專利名稱：：用于在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生具有至少四個雙鍵的多不飽和C₂₀和C₂₂脂肪酸的方法用于在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生具有至少四個雙鍵的多不飽和C20-和Cm-脂肪酸的方法發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于通過將核酸導入植物而在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法，其中所述的核酸編碼具有A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或0)3-去飽和酶活性的多肽。這些去飽和酶和延長酶有利地f;f生自大豆疫霉(Phytophthorasoj狄》本發(fā)明還涉及核酸序列、核酸構(gòu)建體、包含本發(fā)明核酸序列的栽體和生物、包含核酸序列和/或核酸構(gòu)建體的載體，并且涉及包含上述的梭^列、核酸構(gòu)建體和/或栽體的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的又一部分涉及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸組合物及它們的用途。脂肪酸和三酰甘油酯具有在食品工業(yè)、動物營養(yǎng)、化妝品及藥理學領(lǐng)域內(nèi)的多種應用。根據(jù)它們是否為游離的飽和或不飽和脂肪酸或具有提高含量的飽和或不飽和脂肪酸的三酰甘油酯，它們適合完全不同的應用.多不飽和脂肪酸例如亞油酸和亞麻酸對哺乳動物是必需的，因為多不飽和脂肪酸不能由哺乳動物產(chǎn)生。多不飽和oj3-脂肪酸和w6-脂肪酸因而是動物和人類營養(yǎng)內(nèi)重要的構(gòu)成要素。多不飽和長鏈"3-脂肪酸例如二十碳五烯酸(=EPA，C20:5A5，8，11，14，17)或二十二碳六烯酸(-DHA，C22:6"，7，1。，13，16，19^其在健康方面(包括兒童腦發(fā)育、眼的功能性、激素和其它信號物質(zhì)的合成以及預防心血管疾病、癌癥和糖尿病)的多種功能而作為人類營養(yǎng)的重要成分(Poulos，ALipids30:1-14，1995;Horrocks，LA和YeoYKPharmacolRes40:211-225,1999)。這是為什么需要產(chǎn)生多不飽和長鏈脂肪酸的原因。鑒于目前人類食物的組成，將優(yōu)勢存在于魚油內(nèi)的多不飽和w3-脂肪酸添加至食物內(nèi)是非常重要的。因此，例如將多不飽和脂肪酸如二十二碳六烯酸(-DHA，〔22:6"，7，1°，13，16，19)或二十碳五締酸(=EPA，C20:5A5，8，11，14，17)添加至嬰兒配方奶粉內(nèi)來改善營養(yǎng)價值。據(jù)稱不飽和脂肪酸DHA對腦功能的發(fā)育和維持有積極影響。在下文中，將多不飽和脂肪酸稱作PUFA或LCPUFA(Eoly叢nsaturatedfatty且cids，PUFA,long￡haingolyunsaturated〖attygcids,LCPUFA)。多種脂肪酸和甘油三酯主要從^t生物如被孢霉(Mortierella)和裂殖壺菌(Schizochytrium)中獲得或從產(chǎn)油植物如大豆、歐洲油菜、藻類如隱甲藻(Crypthecodinium)或褐指藻(Phaeodactyhim)和其它藻類中獲得，其中它們通常以其三酰甘油酯(=甘油三酯=三酰甘油)形式獲得。然而它們也可以從動物例如魚中獲得。游離脂肪酸有利地通過水解制備。極長鏈多不飽和脂肪酸，例如DHA、EPA、花生四烯酸(=ARA,C20:4A5，8，"，14)、二高7國亞麻酸(C20:3A8'n，")或二十二碳五烯酸(DPA，022:5"，1()，13，16，19)不能在油料植物例如歐洲油菜、大豆、向日葵或紅花內(nèi)合成。這些脂肪酸的常見天然來源是魚如緋魚、鮭魚、沙丁魚、紅魚、鰻鱺、鯉魚、縛魚、大比目魚、鯖魚、梭妒或鮪魚，或藻。取決于預期用途，優(yōu)選具有飽和或不飽和脂防脧的油。例如在人類營養(yǎng)中，優(yōu)選具有不飽和脂肪酸，尤其是具有多不炮和脂肪酸的脂，據(jù)稱多不飽和oj3-脂肪酸對血液中的膽固醇水平有積極影響并且因此有可能預防心臟病。心臟病、中風或高血壓的風險可以通過添加這些co3-脂肪酸至食物內(nèi)得以顯著降低。此外，co3-脂肪酸對與免疫性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的炎性過程、尤其對慢性炎性過程有積極影響.因而，它們被添加至食品，尤其食療性食品內(nèi)，或應用于藥物內(nèi)。w6-脂肪酸如花生四烯酸總是因我們的日常飲食^A而對與這些風濕性疾病相關(guān)的那些功能紊亂有不利影響。co3和co6-脂肪酸是稱作類二十烷酸的組織激素如前列腺素(自二高-7亞麻酸、花生四烯酸及二十碳五烯酸衍生)的前體并且是血栓烷和白三烯(自花生四烯酸及二十碳五烯酸衍生)的前體。形成自w6-脂肪酸的類二十烷酸(稱作PG2系列)通常促進炎性反應，而來自w3-脂肪酸的類二十烷酸(稱作PG3系列)具有很少或沒有促炎效應。鑒于多不飽和脂肪酸的有益特征，過去從未停止嘗試獲得參與合成這些脂肪酸或甘油三酯的基因，以便在多種生物中產(chǎn)生具有改良含量的不飽和脂肪酸的油。因而WO91/13972及其美國等效物描述了A9-去飽和酶。WO93/11245要求專利保護A15-去飽和酶并且WO94/11516要求專利保護A12-去飽和酶。而且其它去飽和酶在例如EP-A-0550162、WO94/18337、WO97/30582、WO97/21340、WO95/18222、EP國A隱0794250、Stukey等，J.Biol.Chem.，265,1990:20144-20149、Wada等，Nature347，19卯200-203或Huang等，Lipids34，1999:649-659中進行描述。然而對多種去飽和酶的生物化學表征迄今仍是不充分的，因為作為膜結(jié)合蛋白的這些酶嚴重妨礙對它們進行分離并表征(McKeon等，MethodsinEnzymol.71，1981:12141-12147，Wang等，PlantPhysiol.Biochem.，26，1988:777-792)。原則上，膜結(jié)合的去飽和酶通過導入合適的生物內(nèi)表征，隨后通過分析原材料和產(chǎn)物對合適生物酶的活性進行分析。A6-去飽和酶描述于WO93/06712、US5,614,393、US5,614,393、WO96/21022、WO00/21557和WO99/27111并且用于轉(zhuǎn)基因生物內(nèi)生產(chǎn)的應用描述于WO98/46763、WO98/46764和WO98/46765。在本上下文中，多種去飽和酶的表達及多不飽和脂肪酸的形成也描迷于WO99/64616或WO98/46776內(nèi)并要求專利保護.就去飽和酶的表達效率及其對形成多不飽和脂肪酸的影響而言，必須指出表達如所述的單個去飽和酶迄今僅產(chǎn)生低含量的不飽和脂肪^/脂類，如>亞麻酸及十八碳四烯酸。此外，通常得到co3-脂肪酸與w6-脂肪酸的混合物。過去已對獲取延長酶基因進行過大量嘗試。Millar與Kunst，1997(PlantJournal12:121畫131)和Millar等1999，(PlantCell11:825-838)描述來自植物的用于合成單不飽和長鏈脂肪酸(C22:1)及用于合成極長鏈脂肪酸(C『C32)(以便在植物中產(chǎn)生蠟)的延長酶的特征。關(guān)于花生四烯酸和EPA合成的描述可在例如WO0159128、WO001272t)、WO02077213和WO0208401內(nèi)找到。多不飽和C24-脂肪酸的合成例如描迷于Tvrdik等，2000，JCB149:707-717或WO0244320。特別適合用于產(chǎn)生PUFA的微生物是微藻，如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、Porphiridi腿物種、破嚢壺菌屬(Thraustochytrium)物種、裂殖壺菌屬(Schizochytrium)種或隱甲藻屬(Crypthecodmium)物種、纖毛蟲例如棘尾蟲屬(Stylonychia)或豆形蟲屬(Colpidium)、真菌如被孢霉、蟲霉(Entomophthora)和毛霉(Mucor)和/或蘚如劍葉蘚屬(Physcomitrella)、角齒蘚屬(Ceratodon)及地錢屬(Marchantia)(R.Vazhappilly和F.Chen(1998)BotanicaMarina41:553-558;K.Totani和K.Oba(1987)Lipids22:1060-1062;M，Akimoto等，(1998)Appl.BiochemistryandBiotechnology73:269-278)。抹系選擇已經(jīng)引起開發(fā)大量的所討論孩i生物突變林，這些突變林產(chǎn)生一系列所需要的化合物，包括PUFA。然而突變和選擇可改善特殊分子如多不飽和脂肪酸產(chǎn)生的林系是費時和困難的過程。這是為什么只要可能就優(yōu)選如上所述的重組方法的原因。然而借助以上提及的微生物，僅可以產(chǎn)生有限量的所需多不飽和脂肪酸如DPA、EPA或ARA，并且取決于所用的微生物，這些多不飽和脂肪酸通常作為例如EPA、DPA及ARA的脂肪酸混合物得到。將討論多種用于合成花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的合成途徑(圖1)。因此，EPA或DHA通過聚酮化合物途徑在海洋細菌如弧菌(Vibriosp.)或希瓦氏菌(Shewanellasp.)內(nèi)產(chǎn)生(Yu，R.等，Lipids35:1061-1064,2000;Takeyama，H.等，Microbiology143:2725-2731,1997)。替代性策略是改變?nèi)ワ柡兔负脱娱L酶的活性(Zank，T.K.等，PlantJournal31:255-268，2002;Sakuradani，E.等，Gene238:445-453，1999)。通itA6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶和A4-去飽和酶對上述途徑的修改是哺乳動物內(nèi)的Sprecher途徑(Sprecher2000，Biochim.Bi叩hys.Acta1486:219-231)。在其中，實施又一個延長步驟替代A4去飽和作用以產(chǎn)生C24，隨后通過又一個A6-去飽作用及最終的j8-氧化作用產(chǎn)生<:22鏈長度。稱作Sprecher的途徑(見圖l)并不適于在植物和微生物中的生產(chǎn)，因調(diào)節(jié)機制未知。如從圖l可以看出，較長鏈的多不飽和脂肪酸如生四烯酸、EPA或特別是DHA(C22:6n-3)的產(chǎn)生除需要去飽和酶之外，還需要使例如在A-9、A-6或A-5位置內(nèi)具有雙鍵的不飽和脂肪酸延長至少2個碳原子的延長酶。根據(jù)其功能，區(qū)分兩種不同類型的延長酶。廣泛分布于動物界內(nèi)的I型延長酶僅有非常低的底物專一性，也就是說它們延長一系列不同的不飽和脂肪酸。n型延長酶的區(qū)別在于具有高得多的底物專一性。它們僅轉(zhuǎn)化在特定位置內(nèi)具有雙鍵的少數(shù)脂肪酸。WO2005/012316描述了一些上述去飽和酶和延長酶。具體而言，WO2005/012316首次公開了專一性地延長在A-5位置內(nèi)具有雙鍵的脂肪酸的n型延長酶。根據(jù)去飽和模式，這類多不飽和脂肪酸分成兩大類，即w6"脂肪酸或co3-脂肪酸，這些脂肪酸在代謝和功能性活性方面有所差異(圖1)。用于代謝途徑的原材料是亞油酸(18:2"，12)，而"3途徑經(jīng)亞麻酸(18:3^9，12'15)進行。亞麻酸通過w3-去飽和酶的活性形成(Tocher等，1998,Prog.LipidRes.37，73-117;Domergue等2002,Eur.J.Biochem.269，4105-4113).哺乳動物以及還有人類不具備相應的去飽和酶活性(A12-去飽和酶和w3-去飽和酶)并且必須通過食物攝入這些脂肪酸(必需脂肪酸).從這些前體開始，依次通過去飽和酶反應和延長酶反應合成生理重要的多不飽和脂肪酸花生四烯酸(ARA，20:4As，s，"，")(w6-脂肪酸)及兩種co3-脂肪酸即二十碳五烯酸(EPA，20:5A5，8，""4，")和二十二碳六烯酸(DHA，22:6A4'7，1。，13，17，19)。"3-月旨肪酸的應用在治療心血管疾病(Shimikawa2001，WorldRev.Nutr.Diet.88,100-108)、炎癥(Calder2002，Proc.Nutr.Soc.61，345畫358)和關(guān)節(jié)炎(Cleland和James2000,J.Rheumatol.27，2305-2307)中顯示出如上所述的治療活性，高等植物包含多不飽和脂肪酸如亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3).ARA、EPA和DHA在全部高等植物的籽油中根本找不到或僅微量存在(E.Ucciani:NouveauDictionnairedesHuilesV6g6tales[NewDictionaryofVegetableoils!.Technique&Documentation-Lavoisier,1995.ISBN:2-7430-0009-0)。然而LCPUFA在高等植物、優(yōu)選地在油料作物例如歐洲油菜、亞麻、向日葵和大豆中產(chǎn)生是有利的，因為有可能以如此方式經(jīng)濟地獲得用于食品工業(yè)、動物營養(yǎng)和藥用目的大量高品質(zhì)的LCPUFA。為此，通過重組方法將編碼LCPUFA生物合成中酶的基因?qū)胗土献魑锊⑶乙蚨谄渲斜磉_這些基因是有利的。WO2005/012316描述了此種方法。然而，WO2005/012316中所述途徑的缺點是所需脂肪酸的產(chǎn)率仍然太低，以致不能進行工業(yè)利用。此夕卜，不僅產(chǎn)生了所需要的脂肪酸如ARA、EPA或DHA，而且不需要的次級反應也產(chǎn)生了進一步降低產(chǎn)率并污染已形成產(chǎn)物的脂肪酸。因而，用于產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的有利方法應當盡可能本身綜合如下特點用于產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的去飽和酶和延長酶的高度專一性，所用去飽和酶和延長酶的高合成率，如果可能，^f5L合成一種多不飽和脂肪酸如ARA、EPA或DHA，多不飽和脂肪酸如ARA、EPA或DHA或其混合物的高產(chǎn)量，不想要的次級產(chǎn)物(如果存在)的量可能最少，不產(chǎn)生非天然脂肪酸，即天然不存在的脂肪酸，有利地僅以甘油三酯方式合成多不飽和脂肪酸。為了實現(xiàn)用這類多不飽和脂肪酸強化食物和/或飼料，因而存在對用于產(chǎn)生尤其在真核細胞系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生這類多不飽和脂肪酸的簡單、廉價方法的迫切需要。因而，本發(fā)明的目的是開發(fā)盡可能具有上述有利特點的簡單、價廉方法。本目標通過本發(fā)明用于在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)產(chǎn)生具有至少四個雙鍵的多不飽和C20-或C22-脂肪酸的方法來實現(xiàn)，其中所述脂肪酸的含量以重量計占轉(zhuǎn)基因植物甘油三酯總含量的至少15%，所述的方法包括如下方法步驟a)將包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶和A5-去飽和酶的核酸序列的核酸構(gòu)建體導入轉(zhuǎn)基因植物，或b)將包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A12-去飽和酶和3-去飽和酶的核酸序列的核酸構(gòu)建體導入轉(zhuǎn)基因植物，或c)將包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶和A4-去飽和酶的核酸序列的核酸構(gòu)建體導入轉(zhuǎn)基因植物，或d)將包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和m3-去飽和酶的核酸序列的核酸構(gòu)建體導入轉(zhuǎn)基因植物，和e)得到來自該植物的油和脂。在本發(fā)明方法中產(chǎn)生的C加-和<:22-多不飽和脂肪酸有利地包舍至少四個、五個或六個雙鍵。這些脂肪酸特別有利地包含五個或六個雙鍵。飽和脂肪酸通過本方法中所用核酸有利地微小程度轉(zhuǎn)化，或根本不轉(zhuǎn)化。將微小程度應當理解為與多不飽和脂肪酸相比，飽和脂肪酸以少于5%的活性、有利地以少于3%、特別有利地以少于2%、極特別優(yōu)選地以少于l、0.5、0.25或0.125%的活性進行反應。這些已經(jīng)產(chǎn)生的脂肪酸可以在本方法中作為單獨產(chǎn)物產(chǎn)生或存在于脂肪酸混合物內(nèi)。用于本發(fā)明方法中的核酸序列是編碼具有A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5國去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或o3-去炮和酶活性的多肽的分離核酸。有利地用于本發(fā)明方法中的核酸序列是編碼具有A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或3-去飽和酶活性的多肽的核^f列，其選自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25。本方法中產(chǎn)生的具有至少4個雙鍵的多不飽和C20-或C22-脂肪酸特別有利地是花生四烯酸(-ARA)、二十碳五烯酸(=EPA)或二十二碳六烯酸(=DHA)。在本方法的有利實施方案中，具有至少4個雙鍵的多不飽和C2o-或Q2-脂肪^A花生四烯酸。在另一個有利的實施方案，所產(chǎn)生的具有至少4個雙鍵的多不飽和C2。-或C22-脂肪酸是二十碳五蜂酸或二十二碳六烯酸或其混合物。還可以通過本發(fā)明方法產(chǎn)生ARA、EPA和DHA的混合物。有利地，基于甘油三酯總含量，在本發(fā)明方法中于轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)產(chǎn)生含量以重量計至少15、16、17、18、19或20%、優(yōu)逸地是25、30、35或40%、特別優(yōu)選地是45、50、55或60%的花生四烯酸或二十碳五烯酸。在本方法另一個有利的實施方案中，基于甘油三酯總含量，在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)產(chǎn)生具有含量以重量計至少4、5或6%、有利地具有7、8、9或10%的二十二碳六烯酸。特別有利的是在本發(fā)明方法中，基于甘油三酯的總脂肪酸含量，在甘油三酯中應當存在以重量計低于0.5、0.4、0.3、0.2或0.1%、有利地低于0.09、0.08、0.07、0.06或0.05%、特別有利地低于0.04、0.03、0.02或0.01%的選自C22:4A7，10，13，16-、C22:5A4，"W"6-或C22:5A"o'叫6"-脂肪酸的多不飽和脂肪酸。本方法中所產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸有利地結(jié)合亍三酰甘油內(nèi)，但是還可以作為游離脂肪酸存在于生物內(nèi)或還結(jié)合于其它脂肪酸酯的形式內(nèi)。在本上下文中，它們可以作為"純產(chǎn)物，，存在或還有利地以多種脂肪酸的混合物或不同甘油酯的混合物的形式存在。本發(fā)明方法有利地產(chǎn)生具有如此的多不飽和C2。-和/或(:22-脂肪酸分子的脂肪酸酯，其中所述的多不飽和C,和/或C22-脂脈酸分子在脂肪酸酯內(nèi)具有至少4個雙鍵、有利地在脂肪酸酯內(nèi)具有至少5個或6個雙鍵。這產(chǎn)生co3-二十碳四烯酸(-ETA，C20:4A5，8，11，14)、花生四埽酸(ARA，C20:4As，8，11，14)、二十碳五烯酸(EPA，C20:5A5，8，n，14'17)、6-二十二碳五烯酸(C22:5A4，7，1。，13，16)、6-二十二碳四烯酸(C22:4"，m'13，16)、3-二十二碳五烯酸(-DPA，C22:5A7，10，13，16，19)、二十二碳六烯酸(=DHA，C22:6A4，7'10，13，16，19)或優(yōu)選地產(chǎn)生ARA、EPA和/或DHA的混合物.在本方法特別優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生ffl6-脂肪酸，有利地是花生四烯酸.在本方法又一個特別優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生3-脂肪酸，如EPA和/或DHA。如上所述，本發(fā)明方法特別有利地產(chǎn)生處于甘油三酯內(nèi)的選自6-二十二碳四烯酸C22:4A7，1。，13，16、co6-二十二碳五烯酸022:5"7'1()，13，16或(03-二十二碳五烯酸C22:5A^，"，"^的多不飽和脂肪酸，其含量以重量計低于甘油三酯的總脂肪酸含量的0.5%。