專利名稱：一種類凝血酶基因及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種蛇毒類凝血酶及其編碼序列、含有該序列的重組質(zhì)粒和菌株，以及由所述序列編碼的類凝血酶在大腸桿菌中的表達及其應用。
背景技術(shù)：
蛇毒類凝血酶主要存在于蝮亞科(和蝰科(CroiahWae)家族，是絲氨酸蛋白酶中的肽鏈內(nèi)切酶，屬于胰蛋白酶家族。主要功能是特異性的水解纖維蛋白原，釋放纖維蛋白肽A (Fibrinopeptide, FPA)和B (FPB)。類凝血酶不激活凝血因子，降解纖維蛋白原產(chǎn)生可溶性、側(cè)鏈不交聯(lián)的高聚纖維蛋白肽片段，形成的(血)凝塊不穩(wěn)定，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)或正常纖溶系統(tǒng)清除。鑒于蛇毒類凝血酶在降解纖維蛋白原時的獨特生物活性，已作為抗血栓藥物用于心血管疾病和血液栓塞性疾病及術(shù)后血栓形成的預防和治療有·多年的歷史。在臨床上除用于腦梗塞、血栓閉塞性脈管炎、股動脈栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病及預防術(shù)后血栓再發(fā)等治療外，對腎病、紅斑狼瘡、病毒性肝炎及雷諾氏病等有一定療效。針對蛇毒類凝血酶的研究可追溯到上世紀三十年代，迄今商品化的蛇毒類凝血酶制劑有馬來西亞紅口蝮蛇(Xklloselasma rhodostoma )類凝血酶Ancrod (商品名Arvin )、美洲矛頭峻蛇atrox類凝血酶 Batroxobin (商品名 Reptilase )、尖吻峻蛇acwiiAs)類凝血酶Acutin (商品名Defibrase )、長白山烏蘇里峻蛇W1S1Stfriefl1Si1S)類凝血酶 Gussurobin (商品名 Defibrase )以及短尾峻蛇(.GloycIius知ehcawdks)類凝血酶“抗栓酶”。這些酶來源于天然蛇毒，多個因素限制了它們的規(guī)?；苽浜团R床應用。蛇毒含有多種毒性蛋白水解酶，影響血液循環(huán)和神經(jīng)系統(tǒng)，即使是痕量殘留都可引發(fā)副反應，嚴重時可致死。高純度的蛇毒類凝血酶耗費高額分離純化成本。此外，國家法律明確規(guī)定對稀有物種和生態(tài)資源的保護，強制禁止捕殺珍惜蛇種。綜上所述，研發(fā)類凝血酶制劑的替代方案勢在必行。利用生物化學與分子生物學手段生產(chǎn)重組蛇毒類凝血酶避免毒性蛋白水解酶雜質(zhì)殘留造成的風險，同時易于產(chǎn)品規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化，是取代天然蛇毒類凝血酶制備的有效途徑。研究發(fā)現(xiàn)，蛇毒類凝血酶活性中心序列存在高度保守性，利用機理研究較為透徹的大腸桿菌表達體系進行聞效表達成為當如研究的重點。另外，原核體系對外源基因表達無法建立正確的鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵，引起外源蛋白錯誤折疊，致使目的蛋白活力喪失或降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種蛇源的類凝血酶基因(將其命名為acutobin00-14),以及將其在大腸桿菌中克隆表達,解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足,構(gòu)建能夠高效表達的類凝血酶重組生產(chǎn)菌株，實現(xiàn)一種蛇毒類凝血酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，純化所得目的蛋白可進一步拓寬其應用范圍。
