Asn Thr Pro Thr Phe Gly Gly Trp Ile Pro Ala Thr Gln435 440 445Glu Trp Phe His Leu Leu Phe Asp Met Ile Pro Gly Phe Thr Val Leu450 455 460Tyr Met Leu Thr Phe Tyr Met Ile Trp Asp Ala Leu Leu Asn Cys Val465 470 475 480Ala Glu Leu Thr Arg Phe Ala Asp Arg Tyr Phe Tyr Gly Asp Trp Trp485 490 495Asn Cys Val Ser Phe Glu Glu Phe Ser Arg Ile Trp Asn Val Pro Val500 505 510His Lys Phe Leu Leu Arg His Val Tyr His Ser Ser Met Gly Ala Leu515 520 525His Leu Ser Lys Ser Gln Ala Thr Leu Phe Thr Phe Phe Leu Ser Ala530 535 540Val Phe His Glu Met Ala Met Phe Ala Ile Phe Arg Arg Val Arg Gly545 550 555 560Tyr Leu Phe Met Phe Gln Leu Ser Gln Phe Val Trp Thr Ala Leu Ser565 570 575Asn Thr Lys Phe Leu Arg Ala Arg Pro Gln Leu Ser Asn Val Val Phe580 585 590Ser Phe Gly Val Cys Ser Gly Pro Ser Ile Ile Met Thr Leu Tyr Leu595 600 605Thr Leu610
權(quán)利要求
1.編碼催化脂肪酸從?；o酶A轉(zhuǎn)移到二酰甘油的酶的核酸序列用于生產(chǎn)三酰甘油(TAG)的用途，即通過用所述序列遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)油生物，以便在所述生物體內(nèi)表達(dá)所述序列并且產(chǎn)生一種活性酶，以便增加所述生物的含油量。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述核酸序列來源于SEQ ID NO.1中所示的序列。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述序列來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ARE1基因(基因組克隆或cDNA)。
4.權(quán)利要求1、2或3的用途，其中使用一種核酸序列或cDNA，所述核酸序列或cDNA含有編碼氨基酸序列與SEQ.ID.NO.2中所示氨基酸序列有60％或更多相同的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
5.轉(zhuǎn)基因生物，所述轉(zhuǎn)基因生物在其基因組內(nèi)或質(zhì)粒上包含通過重組DNA技術(shù)轉(zhuǎn)移的權(quán)利要求1、2、3或4的核酸序列。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因生物，所述轉(zhuǎn)基因生物選自真菌、植物和動物。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因生物，所述轉(zhuǎn)基因生物選自農(nóng)作物。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因生物，所述轉(zhuǎn)基因生物選自農(nóng)作物，并且其中所述核苷酸序列在一種貯藏器官特異性啟動子的控制下進(jìn)行表達(dá)。
9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因生物，所述轉(zhuǎn)基因生物選自農(nóng)作物，并且其中所述核苷酸序列在一種種子特異性啟動子的控制下進(jìn)行表達(dá)。
10.得自權(quán)利要求5-9的生物的油。
11.一種蛋白質(zhì)或其功能(酶活性)片段，所述蛋白質(zhì)由SEQ ID NO.1的DNA分子編碼。
12.一種在權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)所述的生物中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列或具有與所述氨基酸序列有至少60％同源性的氨基酸序列。
13.一種權(quán)利要求11或12中所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)從釀酒酵母中分離。
14.權(quán)利要求11、12或13中所述的蛋白質(zhì)的用途，所述蛋白質(zhì)用來生產(chǎn)三酰甘油。
15.權(quán)利要求的14的三酰甘油。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型酶及其用于轉(zhuǎn)化的編碼基因的用途。更具體地說，本發(fā)明涉及具有?；o酶A二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的編碼基因的用途。在轉(zhuǎn)基因生物中單獨(dú)表達(dá)的該基因?qū)⒃黾铀a(chǎn)生的油即三酰甘油的總量。
文檔編號C12N15/82GK1399682SQ0081542
公開日2003年2月26日 申請日期2000年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月12日
發(fā)明者A·巴納斯, L·桑達(dá)格爾, U·斯塔爾, A·達(dá)爾奎斯特, M·倫曼, H·龍納, S·斯蒂姆尼 申請人:斯堪的納維亞生物技術(shù)研究公司