具有多不飽和C2(r和/或C22-脂肪酸分子的脂肪酸酯可以以油或脂的形式分離，例如以化合物如鞘脂類、磷酸甘油酯、脂、糖脂例如糖鞘脂、磷脂例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或雙磷脂酰甘油、單酰甘油酯、二酰甘油酯、三酰甘油酯或者其它脂肪酸酯如乙酖輔酶A酯的形式，其中所述的脂肪酸酯包含來自用于制備該脂肪酸酯的生物的具有至少四個、五個或六個雙鍵，優(yōu)選是五個或六個雙鍵的多不飽和脂肪酸；這些脂肪酸酯優(yōu)選地以其二酰甘油酯、三酰甘油酯和/或以磷脂酰膽堿的形式，特別優(yōu)選地以三酰甘油酯形式分離。除了這些酯以外，多不飽和脂肪酸也可以作為游離脂肪酸或在其它化合物內(nèi)結(jié)合的脂肪酸存在于生物內(nèi)，有利*在于植物內(nèi)。通常上述多種化合物(脂肪酸酯和游離脂肪酸)以如下的大致分布存在于生物內(nèi)，即以多種化合物的重量總計為100%，甘油三酯占80至90%、甘油二酯占2至5%、甘油一酯占5至10%、游離脂肪酸占1至5°/。、磷脂占2至8%。本發(fā)明方法產(chǎn)生LCPUFA，例如以轉(zhuǎn)基因生物內(nèi)、有利地在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的總脂肪酸為基礎(chǔ)，所產(chǎn)生的含量以重量計為至少15%、有利地是至少16或17%，優(yōu)選地是至少18，19或20%，特別優(yōu)選地是至少21、22、23、24或25%、最優(yōu)選地是至少26、27、28、29或30°/。的花生四烯酸和二十碳五烯酸.在本上下文中，將存在于宿主生物內(nèi)的d8-和/或C2Q-脂肪酸轉(zhuǎn)化達至少10%、優(yōu)選地是至少200/。、特別優(yōu)選地是至少30%、最優(yōu)選地是至少40。/。以產(chǎn)生相應產(chǎn)物如ARA、EPA和/或DHA是有利的。這些脂肪酸有利地以結(jié)合形式產(chǎn)生，借助本發(fā)明方法中所用的核酸，這些不飽和脂肪酸可以有利地定位于已產(chǎn)生甘油三酯的snl、sn2和/或sn3位置內(nèi)。由于通過本發(fā)明方法中的起始化合物亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)開展了多個反應步驟，故本方法的終產(chǎn)物例如花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳五烯酸(DHA)不能作為絕對純的產(chǎn)物獲得；微小痕量的前體總是存在于終產(chǎn)物內(nèi)。例如若亞油酸和亞麻酸兩者均存在于起始生物和起始植物內(nèi)，則終產(chǎn)物如ARA、EPA或DHA通常作為混合物存在。基于所討論終產(chǎn)物的量，前體亞油酸和/或亞麻酸應當有利地以重量計不超過20。/。、優(yōu)選地不超過15%、特別優(yōu)選地不超過10%，最優(yōu)選地不超過5%。僅ARA、ARA和EPA、EPA和DHA或者僅DHA(結(jié)合的或作為游離酸)有利地因本發(fā)明方法而在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)作為終產(chǎn)物產(chǎn)生.若同時產(chǎn)生化合物ARA、EPA和DHA,則它們有利地以至少1:1:2(EPA:ARA:DHA)、有利地是至少1:1:3、優(yōu)選地是1:1:4、特別優(yōu)選是1:1:5的比率產(chǎn)生。若在本方法中產(chǎn)生ARA和EPA，它們有利地以至少5:1到至少1:5的比率產(chǎn)生。若在本方法中產(chǎn)生EPA和DHA，它們有利地以至少5:1到至少1:5的比率產(chǎn)生.由本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含6至15%的棕櫚酸、1至6%的硬脂酸、7-85%的油酸、0.5至8%的11-十八碳烯酸、0.1至1%的花生酸、7至25%的飽和脂肪酸、8至85%的單不飽和脂肪酸和60至85%的多不飽和脂肪酸，在所有情況下均基于100°/。并且以生物的總脂肪酸含量為基礎(chǔ)，基于總脂肪酸含量，存在于脂肪酸酯或脂肪酸混合.物內(nèi)的有利的多不飽和脂肪酸優(yōu)選地是至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1%的花生四烯酸。此外，通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物有利地包含選自芥酸(13-二十二碳烯酸)、蘋婆酸(9，10-亞甲基十八碳-9-烯酸)、錦葵酸(8，9-亞甲基十七碳-8-烯酸)、大風子油酸(環(huán)戊烯十二烷酸)、呋喃脂肪酸(9，12-環(huán)氧十八碳-9,ll-二蜂酸)、斑鳩菊酸(9，10-環(huán)氧十^^-12-烯酸)、塔日酸(6-十^^炔酸)、6-十九碳炔脧、白檀子油酸(反ll誦十A^烯陽9-炔酸)、6，9-十/V^烯炔酸、pyrulicacid(反10-十七烯畫8誦炔酸)、crepenyninicacid(9沖八烯-12畫炔酸)、13，14-dihydrooropheicacid、十八碳-13-烯-9，ll-二炔酸、傘形花子油酸(順-6-十八烯酸)、9順，12反-十八二烯酸、金盞花素酸(8反10反12順-十八三烯酸)、梓樹酸(9反11反13順-十八三烯酸)、桐油酸(9順11反13反-十八三烯酸)、蘭花酸(8順10反12順-十八三烯酸)、石榴酸(9順11反13順-十八三烯酸)、parinaricacid(9順11反13反15順-十八四烯酸)、皮諾斂酸(全-順-5，9，12-十八三締酸)、laballenicacid(5，6-十八碳-二烯酸)、荒麻油酸(12-羥油酸)和/或coriolicacid(13-鞋-9順，ll反-十八二烯酸)的脂肪酸。通常上述脂肪酸有利地僅痕量地存在于本發(fā)明方法所產(chǎn)生的脂肪酸酯或脂肪酸混合物內(nèi)，這就是說，基于總脂肪酸，它們的存在小于30。/。、優(yōu)選地小于25%、24%、23%、22%或21%、特別優(yōu)選地低于20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%或5%，極其特別優(yōu)選地小于4%、3%、2%或1%。由本發(fā)明方法產(chǎn)生的月旨肪酸酯或脂肪酸混合物，有利地包含(基于總脂肪酸)小于0.1%的丁酸、膽固醇、鰷魚酸(=二十二碳五烯酸，C22:5A"""")和尼生酸(二十四碳六烯酸，C23:6"，8，12，15，21)或者不包含前述物質(zhì).因本發(fā)明核酸序列或本方法中所用的核酸序列，當通過GC分析進行比較時，與非轉(zhuǎn)基因植物如擬南芥(arabidopsis)或亞麻、歐洲油菜、大豆或亞麻薺(Camelina)相比可以實現(xiàn)多不飽和脂肪酸產(chǎn)量增加至少50%、有利地是至少80%、特別有利地是至少100%、極其有利地是至少150%?；瘜W純的多不飽和脂肪酸或脂肪酸組合物還可以通過上述的方法合成。為此目的，脂肪酸或脂肪酸組合物用已知方式如通過提取、蒸餾、結(jié)晶、色譜或這些方法的組合從植物中分離。這些化學純的多不飽和脂肪酸或脂肪酸組合物對于食品工業(yè)領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域并且特別對于制藥工業(yè)領(lǐng)域內(nèi)的應用是有利的。原則上，適合于本發(fā)明方法中生產(chǎn)的生物是全部植物。油料作物植物或有用植物有利地用于本方法中。合適的植物原則上是能夠合成脂肪酸的所有植物，如所有雙子葉植物或單子葉植物、藻類或蘚類.有利的植物選自植物Adelotheciaceae科、漆樹科(Anacardiaceae)、菊科(Asteraceae)、傘形科(Apiaceae)、樺木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、風梨科(Bromdiaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Ca加abaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、Crypthecodiniaceae科、葫,科(Cucurbitaceae)、牛毛蘚科(Ditrichaceae)、胡頹子科(Elaeagnaceae)、杜鵑花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、柩牛兒苗科(Geraniaceae)、禾本科(Gramineae)、胡^匕科(Juglandaceae)、摔科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亞麻科(Linaceae)、棵藻科(Euglenaceae)、綠枝藻綱(Prasinophyceae)或蔬菜植物或裝飾植物如萬壽菊(Tagete)?？梢蕴岬降膶嵗沁x自如下的植物Adelotheciaceae如劍葉蘚屬，例如小立碗蘚(Physcomitrellapaten)、漆樹科如黃連木屬(Pistacia)、芒果屬(Mangifera)、腰果屬(Anacardium)例如阿月混子屬(Pistaciavera)[阿月混子(pistachio)、芒果(Mangiferindica)[芒果(Mango)l或腰果(Anacardiumoccidentale)[腰果(Cashew)]、菊科如金盞花屬(Calendula)、紅藍花屬(Carthamus)、矢車菊屬(Centaurea)、菊苣屬(Cichorium)、菜薊屬(Cynara)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、Locusta屬、萬壽菊屬、纈草屬(Valeriana)例如金盞花(Calendulaofficinalis普通金盞花l)、紅花(Carthamustinctorius[紅花(safflower))、矢車菊(Centaureacyanus[矢車菊(cornflower)])、菊苣(Cichoriumintybus菊苣(chicory)])、洋薊(Cynarascolymus朝鮮薊(artichoke)])、向曰葵(Helianthusannus向日葵(sunflower)])、萵苣(Lactucasativa)、Lactucacrispa、宇(Lactucaesculenta)、LactucascariolaL.ssp.Sativa、LactucascariolaL.var.integrata、LactucascariolaL.var.integrifolia、萵苣romana亞種(Lactucasativasubsp.Romana)、Locustacommunis、萵苣翔草(Valerianalocusta[saladvegetables])、香葉萬壽菊(Tageteslucida)、萬壽菊(Tageteserecta)或細葉萬壽菊(Tagetestenuifolia)[非洲或法國萬壽菊(Marigold)]、傘形科，如胡蘿卜屬(Daucus)例如胡蘿卜(Daucuscarota[胡蘿卜(carrot)])、樺木科如榛屬(Corylus)例如歐洲衛(wèi)Corylusavellana)或土耳其榛(Coryluscolurna榛(hazelnut))、紫草科如玻璃苣屬(Borago)例如玻璃苣(Boragoofficinalis[玻璃苣(borage)])、十字花科如蕓苔屬(Brassica)、亞麻齊屬(Camelina)、Melanosinapis屬、白芥屬(Sinapis)、擬南芥屬(Arabadopsis)例如歐洲油菜(Brassicanapus)、蕪青屬某些種(Brassicarapassp.歐洲油菜(oilseedrape))、野歐白芥(Sinapisarvensis)、芥菜(Brassicajuncea)、芥菜原變種(Brassicajunceavar.juncea)、坡葉芥萊(Brassicajunceavar.crispifolia)、大葉齊萊(Brassicajunceavar.foliosa)、黑芥菜(Brassicanigra)、Brassicasinapioides、亞麻齊(Camelinasativa)、Melanosinapiscommunis芥菜(mustard)、甘藍(Brassicaoleracea[飼用甜菜(fodderbeet))或擬南芥(Arabid叩sisthaliana)、風梨科如鳳梨屬(Anana)、Bromelia屬(菠蘿(pineapple))例如鳳梨(Ananacomosus)、Ananasananas或Bromeliacomosa菠蘿(pineapple)、番木瓜科如番木瓜屬(Carica)例如番木瓜(Caricapapaya[番木瓜I)、大麻科如大麻屬(Cannabis)例如大麻(Cannabissativa[大麻(hemp)l)、旋花科如番薯屬(Ipomea)、旋花屬(Convolvulus)例如甘薯(Ipomoeabatatus)、提琴葉牽牛花(Ipomoeapandurata)、Convolvulusbatatas、Convolvulustiliaceus、Ipomoeafastigiata、Ipomoeatiliacea、三裂葉薯(Ipomoeatriloba)或Convolvuluspanduratus[甜薯(sweetpotato)、番薯(batate)、藜^d^甜菜屬(Beta)例如甜菜(Betavulgaris)、甜蘿卜(Betavulgarisvar.Altissima)、甜菜原變種(Betavulgarisvar.vulgaris)、沿海甜菜(Betamaritima)、Betavulgarisvar.perennis、Betavulgarisvar.conditiva或Betavulgarisvar.esculenta[糖用甜菜(sugarbeet)、Crypthecodiniaceae科如隱甲藻屬例如寇氏隱曱藻(Cryptecodiniumcohnii)、葫蘆科如南瓜屬(Cucurbita)例如夢瓜(Cucurbitamaxima)、灰子南瓜(Cucurbitamixta)、西葫蘆(Cucurbitapepo)或南瓜(Cucurbitamoschata[西葫聲(pumpkin)/南瓜(squash)])、橋彎藻科(Cymbellaceae)如雙眉藻屬(Amphora)、橋彎藻屬(Cymbella)、Okedenia屬、褐指藻屬(Phaeodactylum)、Reimeria屬例如三角褐指藻、牛毛蘚科(Ditrichaceae)如牛毛蘚屬(Ditrichaceae)、高地蘚屬(Astomiopsis)、角齒蘚屬、Chrysoblastella屬、牛毛蘚屬(Ditrichum)、對葉蘚屬(Distichium)、Eccremidium屬、Lophidion屬、Philibertiella屬、叢毛蘚屬(Pleuridium)、石縫蘚屬(Saelania)、毛齒蘚屬(Trichodon)、Skottsbergia屬例如Ceratodonantarcticus、Ceratodoncolumbiae、Ceratodonheterophyllus、Ceratodonpurpurascens、角齒蘚(Ceratodonpurpureus)、Ceratodonpurpureusssp.convolutus、Ceratodonpurpureusssp.stenocarpus、角齒蘚圓葉變種(Ceratodonpurpureusvar.rotundifolius)、Ceratodonratodon、疾蒴角齒蘚(Ceratodonstenocarpus)、Chrysoblastellachilensis、Ditrichumambiguum、短齒牛毛蘚(Ditrichumbrevisetum)、鈹波牛毛蘚(Ditrichumcrispatissimum)、巻葉牛毛蘚(Ditrichumdifficile)、Ditrichumfalcifolium、扭葉牛毛蘚(Ditrichumflexicaule)、Ditrichumgiganteum、牛毛蘚(Ditrichumheteromallum)、Ditrichumlineare、Ditrichumlineare、Ditrichummontanum、Ditrichummontamim、黃牛毛蘚(Ditrichumpallidum)、Ditrichumpunctulatum、細葉牛毛蘚(Ditrichumpusillum)、細葉牛毛蘚扭葉變種(Ditrichumpusillumvar.tortile)、Ditrichumrhynchostegium、Ditrichumschimperi、Ditrichumtortile、對葉蘚(Distichiumcapillaceum)、'卜對葉蘚(Distichiumhagenii)、斜蒴對葉蘚(Distichiuminclinatum)、Distichiummacounii、Eccremidiumfloridanum、Eccremidiumwhiteleggei、Lophidionstrictus、尖葉叢毛蘚(Pleuridiumacuminatum)、PIeuridJumalternifolium、Pleuridiumholdridgei、Pleuridiummexicanum、Pleuridiumravenelii、叢毛蘚(Pleuridiumsubulatum)、石縫蘚(Saelaniaglaucescens)、Trichodonborealis、毛齒蘚(Trichodoncylindricus)或Trichodoncylindricusvar.oblongus、胡夷頁子科如屬胡頹子屬(Elaeagnus)例如油^b^(01eaeuropaea橄欖(olive))、杜鵑花科如山月桂屬(Kalmia)例如闊葉山月桂(Kalmialatifolia)、窄葉山月桂(Kalmiaangustifolia)、小葉山月桂(Kalmiamicrophylla)、Kalmiapolifolia、Kalmiaoccidentalis、Cistuschamaerhodendros或Kalmialucida[山月桂(mountainIaurel)、大戟科如木薯屬(Manihot)、Janipha屬、麻風樹屬(Jatropha)、蓖麻屬(Rkinus)例如木薯(Manihotutilissima)、Janiphamanihot、Jatrophamanihot、Manihotaipil、Manihotdulcis、Manihotmanihot、Manihotmelanobasis、木薯(Manihotesculenta木薯(cassava))或蓖麻(Ricinuscommunis荒麻(CastorOilPlant)])、豆科如豌豆屬(Pisum)、合歡屬(Albizia)、Cathormion屬、Feuillea屬、音加屬(Inga)、Pithecolobium屬、金合歡屬(Acacia)、含羞草屬(Mimosa)、Medicajo屬、大豆屬(Glycine)、鐮扁豆屬(Dolichos)、菜豆屬(Phaseolus)例如豌豆(Pisumsativum)、飼料豌豆(Pisumarvense)、Pisumhumile[婉豆(pea)I、Albiziaberteriana、合歡(AIbiziajulibrissin)、闊莢合歡(Albizialebbeck)、Acaciaberteriana、Acacialittoralis、Albiziaberteriana、AIbizziaberteriana、Cathormionberteriana、FeuiHeaberteriana、Ingafragrans、Pithecellobiumberterianum、Pithecellobiumfragrans、Pithecolobiumberterianum、Pseudalbizziaberteriana、Acaciajulibrissin、Acacianemu、Albizianemu、Feuilleeajulibrissin、Mimosajulibrissin、Mimosaspeciosa、Sericanrdajulibrissin、Acacialebbeck、Acaciamacrophylla、闊莢合歡(Albizialebbeck)、Feuilleealebbeck、Mimosalebbeck、Mimosaspeciosa[闊葉合歡(siristree)、紫苜穩(wěn)(Medicagosativa)、野苜蓿(Medicagofalcata)、雜交苜蓿(Medicagovaria)[紫花苜蓿(alfalfa)、大豆(Glycinemax)、Dolichossoja、寬葉蔓豆(Glycinegracilis)、Glycinehispida、Phaseolusmax、Sojahispida或Sojamax[大豆(soybean)]、葫蘚科(Funariaceae)如Aphanorrhegma屬、Entosthodon屬、葫聲蘚屬(Funaria)、劍葉蘚屬(Physcomitrella)、立碗蘚屬(Physcomitrium)例如Aphanorrhegmaserratum、Entosthodonattenuatus、Entosthodonbolanderi、Entosthodonbonplandii、Entosthodoncalifornicus、Entosthodondrummondii、Entosthodonjamesonii、Entosthodonleibergii、Entosthodonneoscoticus、Entosthodonrubrisetus、Entosthodonspathulifolius、Entosthodontucsoni、Funariaamericana、Funariabolanderi、齒葉葫,蘚(Funariacalcarea)、Funariacalifornica、Funariacalvescens、Funariaconvoluta、Funariaflavicans、Funariagroutiana、葫蘆蘚(Funariahygrometrica)、Funariahygrometricavar.arctica、葫蘆蘚暖地變種(Funariahygrometricavar.Calvescens)、Funariahygrometricavar.convoluta、Funariahygrometricavar.muralis、Funariahygrometricavar.utahensis、小口葫聲蘚(Funariamicrostoma)*Funariamicrostomavar,obtusifolia、刺邊葫蘆蘚(Funariamuhlenbergii)、Funariaorcuttii、Funariaplano畫convexa、Funariapolaris、Funariaravenelii、Funariarubriseta、Funariaserrata、Funariasonorae、Funariasublimbatus、Funariatucsoni、Physcomitrellacalifornica、小立碗蘚、Physcomitrellareaderi、Physcomitriumaustrale、加利福尼亞立碗蘚(Physcomitriumcalifornicum)、Physcomitriumcollenchymatum、Physcomitriumcoloradense、Physcomitriumcupuliferum、Physcomitriumdrumniondii、紅蒴立碗蘚(Physcomitriumeurystomum)、Physcomitriumflexifolium、Physcomitriumhookeri、Physcomitriumhookerivar.serratum、隱蒴立碗蘚(Physcomitriumimmersum)、Physcomitriumkellermanii、Physcomitriummegalocarpum、梨蒴立碗蘚(Physcomitriumpyriforme)、Physcomitriumpyriformevar.serratum、Physcomitriumrufipes、Physcomitriumsandbergii、Physcomitriumsubsphaericum、華盛頓立碗蘚(Physcomitriumwashingtoniense)、繼牛兒苗科如天竺葵屬(Pelargonium)、椰子屬(Cocos)、Oleum屬例如椰子(Cocosnucifera)、茶蒸子天蘭葵(Pelargoniumgrossularioides)或Oleumcocois椰子coconut])、禾本科如甘蔗屬(Sacchar鵬)例如甘蔗(Saccharumofficinarum)、胡桃科如胡書&屬(Juglans)、Wallia屬例如核桃(Juglansregia)、臺灣胡杉&(Juglansailanthifolia)、山核桃(Juglanssieboldiana)、灰核杉匕(Juglanscinerea)、Walliacinerea、Juglansbixbyi、加州黑核杉匕(Juglanscalifornica)、印度黑核杉&(Juglanshindsii)、Juglansintermedia、Juglansjamaicensis、大核桃(Juglansmajor)、小果黑核(Juglansmicrocarpa)、黑核書匕(Juglansnigra)或胡杉匕Wallianigra胡書匕(walnut)、樟科如鱷梨屬(Persea)、月桂屬(Laurus)例如月桂(Laurusnobilis)月桂(bay)]、絝梨(Perseaamericana)、食物聘梨(Perseagratissima)或Perseapersea轉(zhuǎn)梨(avocado)]、豆科如落花生屬(Arachis)例如花生(Arachishypogaea)I花生(peanut)、亞麻科如Adenolinum屬例如亞麻(Linumusitatissimum)、Linumhumile、奧地利亞麻(Linumaustriacum)、Linumbienne、窄葉亞麻(Linumangustifolium)、筠亞麻(Linumcatharticum)、金黃亞麻(Linumflavum)、大花亞麻(Linumgrandiflorum)、Adenolinumgrandiflorum、劉易斯亞麻(Linumlewisii)、那旁亞麻(Linumnarbonense)、宿根亞麻(Linumperenne)、Linumperennevar.lewisii、Linumpratense或Linumtrigynum亞麻籽(linseed)、千屈菜科(Lythrarieae)如石榴屬(Punica)例如石榴(Punicagranatum)[石榴(pomegranate)]、4帛葵科(Malvaceae)如棉屬(Gossypium)例如陸地棉(Gossypiumhirsutum)、樹棉(Gossypiumarboreum)、海島棉(Gossypiumbarbadense)、草沖帛(Gossypiumherbaceum)或瑟伯氏4帛(Gossypiumthurberi)[棉花(cotton)、地錢科(Marchantiaceae)如地錢屬(Marchantia)食J:ft口Marchantiaberteroana、Marchantiafoliacea、Marchantiamacropora、芭蕉科(Musaceae)如芭蕉屬(Musa)例如香蕉(Musanana)、小果野蕉(Musaacuminata),粉芭蕉(Musaparadisiaca)、芭蕉屬的某些種(Musaspp.)[香蕉(banana)、柳葉菜科(Onagraceae)如Camissonia屬、月見草屬(Oenothera)例如Oenotherabiennis或Camissoniabrevipes[月見草(eveningprimrose)]、棕櫚科(Palmae)如油棕屬(Elaeis)例如油棕(Elaeisguineensis)油棕櫚樹(oilplam)、罌粟科(Papaveraceae)如罌粟屬(Papaver)例如鬼婆粟(Papaverorientale)、虞美人(Papaverrhoeas)、Papaverdubium罌粟(poppy)I、胡麻科(PedaHaceae)如胡麻屬(Sesamum)例如胡麻(Sesamumindicum)[^J^(sesame)、胡椒科(Piperaceae)如胡椒屬(Piper)、Artanthe屬、草胡椒屬(Peperomia)、Steffensia屬例如Piperaduncum、Piperamalago、狹葉胡椒(Piperangustifolium)、奧勒圖樹胡椒(Piperauritum)、萎葉(Piperbetel)、蓽澄茄(Pipercubeba)、長胡椒(Piperlongum)、胡椒(Pipernigrum)、假蓽拔(Piperretrofractum)、Artantheadunca、Artanthedongata、Peperomiaelongata、Piperelongatum、Steffensiaelongata辣椒(Cayennepepper)、禾本科(Poaceae)如大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、燕麥屬(Avena)、高梁屬(Sorghum)、須芒草屬(Andropogon)、絨毛草屬(Holcus)、黍?qū)?Panicum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍?qū)?Zea(maize))、小麥屬(Triticum)例如大麥(Hordeumvulgare)、芒穎大麥草(Hordeumjubatum)、海濱大麥(Hordeummurinum)、野芒大麥草(Hordeumsecalinum)、二棱大麥(Hordeumdistichon)、Hordeumaegiceras、六棱大麥(Hordeumhexastichon)、Hordeumhexastichum、Hordeumirregulare、大麥(Hordeumsativum)、野芒大麥草(Hordeumsecalinum)大麥(barley)、黑麥(Secalecereale)黑麥(rye)、燕麥(Avenasativa)、野燕麥(Avenafatua)、比贊燕麥(Avenabyzantina)、野燕麥原變種(Avenafatuavar.sativa)、雜種燕麥(Avenahybrida)[燕麥(oat)、兩色蜀黍(Sorghumbicolor)、石茅高梁(Sorghumhalepense)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、蜀黍(Sorghumvulgare)、Andropogondmm咖iidii、Holcusbicolor、Holcussorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghumarundinaceum、卡佛爾高梁(Sorghumcaffrorum)、垂穗高梁草(Sorghumcernuum)、Sorghumdochna、Sorghumdrummondii、硬高梁草(Sorghumdurra)、Sorghumguineense、Sorghumlanceolatum、多脈高梁草(Sorghumnervosum)、甜高梁(Sorghumsaccharatum)、Sorghumsubglabrescens、Sorghumverticilliflorum、蜀黍(Sorghumvulgare)、石茅高梁(Holcushalepensis)、Sorghummiliaceum、Panicummilitaceum[稷(millet)、稻(Oryzasativa)、闊葉野生稻(Oryzalatifolia)[稻(rice)、玉蜀黍(Zeamays)[玉米(maize)]、普通小麥(Triticumaestivum)、多更粒小麥(Triticumdurum)、圓柱小麥(Triticumturgidum)、Triticumhybernum、瑪卡小麥(Triticummacha)、普通小麥(Triticumsativum或Triticumvulgare)[小麥(wheat)、紫球藻科(Porphyridiaceae)如Chroothece屬、Flintiella屬、Petrovanella屬、紫球藻屬(Poiphyridium)、Rhodella屬、Rhodosorus屬、Vanhoeffenia屬例如紫球藻(Porphyridiumcrue幽m)、山龍眼科(Proteaceae)如澳洲堅果屬(Macadamia)例如全緣葉澳洲堅果(Macadamiaintergrifolia)澳大利亞堅果(macadamia)、綠4支藻綱如腎藻屬(Nephroselmis)、Prasinococcus屬、Scherffelia屬、Tetraselmis屬、Mantonidla屬、Ostreococcus屬例如綠腎藻(Nephroselmisolivacea)、Prasinococcuscapsulatus、Scherffeliadubia、Tetraselmischui、四肩突四鞭藻(Tetraselmissuecica)、Mantoniellasquamata、Ostreococcustauri屬和種、萏草科(Rubiaceae)如咖啡屬(Coffea)例如咖啡屬某些種(Coffeaspp)、小果粒咖啡(Coffeaarabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)或大果咖啡(Coffealiberica)[咖啡(coffee)、玄參科(Scrophulariaceae)如毛蕊花屬(Verbascum)例如毛瓣毛蕊花(Verbascumblattaria)、東方毛蕊花(Verbascumchaixii)、Verbascumdensiflorum、Verbascumlagurus、Verbascumlongifolium、剪秋羅毛蔬花(Verbascumlychnitis)、Verbascumnigrum、奧林匹克毛蔬花(Verbascumolympicum)、Verbascumphlomoides、紫毛蔬花(Verbascumphoenicum)、Verbascumpulverulentum或毛蔬花(Verbascumthapsus)[毛蕩花(verbascum)、癡科(Solanaceae):ft口辣椒屬(Capsicum)、煙草屬(Nicotiana)、癡屬(Solanum)、番莊屬(Lycopersicon)例如辣椒(Capsicumannuum)、辣椒glabriusculum變種(Capsicumannuumvar.glabriusculum)、小米辣(Capsicumfrutescens)[胡椒(pepper)、辣椒(Capsicumannuum)[紅辣椒(paprika)、煙草(Nicotianatabacum)、花煙草(Nicotianaalata)、Nicotianaattenuata、光煙草(Nicotianaglauca)、Nicotianalangsdorffii、Nicotianaobtusifolia、Nicotianaquadrivalvis、波葉煙草(Nicotianarepanda)、黃花煙草(Nicotianarustica)、林生煙草(Nicotianasylvestris)[煙草(tobacco)、馬鈴薯(SoIanumtuberosum[馬鈴薯(potato)I)、癡(Solanummelongena)[蒜(eggplant)l、番癡(Lycopersiconesculentum)、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersiconpyriforme、紅茶(SoIanumintegrifolium)或番茶(Solanumlycopersicum)[西紅神(tomato)]、梧桐科(Sterculiaceae)如可可樹屬(Theobroma)例如可可樹(Theobromacacao)[可可(cacao)或山茶科(Theaceae)如山茶屬(Camellia)例如茶(Camelliasinensis)[tea(茶)。在本發(fā)明方法中應用轉(zhuǎn)基因植物如雙子葉植物或單子葉植物。在本發(fā)明方法中特別有利地進行利用的轉(zhuǎn)基因植物是包舍大量脂化合物的油料作物植物，如花生、歐洲油菜、油菜(canola)、向日葵、紅花(Carthamustinctoria)、翼粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄欖、芝麻、金盞花、石榴、月見草、毛蕊花、薊(thistle)、野玫瑰(wHdroses)、榛、扁桃(almond)、澳洲堅果、鱘梨、月桂、西葫蘆/南瓜、亞麻、大豆、阿月混子、玻璃苣、樹(油棕、椰子或核桃)或耕作作物例如玉米、小麥、黑麥、燕麥、小黑麥(triticale)、稻、大麥、棉、木薯、胡椒、萬壽菊、茄科植物例如馬鈴薯、煙草、茄子和番茄、蠶豆屬(Vicia)物種、豌豆、紫花苜蓿或灌木(咖啡、可可、茶)、柳屬(Salix)物種。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選植物是油料作物植物如花生、歐洲油菜、油菜、向日葵、紅花、罌粟、芥菜、W、蓖麻、絲、金盞花、石榴、月見草、西葫蘆/南瓜、亞麻子、大豆、玻璃苣、樹(油棕、可可)。尤其優(yōu)選含有較高C18:2和/或C18:3脂肪酸的植物，如向日葵、紅花、煙草、毛蕊花、芝麻、棉、西葫蘆/南瓜、罌粟、月見草、核桃、亞麻子、大麻或薊.極特別優(yōu)選的植物是例如紅花、向日葵、罌粟、月見草、核桃、亞麻子或大麻。原則上，在用于產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的本方法中可以4吏用脂肪酸或脂代謝的全部基因，有利地是與A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶組合為了本發(fā)明目的，將復數(shù)形式理解為包含單數(shù)或反之亦然。選自6L&輔酶A脫氫酶、酰基-ACP[?；泽w蛋白去飽和酶、?；?ACP硫酯酶、脂肪酸酰基轉(zhuǎn)移酶、?；?輔酶A:溶血磷脂耽基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰基-輔酶A羧化酶、?；?輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延長酶的脂肪酸或脂代謝的基因有利地與A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或(D3-去飽和酶組合地加以使用，有可能施用單個基因或組合的多個基因.除了為本發(fā)明方法中所用A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和ro3-去飽和酶在生物中直接產(chǎn)生起始脂肪酸之外，脂肪酸還能自外部添加。因為經(jīng)濟原因優(yōu)選在生物內(nèi)產(chǎn)生。優(yōu)選的底物是亞油酸(C18:2"")和/或y-亞麻酸(C18:3A6，9，12)。為了在以上用于產(chǎn)生具有有利提高含量的多不飽和脂肪酸的油和/或甘油三酯的方法內(nèi)增加產(chǎn)量，增加用于合成脂肪酸的起始產(chǎn)物的量是有利的；這可以例如通過將編碼具有A12-去飽和酶活性的多肽的核酸導入生物得以實現(xiàn)。本發(fā)明方法中所用的A12-去飽和酶有利地將油酸(C18:l^)轉(zhuǎn)化成亞油酸(C18:2A"2)或?qū)?lt;:18:2"，9轉(zhuǎn)化成C18:3A6，9，12(=GLA)。這提供增加的用于合成多不飽和脂肪酸的原材料亞油酸(C18:2"")和Y-亞麻酸(C18:3A6，9，12)。這特別在產(chǎn)油生物如在來自具有較高油酸的十字花科如蕓苔屬，例如歐洲油菜；胡頹子科如胡頹子屬，例如油橄欖，或豆科如大豆屬，例如大豆的那些生物內(nèi)是有利的。因為這些生物僅有較低的亞油酸(Mikoklajczak等，JournaloftheAmericanoilsChemicalSociety,38，1961，678-681)，利用以上提及的用來產(chǎn)生原材料亞油酸的A12-去飽和酶是有利的。本發(fā)明方法中所用的核酸有利地衍生自植物，如藻，例如綠枝藻綱如異毛藻屬(Heteromastix)、Mammella屬、Mantoniella屬、微單胞藻屬(Micromonas)、腎藻屬(Nephroselmis)、Ostreococcus屬、綠枝藻屬(Prasinocladus)、Prasinococcus屬、Pseudoscourfielda屬、Pycnococcus屬、塔胞藻屬(Pyramimonas)、Scherffelia屬、Tetraselmis屬，例如Heteromastixlongifillis、Mamiellagilva、Mantoniellasquamata、Micromonaspusilla、綠腎藻(Nephroselmisolivacea)、Nephroselmispyriformis、Nephroselmisrotunda、Ostreococcustauri、Ostreococcussp.、Prasinodadusascus、綠枝藻(Prasinodaduslubricus)、Pycnococcusprovasolii、Pyramimonasamylifera、Pyramimonasdisomata、Pyrami咖nasobovata、Pyramimonasorientalis、Pyramimonasparkeae、Pyramimonasspinifera、Pyramimonassp.、Tetraselmisapiculata、Tetraselmiscarteriaformis、Tetraselmischui、Tetraselmisconvolutae、Tetraselmisdesikacharyi、Tetraselmisgracilis、Tetraselmishazeni、Tetraselmisimpellueida、Tetraselmisinconspkua、Tetraselmislevis、Tetraselmismaculata、Tetraselmismarina、Tetraselmisstriata、Tetraselmissubcordiformis、Tetraselmissuecica、Tetraselmistetrabrachia、Tetraselmistetrathele、Tetraselmisverrucosa、Tetraselmisverrucosafo.Rubens或Tetraselmissp.。所用的核酸有利地衍生自O(shè)streococcus屬的藻。其它有利的生物是珪藻，如脊?jié)i藻(Thalassiosira)或褐指藻或破嚢壺菌或真菌如破嚢壺菌或疫霉(Phyt叩hthora)。多肽。這些序列單獨地或與編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或to3-去飽和酶的核酸序列組合地克隆至表ii^建體內(nèi)，并用于導入植物及在其中表達.由于它們的構(gòu)建，這些表達構(gòu)建體使本發(fā)明方法中所產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的有利優(yōu)化合成變得可能.