由于原核體系對外源基因表達無法建立正確的鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵，引起外源蛋白錯誤折疊，致使目的蛋白活力喪失或降低。為克服這一問題，本發(fā)明采用融合硫還原蛋白基因的pET_32a質(zhì)粒載體，有效維系細胞內(nèi)的二硫鍵以此來維系細胞氧化還原狀態(tài)。同時，將質(zhì)粒載體攜帶的His標簽(多位六個組氨酸殘基組成的序列)與目標蛋白融合，利用該標簽特異性的與二價金屬離子(如鎳、鋅等)發(fā)生螯合作用提高純化效率。在His標簽下游與多克隆位點間，該質(zhì)粒存在一個腸激酶酶切位點，通過對融合蛋白酶切，可進行初步驗證。本發(fā)明的一種蛇毒類凝血酶基因，其核苷酸序列如SEQ NO. I所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。所述類凝血酶基因經(jīng)以下步驟獲得
(1)從蛇毒腺中分離提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用PCR擴增；擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并回收凝膠中的目標基因； (2)將步驟(I)所得目標基因進行DNA序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行分析比對，最終確定類凝血酶基因。將所述的類凝血酶基因克隆到pET-32a載體中，得到類凝血酶基因重組載體。將所述重組載體導入大腸桿菌，得到含有類凝血酶基因重組載體的大腸桿菌細胞。培養(yǎng)所述的含有類凝血酶基因重組載體的大腸桿菌細胞，通過發(fā)酵誘導其表達，產(chǎn)生類凝血酶。所述的類凝血酶通過硫酸銨沉降，離子交換層析和親和層析純化，得到純酶形式的類凝血酶。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
本發(fā)明利用基因工程手段制備能夠高效表達蛇毒類凝血酶的生產(chǎn)株，實現(xiàn)蛇毒類凝血酶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),并獲得優(yōu)質(zhì)的蛇毒類凝血酶產(chǎn)品。本發(fā)明方法生產(chǎn)成本低,且產(chǎn)品生物學活性高、純度高，適用于大規(guī)模的生產(chǎn)應用，本發(fā)明制備的類凝血酶在醫(yī)學上有廣泛的應用前
旦
-5^ O


圖I為源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobin00-14基因(l_403bp)與其他來源類凝血酶(28183 :acutobin00-14、AF159057 :尖吻蝮蛇類凝血酶、D67083 :赤尾鮐類凝血酶、AF395768 :福建竹葉青類凝血酶、AF056033 :亞洲蝮蛇類凝血酶、EF690365 :白唇竹葉青類凝血酶)核苷酸序列的比較；
圖2為源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobin00-14基因(404-709bp)與其他來源類凝血酶(28183 :acutobin00-14、AF159057 :尖吻蝮蛇類凝血酶、D67083 :赤尾鮐類凝血酶、AF395768 :福建竹葉青類凝血酶、AF056033 :亞洲蝮蛇類凝血酶、EF690365 :白唇竹葉青類凝血酶)核苷酸序列的比較；
圖3為源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobinOO-14基因類凝血酶與其他來源類凝血酶(28183 :acutobin、AF159057 :尖吻蝮蛇類凝血酶、D67083 :赤尾鮐類凝血酶、AF395768 :福建竹葉青類凝血酶、AF056033 :亞洲蝮蛇類凝血酶、EF690365 白唇竹葉青類凝血酶)氨基酸序列的比較；圖4為源于尖吻蝮蛇的蛇毒腺acutobinOO-14基因類凝血酶在質(zhì)粒pET32a上的重組子結(jié)構(gòu)圖及質(zhì)粒pET-32a圖譜；
圖5為源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因類凝血酶在大腸桿菌中誘導表達目的蛋白的SDS-PAGE 圖譜；