在優(yōu)選的實施方案中，本方法還包括獲得包含本方法中所用核酸序列的細胞或完整生物的步驟，其中細胞和/或生物用編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或3-去飽和酶的本發(fā)明核酸序列、如下所述的基因構(gòu)建體或載體，單獨地或與編碼脂肪酸代謝或脂代謝蛋白質(zhì)的額外的核酸組合轉(zhuǎn)化.在更優(yōu)選的實施方案中，此方法還包括從細胞或植物得到油、脂或游離脂肪酸的步驟.的溫室生長或田間生長培養(yǎng)形式.所產(chǎn)生的細胞和植物因而有利地是產(chǎn)油生物(如油料作物，例如花生、歐洲油菜、油菜、亞麻籽、；^、花生、大豆、紅花、大麻、向日葵或玻璃苣)的細胞，在植物細胞、植物組織或植物器官的情況下，將"生長"理解為意指例如在營^養(yǎng)基內(nèi)或其表面培養(yǎng)、或完整植物在基質(zhì)上或在其中的培養(yǎng)，例如在水培養(yǎng)、盆栽培養(yǎng)料內(nèi)或在可耕地上栽培。為本發(fā)明的目的，"轉(zhuǎn)基因的"或"重組的"就此而言意指例如核酸序列、包含本發(fā)明核酸序列的表達盒(=基因構(gòu)建體)或載體或用本發(fā)明的核列、表達盒或栽體轉(zhuǎn)化的生物，前述這些均通過重組方法產(chǎn)生，在其中a)本發(fā)明的核^f列，或b)可有效地連接于本發(fā)明核酸序列的遺傳控制序列，例如啟動子，或c)(a)和(b)沒有處于它們天然的遺傳環(huán)境內(nèi)或已經(jīng)通過重組方法進行修飾，修飾可能采取例如取代、增加、刪除、倒置或插入一個或多.個核香殘基的形式。將天然遺傳環(huán)境理解為意指原始生物中的天然基因組位點或染色體位點或存在于基因組文庫內(nèi)。在基因組文庫的例子中，優(yōu)選保留、至少部分保留核酸序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境位于核酸序列的至少一側(cè)并且具有至少50bp、優(yōu)選地是至少500bp、特別優(yōu)選地是至少1000bp、最優(yōu)選地是至少5000bp序列長度。當天然存在的表達盒(例如本發(fā)明核酸序列的天然啟動子與相應A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或o)3-去飽和酶天然存在的組合)受到非天然的Ait("人工")方法例如通過誘變性處理修飾時，該表達盒變成轉(zhuǎn)基因表達盒。合適的方法描述于例如美國5.565.350或WO001/15815,因此為本發(fā)明目的，將轉(zhuǎn)基植物理解為如上意指本方法中所用的核酸沒有處在植物基因組內(nèi)它們的天然位點里，這些核酸有可能得以同源表達或異源表達。然而如所提及，轉(zhuǎn)基因也意指即便本發(fā)明的核酸處于植物基因組內(nèi)它們的天然位置里，此序列就天然序列而言已經(jīng)受到l務飾，和/或天然序列的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)受到<務飾。將轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地理解為意指本發(fā)明核酸在基因組非天然位點內(nèi)的表達，即同源或優(yōu)選地異源的核^達發(fā)生。原則上，用于本發(fā)明方法中所用核酸、表達盒或栽體的宿主生物有利地是能夠合成脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸和/或適用于表達重組基因的全部生物?？赡芴岬綄嵗侵参锶鐢M南芥、菊科植物例如金盞花或作物植物如大豆、花生、蓖麻、向日葵、玉米、棉、亞麻(flax)、歐洲油菜、椰子、油棕、紅花或可可豆。優(yōu)選的植物是天然能夠合成大量油的植物，如大豆、歐洲油菜、椰子、油棕、紅花、亞麻、W、荒麻、金盞花、花生、可可豆或向日葵。用于本發(fā)明目的的植物包括所有表型形式的植物細胞和某些植物組織、器官和部分，如花藥、纖維、根毛、莖、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、收獲材料、植物組織、可繁殖組織和細胞培養(yǎng)物，其它衍生自實際轉(zhuǎn)基因植物和/或可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，包含在本發(fā)明方法中合成的多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因植物能夠有利地直接進行銷售而沒有任何必要對已合成的油、脂或脂肪脧進行分離。本發(fā)明方法的植物如下所列完整植物和所有植物部分、植物器官或植物部分如葉、莖、種子、根、塊莖、花藥、纖維、根毛、莖、胚、愈傷組織、子葉、葉柄、收獲材料、植物組織、可繁殖組織和細胞培養(yǎng)物，它們衍生自實際轉(zhuǎn)基因植物和/或可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物.在本上下文中，種子包含種子的所有部分，如種皮、表皮細胞、種子細胞、胚乳或胚胎組織。本發(fā)明方法中所產(chǎn)生的化合物還可以從生物、優(yōu)選從植物中以它們的油、脂肪、脂和/或游離脂肪酸形式分離。通過此方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸可通過收獲生物從生物在其中生長的培養(yǎng)物中或從田野收獲生物而得到。這可通過壓榨和提取植物部分，優(yōu)選植物種子得以實現(xiàn)。在本上下文中，油、脂肪、脂和/或游離脂肪酸通過已知的冷打或冷壓工藝得到獲得，無需加熱。為了更輕松地將植物部分(特別是植物種子)分散，可以先前將其l^碎、蒸或烤.然后，將已經(jīng)以該方式進行預處理的種子壓榨或者用溶劑(如溫己烷)提取.隨后去除溶劑。以該方式，可以分離本發(fā)明方法所產(chǎn)生的化合物的96%以上。此后，將所得到的產(chǎn)物進一步加工，即精煉。在該過程中，首先去除一些物質(zhì)，如植物黏液和懸浮物質(zhì).通過添加酸(例如磷酸)會在酶學或者或化學-物理學上影響脫泥。此后用堿例如氫氧化鈉溶液處理去除游離脂肪酸。得到的產(chǎn)物用水徹底洗滌以去除殘留于產(chǎn)物內(nèi)的堿，然后干燥。為除去殘留于產(chǎn)物內(nèi)的色素，使產(chǎn)物接受漂白處理，例如使用漂白土(filler，searth)或活性碳。最后使產(chǎn)物除臭，例如利用蒸汽。本發(fā)明的一個實施方案是油、脂、脂肪酸和/或脂肪酸組合物在祠料、食品、化妝品或藥品中的用途，其中所述的油、脂、脂肪酸和/或脂肪^M合物已通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生或通過將這些油、脂和/或脂肪酸與動物的、微生物的或植物的油、脂或脂肪酸混合而產(chǎn)生。本發(fā)明方法所產(chǎn)生的油、脂、脂肪酸或脂肪酸混合物可以按照技術(shù)人員熟悉的用于與其它動物源的油、脂類、脂肪酸或脂肪酸混合物例如魚油混合的方式進行使用。將術(shù)語"油"、"脂"或"脂肪"理解為意指包含不飽和、飽和，優(yōu)選地是酯化的、有利地結(jié)合于甘油三酯內(nèi)的脂肪酸的脂肪酸混合物。油、脂或脂肪優(yōu)選地具有較高游離多不飽和的脂肪酸或有利地是酯化的多不飽和脂肪酸，特別是亞油酸、Y-亞麻酸、二高T"亞麻酸、花生四烯酸、a-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸，特別有利地是花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。酯化的不飽和脂肪酸的量優(yōu)選地等于大約30%，更有選含量50%，甚至更優(yōu)選60%、70%、80。/?；蚋吆?。為了分析，例如可以在將脂肪酸經(jīng)轉(zhuǎn)酯作用轉(zhuǎn)化成甲基酯后通過氣相色譜測定脂肪酸含量。油、脂或脂肪可以包含多種其它的飽和或不飽和脂肪酸，例如金盞花素酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸等.油或脂內(nèi)的多種脂肪酸的含量可以變化，尤其取決于起始生物.如上所述，本方法中產(chǎn)生的有利地具有至少4個雙鍵的多不飽和脂肪^A例如鞘氨脂、磷酸甘油酯、月旨、糖脂、磷脂、單酰甘油、二酰甘油、三?；视突蚱渌舅狨ィ瑑?yōu)選三酰甘油酯。從已于本發(fā)明方法中制備的有利地具有至少5個或6個雙鍵的多不飽和脂肪酸開始，已存在的多不飽和脂肪酸可以例如經(jīng)堿如液體KOH或NaOH處理或者酸水解(有利地在醇例如甲醇或乙醇存在下)處理，或經(jīng)酶切割釋放，并且經(jīng)例如相分離及隨后經(jīng)例如H2S04酸化作用進行分離。脂肪酸還可以無需上述加工步驟而直接釋放。在導入生物、有利地導入植物細胞或植物后，本方法中所用的核酸可以存在于獨立的質(zhì)粒內(nèi)或有利地整合至宿主細胞基因組內(nèi).在整合至基因組內(nèi)的情況下，整合可以是隨機的，或通過重組作用實現(xiàn)以至導入的拷貝取代原有基因，因而對細胞產(chǎn)生所需化合物加以調(diào)節(jié)，或通過反式利用基因，以至基因與這樣的功能性表達單元有效地連接，所述功能性表達單元包含確?；虮磉_的至少一種序列和確保已進行功能性轉(zhuǎn)錄的基因發(fā)生多聚腺苷酸化的至少一種序列。核酸有利地經(jīng)用于多重平行表達的多重表達盒或構(gòu)建體導入生物，有利地導入用于基因發(fā)生種子特異性多重平行表達的植物。蘚類和藻類是唯一已知可產(chǎn)生大量多不飽和脂肪酸如花生四烯酸(ARA)和/或二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)的植物系統(tǒng)。蘚在膜脂內(nèi)包含PUFA，而藻類、與藻類有關(guān)的生物及少數(shù)真菌也在三酰甘油級分內(nèi)聚集大量PUFA。這是為什么從PUFA聚集于三酰甘油級分內(nèi)的株系中分離的核酸分子是對本發(fā)明方法并且因而對修飾宿主內(nèi)的脂和PUFA生產(chǎn)系統(tǒng)特別有利的原因，其中所述的宿主特別是植物，如油料作物植物，例如歐洲油菜、油菜、亞麻、大麻、大豆、向日葵和玻璃苣。所述核酸分子因此可以有利地用于本發(fā)明方法，有利地適合于用于本發(fā)明方法中并編碼具有A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶活性的多肽的核酸和/或所用其它核酸的底物有利地是<:16-、C『或C加-月旨肪酸，其中所述的其它核酸例如編碼選自?；o酶A脫氫酶、酰基-ACP[?；d體蛋白l去飽和酶、?；?ACP硫酯酶、脂肪酸跣基轉(zhuǎn)移酶、酰基-輔酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰輔酶A羧化酶、酰基輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延長酶的脂肪酸代謝或脂代謝中的多肽.在本方法中作為底物轉(zhuǎn)化的脂肪酸優(yōu)選地以它們的酰基輔酶A酯和/或其磷脂形式進行轉(zhuǎn)化。為產(chǎn)生本發(fā)明的長鏈PUFA，多不飽和的ds-脂肪酸首先必須通過去飽和酶的酶活性進行去飽和并且依次通過延長酶延長至少兩個碳原子。在一次延長循環(huán)后，延長酶酶活性產(chǎn)生C2Q-脂肪酸并且在兩輪延長循環(huán)后產(chǎn)生<:22-脂肪酸。本發(fā)明方法中所用去飽和酶^J^長酶的活性優(yōu)選地產(chǎn)生在脂肪酸分子內(nèi)具有至少4個雙鍵的C20-和/或C22-脂肪酸，優(yōu)選地產(chǎn)生具有至少4個雙鍵的C2o-脂肪酸，特別優(yōu)選地產(chǎn)生在分子內(nèi)具有至少5個或6個雙鍵、極特別優(yōu)選地具有6個雙鍵的C2。-和/或C22-脂肪酸。尤其優(yōu)選的本發(fā)明方法的產(chǎn)物是花生四烯酸、二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸。在脂肪酸內(nèi)具有至少4個雙鍵的C20-和/或C22-脂肪酸可以以游離脂肪酸形式或以酯形式，如磷脂類、糖脂類、鞘氨脂類、磷酸甘油酯、單酰甘油、二酰甘油或三酰甘油，通過本發(fā)明的酶活性進行延長。有利使用的植物中脂肪酸、油、脂或脂肪的優(yōu)選生物合成部位通常例如是種子或種子的細胞層，以致使本方法中所用核酸的種子特異性表達成為可能。不過，顯而易見的;U旨肪酸、油或脂的生物合成不必限制在種子組織內(nèi)，同時也可以以組織特異性方式在全部的其它植物部分例如表皮細胞內(nèi)或塊莖內(nèi)發(fā)生。由于利用編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A12-去飽和酶和Q)3-去飽和酶的本發(fā)明核酸，因此與未重組地^^有該核酸的野生型植物相比，本方法中產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸可以增加至少5%，優(yōu)選地至少10%，特別優(yōu)選地至少20%，極特別優(yōu)選地至少50%。原則上，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸可以在本方法所用的植物內(nèi)以兩種不同途徑增加。有利地，通過本方法產(chǎn)生的游離多不飽和脂肪^及酯化的多不飽和脂肪酸的含量可以得到擴充，有利地，轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)酯化的多不飽和脂肪酸庫可以通過本發(fā)明方法擴充。本方法中所得到的脂肪酸也適合作為原材料用于化學合成其它有價值的產(chǎn)物。它們例如可單獨或彼此組合地用于產(chǎn)生藥物、食品原料、動物飼料或化妝品。本發(fā)明還涉及編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選白a)具有SEQIDNO:l所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:2所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:l所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:2在氨基酸水平具有至少70。/。同一性并具有A6-去飽和酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及編碼具有A6-延長酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示序列的核M列，b)編碼具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示核紗列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8在氨基酸水平具有至少70%同一性并具有A6-延長酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選白a)具有SEQIDNO:9所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:10所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:9所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:10在氨基酸水平具有至少40。/。同一性并具有A5-去飽和酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及編碼具有co3-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:23所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:24所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNOJ3所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:24在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有3-去飽和酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及編碼具有A12-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:25所示序列的核酸序列，或b)編碼具有SEQIDNO:26所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:25所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:26在氨基酸水平具有至少40。/。同一性并具有A12-去飽和酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的基因構(gòu)建體，其中核酸有效地與一種或多種調(diào)節(jié)信號連接。此外，基因構(gòu)建體內(nèi)還可以存在選自?；o酶A脫氫酶、?；?ACP[酕基栽體蛋白去飽和酶、?；?ACP石克酯酶、脂肪酸g轉(zhuǎn)移酶、?；?輔酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰輔酶A羧化酶、酰基輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三跣甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪fcl長酶的脂肪酸或脂代謝中的其它生物合成基因。有利地，還存在選自A4-去飽和酶、A8-去飽和酶、A9-延長酶或A5-延長酶的脂肪酸代謝或脂代謝中的生物合成基因。物。核酸序列優(yōu)選地衍生自藻類如Ostreococcus、真菌如疫霉或者衍生自珪藻，如海鏈藻.編碼具有A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶活性的蛋白質(zhì)的本發(fā)明方法中所用核酸序列單獨地、優(yōu)選地是與使核酸在植物中表達成為可能的表達盒(=核酸構(gòu)建體)組合地進行有利導入。核酸構(gòu)建體可以包含多于一種的產(chǎn)生酶活性如A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶酶活性的核酸序列，為導入本方法中所用的核酸，核酸有利地以已知方式進行擴增和連接。優(yōu)選地遵循了按照PfuDNA聚合酶或Pfu/Taq聚合酶混合物方案的方法?？紤]待擴增序列來選擇引物。應當以如此方式有利地選棒引物以便擴增物包>^從起始密碼子至終止密碼子的完整編碼序列。擴增物可在擴增后方便地得到分析。例如可以實施凝膠電泳分離，然后是定量分析和定性分析。此后擴增物可按照標準方案(如Qiegen)進行純化。隨后純化的擴增物的等分試樣可用于隨后的克隆步驟.合適的克隆栽體通常是技術(shù)人員已知的。這類載體尤其包括能夠在微生物系統(tǒng)中復制的那些栽體，即確保在酵母或真菌中有效克隆和有可能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的那些主要載體.必須特別提及的那些栽體是適用于T-DNA介導轉(zhuǎn)化的多種雙元載體系統(tǒng)及共整合栽體系統(tǒng)。通常，此類載體系統(tǒng)的特征是它們至少包含農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導轉(zhuǎn)化所需的vir基因及T-DNA界定序列(T-DNA邊界)。這些載體系統(tǒng)還有利地包含其它順式調(diào)節(jié)區(qū)域，如啟動子和終止子序列和/或選擇標記，其中通過所述的選擇標記可以鑒定適宜轉(zhuǎn)化的生物。在共整合栽體系統(tǒng)實例中，在同一載體內(nèi)安置vir基因和T-DNA序列，而雙元系統(tǒng)至少以兩個栽體為基礎(chǔ)，其中一個載體攜帶vir基因而無T-DNA，而第二個栽體攜帶T-DNA而無vir基因。因此攜帶T-DNA而無vir基因的載體相對較小，容易在大腸桿菌(E.coli)及農(nóng)桿菌內(nèi)操作和復制。這類雙元栽體包括來自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的載體。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用Binl9、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。雙元栽體及其用途的綜述可在Hellens等，TrendsinPlantScience(2000)5，446~451內(nèi)找到。為制備栽體，栽體首先用限制性核酸內(nèi)切酶線性化并且隨后按照合適方式進行酶學修飾.此后純化栽體，并且將其等分試樣用于克隆步驟。在克隆步驟中，使用連接酶將經(jīng)酶切割并根據(jù)需要經(jīng)純化的擴增物與以類似方式制備的載體片段進行克隆。在本上下文中，特定的核酸構(gòu)建體、或栽體或質(zhì)粒構(gòu)建體可能具有一個或多于一個的編碼性基因片段.這些構(gòu)建體內(nèi)的編碼性基因片段優(yōu)選地與調(diào)節(jié)性序列有效連接.調(diào)節(jié)性序列尤其包括植物序列，如上述的啟動子及終止子序列。構(gòu)建體可以在選擇性條件下有利地穩(wěn)定在微生物內(nèi)、特別是在大腸桿菌和根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)內(nèi)增殖，并且有可能將異源DNA轉(zhuǎn)移至植物或微生物內(nèi).本方法中所用的核酸、本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體可以有利地使用克隆栽體導入生物如微生物或有利地導入植物內(nèi)，并且因而用于植物的轉(zhuǎn)化，如在PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton,Florida),第6/7章，笫71-119頁(1993);F.F.White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;在TransgenicPlants內(nèi)，第1巻，EngineeringandUtilization,編者Kung和R.Wu，AcademicPress,1993，15-38;B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,在TransgenicPlants內(nèi),第1巻,EngineeringandUtilization,編者Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-143;Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225中發(fā)表并引用的那些植物，因此本方法中所用的核酸、本發(fā)明核酸和核酸構(gòu)建體和/或栽體可用于重組地修飾類型廣泛的生物、有利地是植物，以便所述植物變成為更好和/或更高效的PUFA生產(chǎn)者。存在一系列可以i多飾A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A12-去飽和酶和co3-去飽和酶蛋白質(zhì)和本方法中所用其它蛋白質(zhì)如A5-延長酶或A4-去飽和酶蛋白質(zhì)的機制，因此在植物中、優(yōu)選地是油料作物植物中多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量、產(chǎn)生和/或產(chǎn)生效率可以因這種改良的蛋白質(zhì)而有利的受到直接影響?？梢栽黾覣6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和ro3-去飽和酶蛋白質(zhì)或基因的量或活性，因此產(chǎn)生量更多的基因產(chǎn)物，并最終產(chǎn)生更大量的本發(fā)明方法中所產(chǎn)生的具有至少4個雙鍵的多不飽和脂肪酸。也有可能是在導入相應基因前缺乏化合物的生物合成活性及能力的植物內(nèi)的從頭(denovo)合成。這類似地應用其它去飽和酶或延長酶或脂肪酸和脂類代謝中的其它酶的組合。利用多種趨異性序列即在DNA序列水平上不同的序列在本文內(nèi)也是有利的，或者用于基因表達的啟動子的利用在本文中也是有利的，其中所述的啟動子有可能引起隨時間過程而不同的基因表達，例如作為種子或貯油組織的成熟程度函數(shù)。由于A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或a3-去飽和酶基因單獨地或與細胞中其它基因組合地導入植物，故不僅有可能增加朝向終產(chǎn)物的生物合成流，而且還有可能增加或從頭合成產(chǎn)生相應的三酰甘油組合物。類似地，可增加其它基因的數(shù)量或活性，其中所述的其它基因參與輸入一種或多種脂肪酸、油、極性和/或中性脂的生物合成所需要的營養(yǎng)素，因此也可以增加細胞內(nèi)或貯存區(qū)室內(nèi)這些前體、輔助因子或中間體的濃度，由此細胞產(chǎn)生PUFA的能力可如以下所述進一步增強。通過優(yōu)化參與生物合成這些化合物的一種或多種A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或Q)3-去飽和酶基因活性或增加其數(shù)量，或通過破壞涉及降解這些化合物的一種或多種基因，有可能強化植物中的脂肪酸和脂類分子的產(chǎn)量、生產(chǎn)和/或生產(chǎn)效率。本發(fā)明方法中所用的分離的核酸分子編碼了蛋白質(zhì)或其部分，其中所述蛋白質(zhì)或單個蛋白質(zhì)或其部分包含如此的氨基酸序列，其與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQID脆24或SEQIDNO:26中所示^J^酸序列具有足夠同源性，以致于這些蛋白質(zhì)或其部分保留A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或Q)3-去飽和酶的活性。由該核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或其部分優(yōu)選地保留它們參與代謝在植物中為合成細胞膜或脂肪體所需要的化合物、或參與分子跨越這些膜轉(zhuǎn)運的基本酶活性及能力。這些核酸分子編碼的蛋白質(zhì)有利地與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26中所示M酸序列具有至少大約40%、優(yōu)選地是至少大約50%或60%和更優(yōu)選地是至少大約70%、80%或90%和最優(yōu)選地是至少大約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98°/。、99%或更高的同一性.為了本發(fā)明目的，將同源性或同源的分別理解為意指同一性或同一的.同源性在覆蓋4^PJL&,列或核^列區(qū)域進行計算。技術(shù)人員可獲得基于用來比較多種序列的多種算法的一系列程序。這里Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法產(chǎn)生特別可靠的結(jié)果。包含于GCG軟件包[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison，Wisconsin,USA53711(1991)內(nèi)的PileUp程序(J.Mol.Evolution.,25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989:151—153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.MoLBiol.48;443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))用于序列比對.如上表示為百分數(shù)的序列同源性數(shù)值使用GAP程序和如下設(shè)皇在全長序列區(qū)域范圍內(nèi)測定缺口權(quán)重50，長度權(quán)重3，平均配對10.000和平均錯配0.000。除非另外說明，否則這些設(shè)置總是作為標準設(shè)置用于序列比對。將本發(fā)明方法中所用A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或to3-去飽和酶的基本酶活性理解為意指與由序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25及其衍生物所編碼的蛋白質(zhì)/酶相比，這些酶保留至少10%，優(yōu)選地是20%，特別優(yōu)選地是30%并且極特別地是40%酶活性并且因而可參與代謝在植物或植物細胞中為合成脂肪酸、脂肪酸酯如二酰甘油酯和/或三酰甘油酯所需要的化合物，或參與分子跨膜轉(zhuǎn)運，即在脂肪酸分子中至少四、五或六處位置上具有雙鍵的C2Q-或C22-碳鏈。有利地用于本方法中的核酸可衍生自細菌、真菌、硅藻、動物如新桿屬(Caenorhabditis)或大^^合魚屬(Oncorhynchus)，或者植物如藻或者蘚，如希瓦氏菌屬(Shewanella)、劍葉蘚屬、破囊壺菌、鐮孢霉屬(Fusarium)、疫霉屬、角齒蘚屬、Mantoniella屬、Ostreococcus屬、等鞭金藻屬(Isochrysis)、網(wǎng)孢盤菌屬(Aleurita)、Muscarioides屬、被孢霉屬、玻璃苣屬、褐指藻屬、隱甲藻屬，特別是來自硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)、假矮海鏈藻(Thalassiosirapseudonona)、Mantoniellasquamata、Ostreococcussp.、Ostreococcustauri、細小棵藻(Euglenagracilis)、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)、致病疫霉(Phytophthorainfestans)、大豆疫霉、禾本^H^孢(Fusariumgraminaeum)、寇氏隱甲藻、角齒蘚、綠光等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、Aleuritafarinosa、破嚢壺菌某種(Thraustochytrhimsp.)、Muscarioidesviallii、高山被孢霉(MortierelIaalpina)、玻璃苣、三角褐指藻、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)，或特別有利地來自硬頭鱒、假矮海鏈藻或寇氏隱甲藻。備選地，可以在本發(fā)明方法中使用如此的核苷酸序列，其編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶并且在嚴4^件下有利地與如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示核苷酸序列雜交。中表達成為可能的表達盒。為此目的，編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶的核酸序列有效地與一種或多種有利地用于增強基因表達的調(diào)節(jié)信號連接。這些調(diào)節(jié)序列將可能使基因和蛋白質(zhì)特異性地表達。取決于宿主生物，這可以意味著例如基因^誘導后才表達和/或過量表達，或立即表達和/或過量表達。例如這些除這些新的調(diào)節(jié)序列以外或作為這些序列的替代，這些序列的天然調(diào)節(jié)元件仍可以存在于實際的結(jié)構(gòu)基因前面并且根據(jù)需要可能已經(jīng)以消除其天然調(diào)節(jié)并且增強基因表達的方式被遺傳性修飾.然而這種表達盒(表ii^J建體=基因構(gòu)建體)也可以在構(gòu)建方面更簡單，也就是說在核酸序列或其衍生物的前面不插入額外的調(diào)節(jié)信號并且不去除天然啟動子及其調(diào)節(jié)作用。相反，變。這些修飾的啟動子自身還可以以部分序列的形式(具有本發(fā)明方法中所用核^列部分的啟動子)位于天然基因之前以便增強活性。此外，基因構(gòu)建體還可以有利地包含與啟動子有效連接的一種或多種所謂的增強子序列，這使得核酸序列的增強表達成為可能。其它的有利序列如其它調(diào)節(jié)元件或終止子序列也可插入DNA序列的3'端。A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶基因可以以一個或多個拷貝存在于表達盒(基因構(gòu)建體)內(nèi)。優(yōu)選地，在每個表達盒中僅存在基因的一個拷貝。該基因構(gòu)建體或該類基因構(gòu)建體可以一起在宿主生物內(nèi)表達。在本上下文中，基因構(gòu)建體可插入一種或多種栽體并且以游離形式存在于細胞內(nèi)，或插Aj^因組內(nèi)。當這些待表達的基因一起存在于一個基因構(gòu)建體內(nèi)時，有利于在宿主基因組內(nèi)插入其它基因。在本上下文中，調(diào)節(jié)序列或輔助因子如上所述可優(yōu)選地對所導入基因的基因表達具有積極影響，即增強基因表達。因此調(diào)節(jié)元件的增強作用(有利地在轉(zhuǎn)錄水平上)可以通過使用強轉(zhuǎn)錄信號如啟動子和/或增強子而發(fā)生。此外，增強的翻譯也是可能的，例如通過改善mRNA的穩(wěn)定性。本發(fā)明的又一個實施方案是一種或多種這樣的基因構(gòu)建體，其包含一種或多種由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25或其衍生物所定義的序列并且編碼如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26中所示的多肽，以上提及的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或ffl3-去飽和酶蛋白質(zhì)有利地引起脂肪酸分子去飽和或延長，該底物有利地在脂肪酸分子內(nèi)具有l(wèi)、2、3、4、5或6個雙鍵并且有利地具有18、20或22個碳原子。這同樣適用于與一種或多種調(diào)節(jié)信號(有利地用于增強基因表達)有效連接的基因構(gòu)建體同系物、衍生物或類似物?？梢杂脕碇苽湓谛路椒▋?nèi)所用核酸序列并l^導入植物的有利調(diào)節(jié)序歹寸存在于例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、Ipp國lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、入-PR或X-PL的啟動子內(nèi)并且有利地用于革蘭氏陰性菌中。其它有利的調(diào)節(jié)子序列例如存在于革蘭氏陰性菌啟動子amy和SP02內(nèi)，存在于酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH內(nèi)或存在于植物啟動子CaMV/35SFranck等，Cell21(1980)285~294、PRPl[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)1、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或者遍在蛋白啟動子或菜豆蛋白啟動子內(nèi)。在本上下文中，誘導型啟動子也是有利的，如描述于EP-A-0388186(苯磺酰胺誘導性)、PlantJ.2，1992:397-404(Gatz等，四環(huán)素誘導性)、EP-A-0335528(脫落酸誘導性)或WO93/21334(乙醇或環(huán)己醇誘導性)的啟動子。其它合適的植物啟動子是馬鈴薯胞質(zhì)FBP酶啟動子或ST-LSI啟動子(Stockhaus等，EMBOJ.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸酰胺基轉(zhuǎn)移酶啟動子(Genbank登錄號U87999)或EP-A-0249676內(nèi)所述的結(jié)節(jié)特異性啟動子。特別有利的啟動子是使在參與脂肪酸生物合成的組織內(nèi)的表達成為可能的啟動子.極特別有利的是種子特異性啟動子如所述的USP啟動子，以及其它啟動子如LeB4、DC3、菜豆蛋白啟動子或油菜籽蛋白啟動子。更特別有利的啟動子是能夠用于單子葉或雙子葉植物并且在US5，608，152(歐洲油菜的油菜籽蛋白啟動子)、WO98/45461(擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動子)、US5，504，200(菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白啟動子)、WO91/13980(蕓苔的Bce4啟動子)內(nèi)、由Bae腿lein等，PlantJ.，2，2，1992:233—239(來自豆科植物的LeB4啟動子)內(nèi)描述的種子特異性啟動子、適于雙子葉植物的那些啟動子。適于單子葉植物的啟動子是例如大麥lpt-2或lpt-l啟動子(WO95/15389和WO95/23230)、大麥醇溶蛋白啟動子和WO99/16890內(nèi)所述的其它合適啟動子.原則上，有可能對新方法^:用全部天然啟動子連同它們的調(diào)節(jié)序，如以上提及的那些天然啟動子。還可能并且有利的是額外地或者單獨地使用人造啟動子，尤其當它們介導種子特異性表達時，如W099/168卯內(nèi)所述的那些啟動子。為了實現(xiàn)特別高的PUFA含量，在植物轉(zhuǎn)基因前，PUFA生物合成基因應當有利地以種子特異性方式表達于油料作物內(nèi)。為此目的，可使用種子特異性啟動子或在胚和/或在胚乳內(nèi)有活性的那些啟動子.原則上，種子特異性啟動子既可以分離自雙子葉植物，也可以分離自單子葉植物。優(yōu)選的啟動子如下所列USP(未知種子蛋白質(zhì))和豌豆球蛋白蠶豆I[Baumlein等，Mol.GenGenet.,1991,225(3)，油菜籽蛋白(歐洲油菜)[US5,608,152、酰基載體蛋白(歐洲油菜)[US5，315，001和WO92/18634、油質(zhì)蛋白(擬南芥)[WO98/45461和WO93/20216、菜豆蛋白(菜豆(Phaseolusvulgaris))US5,504,200〗、BceWO91/13980]、豆科B4(LegB4啟動子)[Baumlein等，PlantJ.，2，2，1992]、Lpt2和lptl(大麥)WO95/15389和WO95/23230卜來自稻、玉米和小麥的種子特異性的啟動子WO99/168卯、Amy32b、Amy6-6和aleurainUS5,677,474、Bce4(歐洲油菜)US5，530，149、大豆球蛋白(大豆)[EP571741、磷酸締醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06/62870、ADR12-2(大豆)[WO98/08962、異檸檬酸裂合酶(歐洲油菜)[US5,689，0401或a淀粉酶(大麥)[EP781849。植物的基因表達也可以經(jīng)化學誘導型啟動子促進(見于綜述Gate1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol,Biol.，48:89-108).在需要基因表達應當以時間特異性方式發(fā)生時，化學誘導型啟動子是特別合適的。此類啟動子的實例是水楊酸誘導型啟動子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導型啟動子(Gatz等(1992)PlantJ.2，397-404)和乙醇誘導型啟動子。為確保經(jīng)多個世代后生物合成基因仍穩(wěn)定整合于轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)，編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或w3-去飽和酶并且本方法中所用的每種核酸應當在獨立的啟動子，優(yōu)選地是不同于任何其它啟動子的啟動子控制下進行表達，因為重復序列基序可能導致T-DNA不穩(wěn)定或重組事件。在本上下文中，表達盒有利地以如此方式進行構(gòu)建，即啟動子之后是用于插入待表達核酸的適宜切割位點，該切割位點有利地位于多接頭內(nèi)，并且根據(jù)需要，終止子序列位于此多接頭后面。該序列重復數(shù)次，優(yōu)選地是三、四或五次，由此多達5個基因可組合于一個構(gòu)建體內(nèi)并導入轉(zhuǎn)基因植物以俊束達。這種序列有利地重復至多三次，或重復所需要的次數(shù)。為表達核酸序列，將核酸序列通過(例如多接頭內(nèi)的)合適切割位點在啟動子之后插入。有利地，每種核酸序列具有自己的啟動子并且根據(jù)需要具有自己的終止子序列.此類有利的構(gòu)建#^>開于例如DE10102337或DE10102338內(nèi)。不過，仍有可能在啟動子之后并根據(jù)需要在終止子序列之前插入多個核酸序列.這里，所插入核酸在表達盒內(nèi)的插入位點或其序列不是特別重要，也就是說核酸序列可插入表達盒的最頭位置或最末位置內(nèi)而其表達不因而受到顯著影響。有利地，不同啟動子例如USP、LegB4或DC3啟動子和不同終止子序列可用于表達盒內(nèi)。然而也有可能在表達盒中僅使用一種類型的啟動子。但這可能f1起不受歡迎的重組事件。如以上所述，導入基因的轉(zhuǎn)錄應當通過位于導入于生物合威基因3，末端的(終止密碼子之后的)合適終止子序列有利地進行終止?？稍诒旧舷挛膬?nèi)使用的終止子序列實例是OCSl終止子序列。如同啟動子的實例，應該對每一基因使用不同終止子序列。如以上所述，基因構(gòu)建體還可以包含待導入生物的其它基因。有可能并且有利的是將調(diào)節(jié)基因如編碼誘導物、阻抑物或酶的基因?qū)胨拗髦参锊⑶以谄渲斜磉_，其中所迷的誘導物、阻抑物或酶因其酶活性而參與對生物合成途徑的一種或多種基因的調(diào)節(jié)。這類調(diào)節(jié)基因可是異源或同源的。