圖6為源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因類凝血酶經(jīng)過硫酸銨沉降、陰離子交換層析和鎳柱親和層析純化后目的蛋白SDS-PAGE圖譜；
圖7源于尖吻蝮蛇acutobinOO-14基因類凝血酶酶活力鑒定圖。
具體實施方式
以下結(jié)合具體的實施例，進一步闡述本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實驗材料和試劑
I.菌株和載體
大腸桿菌Rosetta2 (DE3)及表達載體pET_32a購自Novagen公司；pCP2. I Vector購自 invitrogen 公司。2.酶類及其他生化試劑
限制性內(nèi)切酶、DNA Maker、蛋白質(zhì)Maker均購自Fermentas (MBI),其他常規(guī)試劑為上海生工或進口。3.培養(yǎng)基
使用的培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基
4.本發(fā)明中所用到的生物化學技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實施例中，除非特殊說明，所有實驗操作均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或部分進行，包括[美]J.莎姆布魯克等，分子克隆實驗指南；趙永芳等，生物化學技術(shù)原理及其應用(第二版)；朱檢等，生物化學實驗[M]。實施例I類凝血酶基因的克隆 (I)總RNA的分離提取
Trizol Reagent,充分振勻，室溫放置5min,
使其完全裂解；加入O. 2ml的氯仿振蕩15s，室溫放置3min ;置于高速冷凍離心機，4°C，12，000g離心15min，使溶液分層；吸取上層含RNA的水相，轉(zhuǎn)移至另一離心管中(約750μ1);加入O. 5ml的異丙醇混勻(不要過于劇烈)，室溫放置IOmin ;置于高速冷凍離心機，4°C, 12, OOOg離心15min ;棄上清，加入Iml的75%乙醇，溫和振蕩后，置于高速冷凍離心機4°〇，8，0008離心51^11 ;棄上清，并盡量控干液體，在室溫中晾干5min ;加入50μ1經(jīng)DEPC處理并高壓滅菌的ddH20，置于50°C恒溫箱中保溫lOmin，使RNA充分溶解；分光光度計測定所提RNA的A260/280值，及檢測其質(zhì)量。(2) cDNA第一鏈的合成
反轉(zhuǎn)錄成第一鏈 cDNA :參照(First-straind cDNA Synthesis KIT)產(chǎn)品說明，
在 20μ1 體系中，加入 Mg 總 RNA、lPl Oligo dT18 (50(^g/ml)和 Rnase-free 水，在70°C水浴溫育IOmin后，立即置于冰浴冷卻；繼續(xù)向冷卻的管中加入4μ1 5XBuffer、2PlO. IM的DTT和 μ IOmM的dNTPs，混勻后于42°C水浴保溫2min ;再加入Ιμ1(200υ)反轉(zhuǎn)錄酶，42°C繼續(xù)保溫50min ;最后，置于70°C水浴保溫15min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，獲得第一鏈cDNA。實驗過程中設(shè)置不加RNA的陰性對照。(3) PCR獲取目的基因
根據(jù)NCBI發(fā)表的蛇毒類凝血酶基因序列設(shè)計引物P1 (SEQ NO. 3)和P2 (SEQ NO. 4)，分別含有艙 和酶切位點，用于pET-32a質(zhì)粒的構(gòu)建；所述引物均由上海生工合成，引物序列如下
Pl:5’ GAGCTCGTCATTGGAGGTGTTGAATGTGAC 3’
P2 :5， GCGGCCGCTCATTATGGGGGGCAG 3，
本實施例PCR程序為94°C預變性101^11;941變性308，551退火308，721延伸2min,循環(huán)擴增30次；最后72°C延伸lOmin。擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并回 收凝膠中的目標基因。得到產(chǎn)物P1-P2.