此外，脂肪酸代謝或脂代謝中的其它生物合成基因可有利地存在于核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體內(nèi)；然而這些基因還可以位于一種或多種其它核酸構(gòu)建體中。優(yōu)選使用的脂肪酸代謝或脂代謝中的生物合成基因選自?；o酶A脫氫酶、酰基-ACP[跣基栽體蛋白I去飽和酶、g-ACP疏酯酶、脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶、酖基-輔酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰輔酶A羧化酶、?；?輔酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延長酶或其組合。特別有利的核酸序列是選自?；?輔酶A:溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、A4-去飽和酶、A8-去飽和酶、A5-延長酶和/或A9-延長酶的脂肪酸代謝或脂代謝中的生物合成基因。在本上下文中，以上提及的核酸或基因可與其它延長酶和去飽和酶組合地克隆至表達盒內(nèi)，如上述那些表達盒內(nèi)，并在農(nóng)桿菌協(xié)助下用于轉(zhuǎn)化植物。如以上所述，調(diào)節(jié)序列或輔助因子可優(yōu)選地對已經(jīng)導入的基因的表達產(chǎn)生積極影響，并且因而增強已經(jīng)導入的基因的表達。因此，調(diào)節(jié)元件的增強作用可在轉(zhuǎn)錄水平通過使用強轉(zhuǎn)錄信號例如啟動子和/或增強子而有利地發(fā)生。然而例如通過改善mRNA穩(wěn)定性也可以增強翻譯。原則上，這類表達盒可直接用于導入植物或?qū)肫渌d體內(nèi)。這些有利的栽體，優(yōu)選地是表達栽體，包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶并且用于本方法中的核酸，或包含這樣的核酸構(gòu)建體，其包含單獨地或者與脂肪酸代謝或脂代謝中其它生物合成基因如酖基-輔酶A:溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶、A4-去飽和酶、A8-去飽和酶、A5-延長酶和/或A9-延長酶組合地進行使用的核酸。如在本上下文中所用，術(shù)語"載體"指這樣的核酸分子，其能夠運輸與其結(jié)合的另一核酸.一個類型的載體是"質(zhì)粒"，即向其中可以連接額外的DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一個類型的載體是病毒載體，額外的DNA片段有可能連接至病毒基因組內(nèi)。某些栽體能夠在已導入這些栽體的宿主細胞內(nèi)自主復制(例如具有細菌復制原點的細菌載體)。其它栽體在導入宿主細胞時有利地整合于宿主細胞基因組內(nèi)并且因而隨宿主基因組一起復制。而且某些載體能夠控制與這些栽體有效連接的基因的表達。這些栽體在本上下文中稱為"表達栽體".通常適用于DNA重組技術(shù)的表達載體采用質(zhì)粒形式。由于在本描述中質(zhì)粒是最常用的栽體形式，故"質(zhì)粒"和"栽體"可互換地使用。然而本發(fā)明還將包含具有類似功能的其它形式的表達載體，如病毒載體。此外，術(shù)語"栽體，，還將包舍技術(shù)人員熟悉的其它栽體，如噬菌體、病毒如SV40、CMV、TMV、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、線性或環(huán)形DNA。在本方法中有利地使用的重組表達載體包含處于適合在宿主細胞中表達所用核酸的形式下的如下所述核酸序列或上逸基因構(gòu)建體，這意指重組表達載體包含基于用來表達的宿主細胞而選擇的一種或多種調(diào)節(jié)序列，其中所述的調(diào)節(jié)序列有效地與待表達的核酸序列連接。在重組表達栽體中，"有效連接，，意指目的核苷^f列以如此方式與調(diào)節(jié)序列連接以致有可能表達該核苷酸序列，并且它們相互連接以致兩種序列(例如在體外(in-vitro)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)內(nèi)，在宿主細胞中(或若載體導入宿主細胞))均賦予序列預期功能。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"將包含啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸化作用信號)。這些調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel:GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress，SanDiego，CA(1990)或參見GruberandCrosby,in:MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnolgy，CRCPress,BocaRaton,Florida，編者GHck和Thompson,第7章，89-108，包括引用的參考文獻。調(diào)節(jié)序列包列。技術(shù)人員知道設(shè)計表達載體可能取決于多種因素，如待轉(zhuǎn)化宿主細胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達水平等?？稍O(shè)計所用的重組表達載體以在原核細胞或真核細胞內(nèi)表達A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或3-去飽和酶.如此設(shè)計是有利的，因為出于簡化的目的，常在微生物中開展栽體構(gòu)建的中間步驟。例如A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶基因可以表達于細菌細胞、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達栽體)、酵母和其它真菌細胞(見Romanos，M.A.等(1992)"Foreigngeneexpressioninyeast:areview"，Yeast8:423-488:vandenHondel，C.A.M.J丄等，(1991)"Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi",in:MoreGeneManipulationsinFungi,J.W.Bennet和L丄.Lasure編輯，第396-428頁AcademicPress:SanDiego:和vandenHondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi，，在AppliedMolecularGeneticsofFungi內(nèi)，Peberdy，J.F.等編輯，第1-28頁CambridgeUniversityPress:Cambridge)內(nèi)、按照如WO98/01572中所述的轉(zhuǎn)化方法使用栽體于藻類內(nèi)(Falciatore等，1999，MarineBiotechnology.l，3:239-251)，并且優(yōu)選地在多細胞植物的細胞內(nèi)(見Schmidt,R.和Willmitzer，L.(1988)"HighefficiencyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofArabidopsisthalianaleafandcotyledonexplants，，PlantCellRep.:583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton,Florida,第6/7章，笫71-119頁(1993);F.F.White,B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer,in:TransgenicPlants,第一巻，EngineeringandUtilization,Ed.:Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-43;Potrykus,Annu.Rev,PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225(及其中引用的參考文獻))表達。合適的宿主細胞還在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)內(nèi)討論。作為備選，重組表達載體可例如使用T7-啟動子調(diào)節(jié)序列和T7-聚合酶體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，在大多數(shù)情況下，原核生物內(nèi)蛋白質(zhì)的表達涉及利用包含控制融合蛋白或非融合蛋白表達的組成型或誘導型啟動子的栽體。典型的融合表達栽體尤其是pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白和蛋白A分別與重組靶蛋白融合。合適的誘導型非融合大腸桿菌表達栽體的實例尤其是pTrc(Amann等，(1988)Gene69:301畫315)和pETlld(Studier等，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(19卯)60-89),pTrc栽體內(nèi)把基因的表達基于宿主RNA聚合酶從雜合trp-lac融合啟動子上的轉(zhuǎn)錄。pETlid栽體內(nèi)乾基因的表達基于通過受到共表達的病毒RNA聚合酶(T7-gnl)介導的T7-gnl0-lac融合啟動子的轉(zhuǎn)錄。這種病毒RNA聚合酶由宿主菌林BL21(DE3)或HMS174(DE3)從定居的入-原噬菌體內(nèi)提供，其中所述的入-原噬菌體攜帶受lacUV5啟動子轉(zhuǎn)錄控制的T7gnl基因.適合于原核生物的其它載體是技術(shù)人員已知的，這些栽體是例如;桿菌的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN畫III113-Bl、Xgtll或pBdCI、鏈霉菌(Str印tomyces)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361、芽孢桿菌(BacilIus)的pUB110、pC194或pBD214、棒狀菌(Corynebacterium)的pSA77或pAJ667。在又一個實施方案中，表達栽體是酵母表達栽體。用于釀酒酵母(S.cerevisiae)內(nèi)表達的載體實例包括pYeDesaturasecl(Baldari等，(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。適用于其它真菌如絲狀真菌的栽體和栽體構(gòu)建方法包括在AppliedMolecularGeneticsoffungi,J.F.Peberdy等編輯，第1-28頁,CambridgeUniversityPress:Cambridge中的vandenHondel，C.A.M.J丄和Punt，P.J.(1991)"Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi，，或在MoreGeneManipulationsinFungi[J.W.Bennet和L.L.Lasure編輯，第396-428頁AcademicPress:SanDiego中詳細描述的那些。更合適的酵母載體例如是pAG國l、YEp6、YEpl3和pEMBLYe23,作為備選，A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或w3-去飽和酶可使用桿狀病毒栽體表達于昆蟲細胞內(nèi)?？色@得用于在培養(yǎng)的昆蟲細胞(例如Sf9細胞用于)內(nèi)表達蛋白質(zhì)的桿狀病毒表達栽體包含pAc系列(Smith等(1983)Mo1.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170:31-39)。以上提及的載體僅對可能的適合載體的小部分進行綜述。其它的質(zhì)粒是技術(shù)人員已知的并且例如描述于Cloningvector(Pouwels，P.H.等編輯，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)。對于原核細胞及真核細胞更合適的表達系統(tǒng)，見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis,T.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989的第16和第17章。最后，A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或to3-去飽和酶基因可以表達于植物細胞或完整植物內(nèi)(例如種子植物，例如耕作作物)。植物表達載體的實例包括詳細描述于Becker,D.、Kemper,E.、Schell，J.和Masterson，R.(1992)"Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder，"PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bevan，M.W.(1984)"BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation,"Nud.AcidsRes.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants于TransgenicPlants:第1巻，EngineeringandUtilization,Kung和R.Wu編輯，第15-38頁內(nèi)的那些植物表達載體.植物表達盒優(yōu)選地包含這樣的調(diào)節(jié)序列，如多聚腺苷酸化作用信號，其能夠控制植物細胞中基因表達并且被有效地連接以致每種序列均可以充分實現(xiàn)其功能，例如轉(zhuǎn)錄終止功能。優(yōu)選的多聚腺苷酸化作用信號是衍生自根瘤農(nóng)桿菌T-DNA如Ti質(zhì)粒pTiACH5(1984年Gielen等，EMBOJ.3835etseq.)中的稱作章魚氨酸合酶的基因3的那些多聚腺苷酸化作用信號或其功能性等效物，不過，在植物中具有功能性活性的全部其它終止子序列也是合適的。由于植物基因表達并非總是受限于轉(zhuǎn)錄水平，因此植物表達盒優(yōu)選地包含有效連接的其它序列，如翻譯增強子，例如過度驅(qū)動序列，其增強可增加蛋白質(zhì)/RNA比率的煙草花葉病毒5，-非翻譯前導序列(Gallie等，15:8693-8711)。如以上所述，植物基因表達盒必須與合適的啟動子有效地連接，其中所述啟動子引起基因以正確的時間或以細胞或組織特異性方式表達?？衫玫膯幼邮墙M成型啟動子(Benfey等，EMBOJ.8(1989)2195-2202)例如衍生自植物病毒如35SCaMV(Franck等，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(也見US5352605和WO84/02913)的那些啟動子或植物啟動子如描述于US4,962,028內(nèi)的Rubisco亞單位的啟動子。用于植物基因表達盒內(nèi)有效連接的用途的其它優(yōu)選序列是靶向序列，其中所述靶向序列是將基因產(chǎn)物引導至其對應的細胞區(qū)室(見綜述Kermode，Crit.Rev.PlantSci.15,4(1996)285-423及其引用的參考文獻)例如至液泡、細胞核、所有類型質(zhì)體如淀粉質(zhì)體、葉綠體、色質(zhì)體、胞外空間、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、油質(zhì)體、過氧化物酶體和植物細胞的其它區(qū)室內(nèi)所需的。如以上所述，植物基因表達還可以通過化學誘導型啟動子(見綜述Gatzl997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，48:89-108)促進。當基因表達需以時間特異性發(fā)生時，化學誘導型啟動子是特別適合的。這類啟動子的實例是7JC楊酸誘導型啟動子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導型啟動子(Gatz等(1992)PlantJ.2，397-404)和乙醇誘導型啟動子。應答生物性脅迫或非生物脅迫條件的啟動子如病原體誘導的PRP1基因啟動子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、熱誘導的番茄hsp80啟動子(US5,187,267)、寒冷誘導的馬鈴薯a淀粉酶啟動子(WO96/12814)或外傷誘導的pinll啟動子(EP-A-O375091)也是適合的.特別優(yōu)選引起基因在其中發(fā)生脂肪酸、脂類和油生物合成的組織和器官內(nèi)、在種子細胞如胚乳細胞和發(fā)育胚的細胞內(nèi)表達的那些啟動子。合適的啟動子是歐洲油菜的油菜籽蛋白啟動子(US5，608，152)、蠶豆的USP啟動子(Baeumlein等，MolGengenet，1991，225(3):459-67)、擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動子(WO98/45461)、菜豆的菜豆蛋白啟動子(US5，504，200)、蕓苢的Bce4啟動子(WO91/13980)或豆球蛋白B4啟動子(LeB4;Baeumlein等，1992，PlantJournal,2(2):233-9)及引起單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等內(nèi)的種子專一性表達的啟動子。重要的合適啟動子是大麥的lpt2或lptl基因啟動子(WO95/15389和WO95/23230)或描述于WO99/16890內(nèi)的來自大麥的醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麥的麥醇溶蛋白基因、小麥的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麥的谷蛋白基因、高梁的kasirin基因或黑麥的棵麥醇溶蛋白基因的啟動子。特別地，可能需要引起本方法中所用A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶的多重平行表達。這種表達盒可通過同時轉(zhuǎn)化多個獨立的表達構(gòu)建體，或優(yōu)選地通過多個表達盒組合于一個載體構(gòu)建體內(nèi)加以導入。此外，多種載體在每個實例中可以用多個表達盒進行轉(zhuǎn)化，并且隨后轉(zhuǎn)移至宿主細胞。可能特別適合的其它啟動子是引M體特異性表達的那些啟動子，因為質(zhì)體構(gòu)成在其中脂生物合成的前體及某些終產(chǎn)物進行合成的區(qū)室。合適的啟動子如病毒RNA聚合酶啟動子描述于WO95/16783和WO97/06250，并且來自擬南芥的clpP啟動子描述于WO99/46394內(nèi)。栽體DNA可通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導入原核細胞和真核細胞。如在本上下文中所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"、接合和轉(zhuǎn)導將包含用于外源核酸(如DNA)導入宿主細胞內(nèi)的本領(lǐng)域眾所周知的多種方法，包括磷酸鉤或氯化鈣共沉淀、DEAE葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、化學介導的轉(zhuǎn)移、電穿孔法或粒子轟擊法。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞(包括植物細胞)的合適方法可在Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual"第二版.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)和其它的實驗室教科書如MethodsinMolecularBiology,1995，第44巻,Agrobacteriumprotocols,編者Gartland和Davey，HumanaPress,Totowa，NewJersey內(nèi)找到。原則上適合于攝取本發(fā)明核酸、本發(fā)明基因產(chǎn)物或本發(fā)明栽體的宿主細胞是全部原核生物或真核生物。有利地用作中間宿主的宿主生物是微生物，如真菌或酵母。優(yōu)選植物，如具有較高脂化合物的油料作物植物，如歐洲油菜、月見草、大麻、薊、花生、油菜、亞麻、大豆、紅花、向日葵、玻璃苣，或植物如玉米、小麥、黑麥、燕麥、小黑麥、稻、大麥、棉、木薯、胡椒、萬壽菊，茄科植物如馬鈴薯、煙草、茄和番茄、豌豆屬物種、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳屬物種、樹(油棕、椰子)和飼料作物a根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選的植物是油料作物植物，如大豆、花生、歐洲油菜、油菜、亞麻、M、月見草、向日葵、紅花、樹(油棕、椰子)。