(4)cDNA亞克隆
制備好的雙鏈cDNA P1-P2插入到載體系統(tǒng)pCP2. I vector上，分別將連接物轉(zhuǎn)入制備好的DH5a感受態(tài)細胞，涂LB平板(含lOOPg/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取在抗性平板上生長的陽性克隆子接入2ml LB培養(yǎng)基中(含lOOPg/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)過夜；收集培養(yǎng)液，IOOOOrpm室溫離心Imin收集菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工)提取質(zhì)粒；質(zhì)粒分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶和feci進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測；挑取陽性克隆 PCP2.1- P1-P2 用 Pl (SEQ NO. 3 :5’ GAGCTCGTCATTGGAGGTGTTGAATGTGAC 3，)和P2 (SEQ NO. 4 :5’ GCGGCCGCTCATTATGGGGGGCAG 3’)引物進行測序(廈門英韋創(chuàng)津生物科技有限公司)，測序采用Sanger測序方法。pCP2. I- P1-P2 測序結(jié)果是，產(chǎn)物 P1-P2 大小為 71 Ibp ( SEQ NO. I),經(jīng) NCBI 比對結(jié)果顯示該序列編碼尖吻蝮蛇類凝血酶,將其命名為acutobin00-14，經(jīng)序列分析，其中第709-711位為終止密碼子TAA ;第1-708位編碼成熟尖吻蝮蛇類凝血酶，共236個氨基酸(SEQ NO. 2);在從^1中查找、獲取相關(guān)基因及氨基酸序列，進行多序列比對(圖1-3);將acutobinOO-14氨基酸序列與臺灣產(chǎn)的尖吻蝮蛇類凝血酶(AF159057)比對有高達99%的同源性，與赤尾鮐絲氨酸蛋白酶原和福建竹葉青絲氨酸蛋白酶原比對達86%同源性，與亞洲蝮蛇和白唇竹葉青類凝血酶蛋白酶比對達84%同源性。
實施例2 acutobinOO-14編碼基因在大腸桿菌中的表達
將實施例I-(4)中所得到的質(zhì)粒pCP2. 1-P1-P2 (即pCP2. I-acutobinOO-14)經(jīng)似1和5^1雙酶切得到acutobinOO-14片段，與經(jīng)過艙(1和5^1雙酶切的pET32a質(zhì)粒連接，將連接物轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細胞DH5a中，經(jīng)藍白斑篩選，提質(zhì)粒鑒定(方法同實施例1)，得到重組質(zhì)粒pET32a-acutobin00_14 (如圖4所示)。取 μ 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32a-acutobin00_14，加入到100μ1制備好的感受態(tài)細胞(大腸桿菌Rosetta2(DE3))中，涂LB平板(含lOOPg/ml氨芐青霉素)，37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取在抗性平板上生長的陽性克隆子接入2ml LB培養(yǎng)基中(含lOOPg/ml氨芐青霉素)，37°C 250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1%轉(zhuǎn)接至50ml LB培養(yǎng)液中(含10(^g/mlAmp)培養(yǎng) I. 5-2h 至 OD6qq=L 0，加入 IPTG 誘導(終濃度為 lmmol/ml )，30°C 250rpm 再振蕩培養(yǎng)3-3. 5h。取培養(yǎng)液IOOOOrpm離心IOmin,收集菌體,再加入等體積的無菌水重新懸浮菌體，12000rpm離心lOmin,取沉淀用1/5體積pH7. O, 20mM的PBS懸浮菌體,進行超聲波破碎，得到破碎液，破碎條件為60%功率,破碎2s間隔Is,歷時60min。12000rpm離心，收集上清液分析表達產(chǎn)物的活力，并通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達量，結(jié)果表明acutobinOO-14基因所編碼的蛋白可在大腸桿菌中表達，且有一定的類凝血酶活性。(圖5)實施例3重組蛇毒類凝血酶的純化