本發(fā)明還涉及在下文中列舉并編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、ro3-去飽和酶和/或A12-去飽和酶的核酸序列。編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:l所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:2所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:l所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:2在氨基酸水平具有至少70%同一性并具有A6-去飽和酶活性的多肽.編碼具有A6-延長酶活性的多肽的分離核M列，其選自a)具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示核^列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8在^J^酸水平具有至少70%同一性并具有A6-延長酶活性的多肽。編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽的分離核^列，其選自a)具有SEQIDNO:9所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:10所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:9所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:10在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有A5-去飽和酶活性的多肽。編碼具有o)3-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:n所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:24所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:23所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:24在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有3-去飽和酶活性的多肽。編碼具有A12-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:25所示序列的核酸序列，或b)編碼具有SEQIDNO:26所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:25所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:26在氨基酸水平具有至少40。/。同一性并具有A12-去飽和酶活性的多肽。以上提及的本發(fā)明核酸衍生自能夠合成PUFA的生物，如真菌、植物如藻或珪藻。分離的上述核酸序列有利地衍生自海鏈藻屬硅藻，或來自綠枝藻綱如Ostreococcus屬，來自棵藻綱(Euglenophyceae)如Euglenia屬或腐霉科(Pythiaceae)如疫霉屬。尤其優(yōu)選的核酸序列衍生自大豆疫霉。在有利的實施方案中，這些核酸序列使EPA和/或ARA的合成成為可能。下表描述這些有利的核酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>如上所述，本發(fā)明還涉及編碼具有A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、Q)3-去飽和酶和A12-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其中由這些核酸序列編碼的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、G)3-去飽和酶和/或A12-去飽和酶將具有1、2、3或4個雙鍵的ds-或C2o-脂肪酸如C18:1A9、C18:2A"2或C18:3A9，12，15轉(zhuǎn)化成具有3或4個雙鍵的多不飽和C2『脂肪酸如C20:3，11，14或C20:4AS，11，14，17。脂肪酸在磷脂或CoA-脂肪酸酯內(nèi)、有利地是在CoA-脂肪酸酯內(nèi)被有利地去飽和。在有利的實施方案中，術(shù)語"核酸(分子)"如在本上下文中所用還包含位于編碼基因區(qū)3，末端和5，末端的非翻譯序列位于編碼區(qū)5，末端上游序列的至少500個，優(yōu)選地是200個，特別優(yōu)選地是100個核苷酸以及位于編碼基因區(qū)3，末端下游序列的至少100個，優(yōu)選地是50個，特別優(yōu)選地是20個核苷酸。"分離的"核酸分子是與存在該核酸天然來源內(nèi)的其它核酸分子分開的。"分離的"核酸優(yōu)選地沒有天然分布于生物(衍生該核酸的生物)的基因組DNA內(nèi)該核酸兩側(cè)的序列(例如位于該核酸5，末端和3，末端的序列)。在多種實施方案中，編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、co3-去飽和酶和A12-去飽和酶的分離核酸分子可以包含例如少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的如此核苷酸序列，其天然分布在細胞(衍生該核酸的細胞)基因組DNA內(nèi)的該核酸分子兩側(cè)。本方法中所用的核酸分子例如具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25核苷酸序列的核酸分子或其部分可以使用分子生物學標準技術(shù)和本文中提供的序列信息進行分離.同源序列或同源的、保守的序列區(qū)域例如還可以借助比較性算法在DNA水平或氨基酸水平進行鑒定。它們可以用作雜交探針和標準雜交4支術(shù)(例如在1989年紐約冷泉港ColdSpringHarborLaboratory出版#土《MolecularCloning:ALaboratoryManual》第二版所描述的那些探針和標準雜交技術(shù))以分離可以用于本方法中的其它核酸序列。此外，包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的完整序列或其部分的核酸分子可通過聚合H^式反應進行分離，其中使用以該序列或其部分為基礎(chǔ)的寡核苷酸引物(例如包含完整序列或其部分的核酸分子可以使用基于相同序列所產(chǎn)生的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應進行分離)。例如mRNA可從細胞(如通過Chirgwin等(1979)Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸胍提取方法)分離，并且通過逆轉(zhuǎn)錄酶(例如自Gibco/BRL、Bethesda、MD可獲得的MLVMoloney逆轉(zhuǎn)錄酶，或自SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL可獲得的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)獲得cDNA。用于聚合酶鏈式反應擴增的合成性寡核苷酸引物可以借助在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26內(nèi)詳述的^J^絲列，基于SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示序列之一生成。本發(fā)明的核酸可使用cDNA或備選地是基因組DNA作為模板及合適的寡核苷酸引物，通過標準PCR擴增技術(shù)進行擴增。擴增的核酸因而可克隆至合適的載體并且通過DNA序列分析加以表征。與去飽和酶核苷酸序列對應的寡核苷酸可通過標準合成方法，例如使用自動DNA合成儀產(chǎn)生。具有序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或CD3-去飽和酶核酸序列的同系物意指例如這樣的等位變體，其與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示核苷酸序列或其同系物、；時生物或類似物或者其部分具有至少大約40或50%、優(yōu)選地至少大約60或70%、更優(yōu)選地至少大約70或80%、90%或95%并且甚至更優(yōu)選地至少大約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性或同源性。具有與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示核苷酸序列或與其部分雜交的核苷酸序列的分離核酸分子可例如在嚴4Wf下雜交。根據(jù)本發(fā)明，其部分理解為意指至少25個4^對^bp)、50bp、75bp、100bp、125bp或150bp,優(yōu)選地是至少175bp、200bp、225bp、250bp、275bp或300bp，特別優(yōu)選地是350bp、400bp、450bp、500bp或更多>5^^用于雜交。使用全序列也是可能并且是有利的。等位變體特別包含這樣的功能性變體，其可以通過自/向SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25內(nèi)詳述的序列內(nèi)缺失、插入或置換核苷酸而獲得，然而，即便因一種或多種基因的插入，預期合成的所得蛋白質(zhì)的酶活性仍然有利地保留。保留A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或m3-去飽和酶酶活性的蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)的活性基本上沒有減少，意指與由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25編碼的蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)具有原始的酶活性的至少10%,優(yōu)選地是20%，特別優(yōu)選地是30%，極特別優(yōu)選地是40%。同源性在M4^氨基酸序列或核紗列區(qū)域進行計算。技術(shù)人員可獲得基于用來比較多種序列的多種算法的一系列程序。這里Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法產(chǎn)生特別可靠的結(jié)果。包含于GCG軟件包[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)內(nèi)的PileUp程序(J.Mol.Evolution.,25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989:151-153)或Gap和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))用于序列比對。如上表示為百分數(shù)的序列同源性數(shù)值使用GAP程序和如下設(shè)置在全長序列區(qū)域范圍內(nèi)測定缺口權(quán)重50，長度權(quán)重3，平均配對10.000和平均錯配0.000。除非另外說明，否則這些設(shè)置總是作為標準設(shè)置用于序列比對。SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的同系物還意指例如編碼性或非編碼性DNA序列的細菌性、真菌性和植物同系物、截短的序列、單鏈DNA或RNA。SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的同系物還意指衍生物，例如啟動子變體.詳細描述的核苷酸序列上游的啟動子可以通過一個或多個核苷酸交換、通過插入和/或缺失進行修飾，與此同時啟動子的功能性或活性未受到不利影響。還有可能啟動子序列的{務飾增強了它們的活性或者它們完全由更活躍的啟動子(包括來自異源生物的那些啟動子)替換.脂類合成可分成兩個部分合成脂肪酸及其與sn-甘油-3-磷酸結(jié)合，和添加或修飾極性頭基團。膜內(nèi)常見的脂包含磷脂、糖脂、鞘氨脂和磷酸甘油酯。脂肪酸的合成始于乙酰輔酶A羧化酶將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成丙二酸單酰輔酶A或乙酰轉(zhuǎn)?；笇⒁阴］o酶A轉(zhuǎn)化成乙St^-ACP?？s合反應后，這兩種產(chǎn)物分子一起形成乙酰乙?；?ACP，乙酰乙?；?ACP經(jīng)一系列縮合、還原和脫7JC化反應進行轉(zhuǎn)化，因而得到具有所需鏈長度的飽和脂肪酸分子。從這些分子中產(chǎn)生不飽和脂肪酸的過程由專一性去飽和酶催化，或通過分子氧進行有氧催化或無氧催化(就微生物內(nèi)脂肪酸合成而言，見F.C.Neidhardt等，(1996)E.coliandSalmonella.ASMPress:Washington,D.C.第612-636頁及其中引用的參考文獻；Lengeler等(編者)(1999)BiologyofProcaryotes.Thieme:Stuttgart,NewYork和其中的參考文獻及Magnuson，K.,等(1993)MicrobioIogicalReviews57:522-542及其中的參考文獻)。為實施進一步延長步驟，必須將得到的磷脂結(jié)合性脂肪酸返回脂肪酸輔酶A酯庫內(nèi)。這通過酰基輔酶A:溶血磷脂跣基轉(zhuǎn)移酶是可能的。此外，這些酶能夠?qū)⒁蜒娱L的脂肪酸從輔酶A酯返回轉(zhuǎn)移至磷脂。根據(jù)需要，這種反應順序可以重復地進行。用于生物合成PUFA的前體實例是油酸、亞油酸和亞麻酸。C化碳月旨肪酸必須延長至C20和C22以便獲得二十和二十二鏈型的脂肪酸。在用于本方法中的去飽和酶和/或延長酶協(xié)助下，花生四烯酸、二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸、有利地是二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸可以產(chǎn)生并且隨后應用于涉及食品、飼料、化妝品或藥品的多種領(lǐng)域。脂肪酸分子內(nèi)具有至少2個、有利地是至少4、5或6個雙鍵的C2。-和/或C『脂肪酸，優(yōu)選地;O旨肪酸分子內(nèi)有利地具有5或6個雙鍵的C,或<:22-脂肪酸可以使用以上提及的酶進行制備。本發(fā)明方法中所用去飽和酶和延長酶的底物是(:16-、C『或C2o-脂肪酸，例如亞油酸、Y-亞麻酸、a-亞麻酸、二高7-亞麻酸、二十碳四烯酸或十八碳四烯酸。優(yōu)選的底物是亞油酸、？亞麻酸和/或a-亞麻酸、二高Y-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸或二十碳五烯酸。所合成的在脂肪酸內(nèi)具有至少4、5或6個雙鍵的<:2。-或<:22-脂肪酸在本發(fā)明的方法中以游離脂肪酸形式或以其酯形式得到，如其甘油酯形式，有利地是其甘油三酯形式。將術(shù)語"甘油酯"理解為意指以1、2或3個氯基游離基酯化的甘油(甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯)。還將"甘油酯，，理解為意指多種甘油酯的混合物。甘油酯或甘油酯混合物可以包含其它附加物例如游離脂肪酸、抗氧化劑、蛋白質(zhì)、糖類、維生素和/或其它物質(zhì)。為了本發(fā)明的目的，還將"甘油酯"理解為意指甘油衍生物。除上述的脂肪酸甘油酯以外，甘油衍生物還包括甘油磷脂和甘油糖脂。在本上下文中提到的優(yōu)選實例是甘油磷脂，如卵磷脂(磷脂酰膽堿)、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸和烷基跣基甘油磷脂。此外，脂肪酸必須隨后易位至多個修飾部位以及摻入到三酰甘油酯中的貯藏脂內(nèi)。脂合成中又一個重要的步驟;O旨肪酸轉(zhuǎn)移至極性頭部基團，例如通過甘油脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶(見Frentzen，1998，Lipid,100(4-5):161-166)。關(guān)于植物脂肪酸生物合成和關(guān)于脂質(zhì)化合物的去飽和、脂代謝及膜運輸、關(guān)于j8氧化、脂肪酸修飾和輔助因子、三酰甘油酯貯藏及三酰甘油酯組裝的出版物見以下論文Kinney，1997，GeneticEngineering,編者JKSetlow，19:149-166;Ohlrogge和Browse,1995，PlantCell7:957曙970;Shanklin和Cahoon，1998，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.49:611-641;Voelker，1996，GeneticEngineering,編者JKSetlow，18:111-13;Gerhardt，1992，Prog.LipidR.31:397-417;Gtihnemann-Schafer和Kindl，1995，Biochim.BiophysActa1256:181-186;Kunau等，1995，Prog.LipidRes.34:267-342;Stymne等，1993，在Biochemistry和MolecularBiologyofMembraneandStorageLipidsofPlants內(nèi)，編者Murata和Somerville，Rockville,AmericanSocietyofPlantPhysiologists,150-158;Murphy和Ross1998，PlantJournal.13(1):1-16，包括其中參考文獻。本方法中所產(chǎn)生的PUFA包含高等動物不再能夠合成并且因而必須攝入，或者高等動物不再通過自身能夠足量地合成并且因而必須攝入額外量的一組分子，盡管所述分子可由其它生物例如細菌輕易地合成，然而例如，貓不再能夠合成花生四烯酸.為本發(fā)明目的，將磷脂理解為意指磷脂酰膽喊、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和/或磷脂酰肌醇，有利地是磷脂酰膽堿。術(shù)語"生產(chǎn)，，或"生產(chǎn)力，，是本領(lǐng)域已知的并且包括植物細胞或植物內(nèi)的生產(chǎn)力，也即相對于此細胞或植物內(nèi)全部脂肪酸的含量，本方法中所產(chǎn)生的所需要脂肪酸的含量。術(shù)語"生物合成"或"生物合成途徑"是本領(lǐng)域已知的并且包含化合物、優(yōu)選地是有機化合物通過細胞從中間體例如在多步驟并受強力調(diào)節(jié)的過程內(nèi)合成。術(shù)語"分解代謝，，或"分解代謝途徑"是本領(lǐng)域已知的并且包含化合物、優(yōu)選地是有機化合物通過細胞在例如多步驟并受強力調(diào)節(jié)的過程中降解產(chǎn)生分解代謝物(更一般的術(shù)語是較小或復雜程度較低的分子)。術(shù)語代謝是本領(lǐng)域已知的并且包含生物內(nèi)發(fā)生的生物化學反應的總體。某種化合物的代謝(例如脂肪酸的代謝)因此包含該化合物在該化合物相關(guān)的細胞內(nèi)的生物合成途徑、修飾途徑和分解代謝途徑的總體。在又一個實施方案中，SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25中所描述的本發(fā)明核酸分子的衍生物編碼如此的蛋白質(zhì)，其與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的完整M酸序列具有至少40%，有利地是約50或60%,有利地是至少約60或70%和更優(yōu)選地是至少約70或80%、80至90%、卯至95%以及最為優(yōu)選地是至少約96%、97%、98%、99%或更高同源性(為本發(fā)明目的同源性等于同一性)。同源性在完全的^J^酸序列或核酸序列區(qū)域范圍內(nèi)計算.包含于GCG軟件包[GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711(1991)1內(nèi)的PileUp程序(J.Mol.Evolution.,25,351-360,1987，Higgins等，CABIOS，51989:151-153)或G叩和BestFit程序[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970)和Smith及Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))用于序列比對。如上表示為百分數(shù)的序列同源性數(shù)值使用BestFit程序和如下設(shè)置在全長序列區(qū)域范圍內(nèi)測定缺口權(quán)重50，長度權(quán)重3，平均配對10.000和平均錯配0.000。