將實施例2所制備的破碎液經(jīng)IOOOOrpm離心30min去除菌體，取上清液作為粗酶液，將粗酶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至20%，12000rpm離心30min，取沉淀，用緩沖液(Tris-HCl，pH7. 5,20mM)重新溶解。將以上溶解后的樣品，經(jīng)12000rpm離心15min，取上清液用陰離子交換色譜DEAE650M (Φ 1. 6 X IOOcm)分離，先用20mM PBS緩沖液ρΗ7· 5平衡柱子，然后上樣，再分別用含有O. 1Μ、0. 2Μ、0. 3Μ、0. 5Μ的NaCl洗脫，流速均為O. 5 ml/min，樣品用部分收集器收集。最后對收集樣品測定體外類凝血酶活力，及SDS-PAGE電泳分析。取上述的目的蛋白峰樣品，用鎳柱親和層析純化。首先用O. 1M NiSO4緩沖液沖洗柱子10個床體積以上活化鎳柱，然后用20mM pH8. 0,0. 5M NaCl的PBS緩沖液平衡柱子，然后樣品上樣，再用平衡緩沖液沖平，流速為O. 5ml/min。待沖平后，再用相同緩沖液配置的10mM、20 mM、30 mM、50 mM咪唑梯度洗脫，樣液用部分收集器收集，測定體外類凝血酶活性，及SDS-PAGE電泳分析。SDS-PAGE結(jié)果(圖6)表明，重組蛇毒類凝血酶經(jīng)純化后，已達到電泳純，其分子量約為44. 3kDa。體外類凝血酶活性從粗酶液的O. 07U/mg提高到純酶的I. 74U/mg，純化倍數(shù)為24. 86倍。
實施例4重組蛇毒類凝血酶的活力檢測
將實施例3中得到的純化蛋白稀釋至質(zhì)量濃度為lmg/mL，取該稀釋后的產(chǎn)物1ΟΟμΙ，加入到500μ1含濃度為9mg/mL牛纖維蛋白原的Tris-HCl (20mmol/L,pH7.O)中37°C孵育lh，觀察凝結(jié)現(xiàn)象，并以純水代替目標蛋白作為對照組。結(jié)果(圖7)表明，經(jīng)純化后的重組類凝血酶對纖維蛋白酶具有特異性，在體外降解纖維蛋白原，形成首位相連的聚合物，使得反應體系出現(xiàn)渾濁、沉淀，具有明顯酶學活性，最終達到纖維蛋白原體外凝結(jié)。
權(quán)利要求
1.一種類凝血酶基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種類凝血酶基因，其特征在于所述類凝血酶基因的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種類凝血酶基因，其特征在于所述的類凝血酶基因來源于尖吻蝮蛇，具有凝血酶相似性質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種類凝血酶基因，其特征在于所述類凝血酶基因經(jīng)以下步驟獲得 (1)、從蛇毒腺中分離提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用PCR擴增；擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并回收凝膠中的目標基因； (2)、將步驟(I)所得目標基因進行DNA序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行分析比對，最終確定類凝血酶基因。
5.一種類凝血酶基因重組載體，其特征在于將含有如權(quán)利要求I所述的類凝血酶基因克隆到pET-32a載體中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種類凝血酶基因重組載體，其特征在于所述的pET-32a載體含有硫還原蛋白融合表達體系、His標簽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種類凝血酶基因重組載體，其特征在于所述His標簽下游與多克隆位點間存在一個腸激酶酶切位點。
8.—種如權(quán)利要求5所述的類凝血酶基因重組載體的應用，其特征在于將所述重組載體導入大腸桿菌，得到含有類凝血酶基因重組載體的大腸桿菌細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的類凝血酶基因重組載體的應用，其特征在于培養(yǎng)所述的含有類凝血酶基因重組載體的大腸桿菌細胞，通過發(fā)酵誘導其表達，產(chǎn)生類凝血酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的類凝血酶基因重組載體的應用，其特征在于所述的類凝血酶經(jīng)過硫酸銨沉降，離子交換層析和親和層析純化，得到純酶形式的類凝血酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的類凝血酶基因重組載體的應用，其特征在于所述的純酶形式的類凝血酶包含硫還原蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種尖吻蝮蛇來源的類凝血酶基因及其應用，其目的是提供一種能在大腸桿菌中高效表達該類凝血酶的方法。本發(fā)明所提供的類凝血酶基因的核苷酸序列如SEQNO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQNO.2所示；將所述的類凝血酶基因克隆到pET-32a載體上，得到的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta2(DE3)中誘導表達該類凝血酶。本發(fā)明制備出能夠高效表達該類凝血酶基因的重組生產(chǎn)株，實現(xiàn)類凝血酶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/57GK102851303SQ20121035753
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者劉樹滔, 程欲, 饒平凡, 李仁寬, 郭春騰 申請人:福州大學