除非另外說明，否則這些設(shè)置總是作為標準設(shè)置用于序列比對.此外，本發(fā)明包含如此核酸分子，其因遺傳密碼子簡并性而不同于如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25中所示的核苷酸序列(及其部分)之一并且因而編碼如與由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25中所示核苷酸序列所編碼相同的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、3-去飽和酶或A12-去飽和酶活性.除SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25所示的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、3-去飽和酶或A12-去飽和酶以外，技術(shù)人員認識到，群體內(nèi)可以存在引起A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、①3-去飽和酶和/或A12-去飽和酶的^J^酸序列內(nèi)改變的DNA序列多態(tài)性.A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、co3-去飽和酶和/或A12-去飽和酶基因內(nèi)的這些遺傳多態(tài)性可能因為天然變異而存在于群體內(nèi)的個體間。這些天然變異體通常引起A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、co3-去飽和酶和/或A12-去飽和酶基因的核苷酸序列內(nèi)的1至5%變異.本發(fā)明將包含每一及全部的這些核苷酸變異以及在A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、a)3-去飽和酶和/或A12-去飽和酶內(nèi)產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)性，其中所述氨基酸多態(tài)性是天然變異的結(jié)果并且不修飾這些酶的功能性活性。由于其與本文公開的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和/或co3-去飽和酶核酸具有同源性，有利于本發(fā)明方法的核酸分子可以遵循標準雜交技術(shù)在嚴格雜交條件下，使用這些酶的核酸序列或其部分作為揮:針加以分離.例如本上下文中有可能使用如此的分離核酸分子，其具有至少15個核苷酸長度并且與包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的核苷酸序列的核酸分子在嚴格條件下雜交。也可以使用具有至少25、50、100、250或更多個核苷酸的核酸.如本上下文中所用，術(shù)i吾"在嚴*件下雜交"意圖描述這樣的雜交條件和洗滌條件，在所述的務ff下彼此具有至少60%同源性的核苷酸序列通?？梢员３窒嗷ルs交，優(yōu)選了雜交條件以致彼此具有至少約65%,優(yōu)選地至少約70%并且特別優(yōu)選地至少75%或更高同源性的序列間通常保持相互雜交。這些嚴格條件對技術(shù)人員是已知的并且例如描述于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。優(yōu)選的非限制性嚴格雜交條件的實例是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)內(nèi)于大約45°C雜交，1^在0.2xSSC、0.1%SDS內(nèi)于50°C至65°C下進行一個或多個洗滌步驟。技術(shù)人員知道濃度而不同。在"標準雜交條件"下，例如,取決于核酸類型，在具有O.lxSSC至5xSSC(pH7.2)濃度的含水緩沖液內(nèi)雜交溫度是42°C至58°C間。若有溶劑例如50%甲醛存在于上述緩沖液內(nèi)，則標準條件下的雜交溫度是大約42°C。例如，用于DNA:DNA雜交體的雜交^Hf優(yōu)選地是O.lxSSC和20°C至45°C，優(yōu)選30°C至45°C。例如，用于DNA:RNA雜交體的雜交條件優(yōu)選地是O.lxSSC和30。C至55。C，優(yōu)選45。C至55。C。以上提及的雜交條件以例舉方式對具有約100bp(^5^JJft)長度并且G+C含量是50%的核酸在不存在甲醛條件下進行測定。技術(shù)人員基于以上提到的教材或如Sambrook等，"MolecularCloning",ColdSpringHarborLaboratory,1989;Hames和Higgins(編輯)1985，"NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach",IRLPress在OxfordUniversityPress,Oxford;Brown(編輯)1991，"EssentialMolecularBiology:APracticalApproach",IRLPress在OxfordUniversityPress,Oxford知道如何確定所需要的雜交條件。為測定兩種^J^脧亭列(如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26序列之一)或兩種核酸(例如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25)的同源性(-同一性)百分數(shù)，將序列書寫為使一個序列處于另一個序列下用于最佳比較(例如將缺口引入一種蛋白質(zhì)或一種核酸的序列以便產(chǎn)生與另一種蛋白質(zhì)或另一種核酸的最佳比對)。然后比較相應^J^酸位置或相應核苷酸位置內(nèi)的氨基酸殘基或核苷酸。如果在一個序列內(nèi)的某位置由另一個序列中相應位置內(nèi)的相同M酸殘基或相同核苷酸占據(jù)，則分子在此位置內(nèi)是同源的(如在本發(fā)明中所用即絲酸或核酸"同源性"對應于絲酸或核酸"同一性").兩個序列間的同源性百分數(shù)M列共有的完全相同位置數(shù)的函數(shù)(即同源性％=完全相同位置勤總位置數(shù)xl00)。因此將術(shù)語"同源性"和"同一性，，認為是同義的。所用程序和算法如上所述?？梢匀绱水a(chǎn)生編碼與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的蛋白質(zhì)序列同源的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5國去飽和酶、A5誦延長酶、A4-去飽和酶、A12隱去飽和酶和/或co3國去飽和酶的分離核酸分子，即通過將一個或多個核苷酸的置換、添加或缺失導入于/至SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQID魔17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的核苷酸序列內(nèi)，以致將一個或多個氨基酸的置換、添加或缺失導入于/至編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)。在SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO;ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的一個序列內(nèi)的突變可通過標準技術(shù)如位點定向誘變及PCR介導性誘變進行導入。優(yōu)選在一個或多個預測的非關(guān)鍵氨基酸殘基內(nèi)產(chǎn)生保守性氨基酸置換。在"保守性氨基酸置換"中，氨基酸殘基由具有類似側(cè)鏈的另一種氨基酸殘基替換。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域內(nèi)進行定義.這些家族包含具有堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、^分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸.因此，預測的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶或①3-去飽和酶內(nèi)非關(guān)鍵氨基酸殘基優(yōu)選地由來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基替換.在另一個實施方案中，突變可備選地隨機導入于編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶或Q)3-去飽和酶的完整序列或其部分范圍內(nèi)，例如通過飽和i秀變，并且得到的突變體可對如本文中所述的A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、M2-去飽和酶或co3-去飽和酶活性進行篩選，以鑒定保留A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶或co3-去飽和酶活性的突變體。對SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25中一種序列誘變后，編碼的蛋白質(zhì)可以重組地進行表達，并且該蛋白質(zhì)的活性可經(jīng)例如本文中所描述的試驗測定。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因非人生物，優(yōu)選地是轉(zhuǎn)基因植物，其包含本發(fā)明的核酸SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25或^^有本發(fā)明的這些核^列的基因構(gòu)建體或載體。本發(fā)明通過如下實施例進行更詳細的說明，所述實施例不得解釋為限制性的。實施例實施例1:通用的克隆方法克隆方法例如限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、核酸轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜及尼龍膜、DNA片段的連接、大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化、細菌培養(yǎng)和重組DNA的序列分析按照Sambrook等(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)所描述開展。實施例2:重組DNA的序列分析重組DNA分子以ABI激光熒光DNA測序儀通過Sanger方法(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)測序。測序并發(fā)汪通過聚合im式反應得到的片段以避免待表達的構(gòu)建體內(nèi)的聚合酶差錯。實施例3:來自大豆疫霉的PUFA專一性去飽和酶和延長酶的克隆為搜索具有A6-、A5-、A12-、co3-去飽和酶活性和A6-延長酶活性的新基因，檢索大豆疫霉基因組數(shù)據(jù)庫(http:/genome.jgi畫psf.org/sojae/sojael.home.html)。該數(shù)據(jù)庫含有覆蓋大約90%的大豆疫霉基因組DNA的原始序列。對活性的全部搜索找出了推測的候選基因，通過制備并表征這些候選基因的cDNA，找到它們正確的編碼性可讀框并衍生出氨基酸序列。結(jié)果如下基因酶功能蛋白質(zhì)序列SEQIDD6-Des(Ps)A6-去飽和酶456AsSEQIDNO:lD6-Elo(Ps)A6-延長酶304AsSEQIDNO:3D6曙Elo(Ps)2A6-延長酶278AsSEC)IDNO:5D6誦Elo(Ps)3A6-延長酶278AsSEQIDNO:7D5-Des(Ps)A5-去飽和酶498AsSEGIDNO:9D12畫Des(Ps)A12-去飽和酶398AsSEQIDNO:2503-Des(Ps)3-去飽和酶363AsSEQIDNO:23為制備cDNA，大豆疫霉的總RNA借助Qiagen的RNAeasy試劑盒(Valencia,CA，美國)分離。Poly-A十RNA(mRNA)借助Oligo-dT纖維素從總RNA內(nèi)分離(Sambrook等，1989)。ZAPGold,Stratagene)。才艮據(jù)制造商說明書將cDNA去包裝以產(chǎn)生質(zhì)粒DNA。隨后，對質(zhì)粒文庫篩選相應的推測的候選基因(細菌性克隆的雜交，Sambrook等1989),并且對陽性克隆測序，相應的cDNA克隆隨后用于PCR以克隆表達質(zhì)粒。實施例4:克隆在酵母內(nèi)異源表達大豆疫霉基因的表達載體為了在酵母內(nèi)異源表達，按照制造商說明書，將相應序列用相應的特異性引物經(jīng)PCR擴增并克隆至酵母表達載體YES2.1-TOPO(Invitrogen)。本文中，僅擴增了編碼PUFA蛋白質(zhì)的基因的可讀框。此外，在5，附加Kozak序列(Cell1986，44:283-292):基因絲引物SEQIDD5國Des(Ps)1497bpFwd:gccatggcccccatcgagaccgacRvs:ttagcccatgtggacggacaSEQIDNO:27SEQIDNO:28D6-Des(Ps)1371bpFwd:accatggtggatggccccaagaccaRvs:ttacatggccgggaactcgagcaggSEQIDNO:29SEQIDNO:30D12-Des(Ps)1197bpFwd:gccatggcgatcctgaacccggRvs:tagagcttgttcttgtagaSEQIDNO:31SEQIDNO:3203-Des(Ps)1092bpFwd:gccatggcgtccaagcaggagcaRvs:tcagttggccttagtcttggtcgccSEQIDNO:33SEQIDNO:34D6國Elo(Ps)915bpFwd:aagatggagacgaccttcgcgcgcRvs:ttactgcgtcttcttggcgaccgcagcgSEQIDNO:35SEQIDNO:36D6-Elo(Ps)一2837bpFwd:gccatggcgtcggagctgctgcaRvs:ttagaggttcttcttggccggSEQIDNO:37SEQIDNO:38D6-Elo(Ps)一3837bpFwd:accatgtcggccgacctgctgcRvs:ttagagcttcttcttggcSEQIDNO:39SEQIDNO:40PCR混合物的組成(50pl):5.00pl模板cDNA5.00pi10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.00/d2mMdNTP1.25pl每種引物(IOpmo1/>U的5，-ATG引物和10pmo1/jil的3，-終止引物)0.50Advantage聚合酶4吏用來自CIontech的Advantage聚合酶。PCR反應條件復性溫度55°C下1分鐘變性溫度94°C下1分鐘延伸溫度72。C下2分鐘循環(huán)數(shù)35將PCR產(chǎn)物按照制造商說明書與質(zhì)粒pYES2.1-TOPO(Invitrogen)溫育。隨后，將溫育反應物按照制造商說明書轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a細胞(Invitrogen)。陽性克隆通過PCR鑒定(見以上反應)，并且分離質(zhì)粒DNA(QiagenDneasy)。形成的質(zhì)粒通過測序加以驗證并通過電穿孔(1500V)轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌林INVScl(Invitrogen)。作為對照，平行轉(zhuǎn)化pYES2.1(空白栽體)。轉(zhuǎn)化酵母的選擇在含2%葡萄糖的無尿嘧啶的完全基本培養(yǎng)(CMdum)瓊脂平板上實施。選擇后，每一情況下選擇三個轉(zhuǎn)化體用于進一步功能性表達。為表達來自大豆疫霉的基因，在所有情況下，將5ml含2。/。(w/v)棉子糖的無尿嘧啶的CMdum液體培養(yǎng)基的預培養(yǎng)物首先用所選轉(zhuǎn)化體接種并且在30。C每分鐘200轉(zhuǎn)溫育2日。隨后，5ml含2%棉子糖和300jiM多種脂肪酸的CMdum液體培養(yǎng)基(無尿嘧咬)用預培養(yǎng)物接種至OD咖0.05。通過添加2%(w/v)半乳糖誘導表達。培養(yǎng)物在20。C繼續(xù)溫育96小時。實施例5:用于植物內(nèi)種子特異性表達的表達載體的克隆為轉(zhuǎn)化植物，產(chǎn)生基于pSUN-USP的其它轉(zhuǎn)化載體。為此目的，使用以下引物對(見下表)將Notl切割位點插入編碼序列的5'和3'末端。PCR混合物的組成(50^d):5.00pl模板cDNA5.00pl10x緩沖液(Advantage聚合酶)+25mMMgCl25.002mM的dNTP1.25每種引物(10pmol/Ml)0.50/dAdvantage聚合酶使用來自Clontech的Advantage聚合酶。PCR反應條件復性溫度55。C下l分鐘變性溫度94。C下l分鐘延伸溫度72。C下2分鐘循環(huán)次數(shù)35<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>SEQIDNO:48D6-EIo(Ps)915bpFwdzgcggccgcaagatggagacgaccttcgcgcgcRvs:gcggccgcttactgcgtcttcttggcgaccgcagcgSEQIDNO:49SE<3IDNO:50D6-Elo(Ps)—2837bpFwd:gcggccgcgccatggcgtcggagctgctgcaRvs:gcggccgcttagaggttcttcttggccggSEQIDNO:51SE(JIDNO:52D6-Elo(Ps)—3837bpFwdzgcggccgcaccatgtcggccgacctgctgcRvs:gcggccgcttagagcttcttcttggcSEQIDNO:53SEQIDNO:54PCR產(chǎn)物在37。C與限制性酶Notl溫育4小時。植物表達栽體pSUN300-USP以同樣方式進行溫育。此后，PCR產(chǎn)物和大小7624bp的栽體通過瓊脂糖凝膠電泳分離并且切下相應的DNA片段。DNA通過Qiagen凝膠純化試劑盒按照制造商說明書進行純化。隨后，連接栽體和PCR產(chǎn)物。為此目的使用來自Roche的快速連接試劑盒。通過測序l^iE得到的質(zhì)粒。pSUN300;Lt粒pPZP的衍生物(Hajdukiewicz，P，Svab，Z，Maliga，P.，(1994)ThesmallversatilepPZPfamilyofAgrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformation.PlantMolBiol25:989-994)。pSUN國USP源于pSUN300，其通過將EcoRI片段形式的USP啟動子插入pSUN300產(chǎn)生。多腺苷酸化信號是來自根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的Ostreococcus基因的多腺苷酸化信號(ocs-終止子，Genbank登錄號V00088)(DeGreve，H、Dhaese，P.、Seurinck,J.、Lemmers,M、VanMontagu,M.和Schell，J.NucleotidesequenceandtranscriptmapoftheAgrobacteriumtumefaciensTiplasmid-encodedoctopinesynthasegeneJ.Mol.Appl.Genet.1(6)，499-511(1982)。USP啟動子對應于第1至684位核苷酸(Genbank登錄號X56240)，其中USP基因非編碼區(qū)域的部分包含于USP啟動子內(nèi)。大小684堿基對的USP啟動子片段借助合成的引物和商業(yè)可獲得的T7標準引物(Stratagene)(引物序列5，-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3，)[SEQIDNO:55按照標準方法通過PCR反應進行擴增.PCR片段用EcoRI/SalI再次切割并且插入帶OCS終止子的pSUN300載體。這產(chǎn)生名為pSUN-USP的質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過根瘤農(nóng)軒菌轉(zhuǎn)化植物。實施例6:大豆疫霉基因在酵母內(nèi)的表達已用如實施例4內(nèi)所述質(zhì)粒pYES2.1或質(zhì)粒pYES-d4Des(Ps)、pYES-d5Des(Ps)、pYES-d6Des(Ps)、pYES-dl2Des(Ps)、pYES-o3Des(Ps)、pYES-d6Elo(Ps)、pYES畫d6Elo誦2(Ps)和pYES-d6EIo畫3(Ps)轉(zhuǎn)化的酵母分析如下來自主要培養(yǎng)物的酵母細胞經(jīng)離心(100xg，5分鐘，20。C)收獲并用100mMNaHC03，pH8.0洗滌以除去殘留的培養(yǎng)基和脂肪酸。從酵母細胞沉淀開始，通過酸甲醇分解作用制備脂肪酸甲基酯(FAME)。為此目的，將細胞沉淀在80。C與2ml1N曱醇硫酸及2。/。(v/v)二曱氧丙烷溫育1小時。FAME用石油醚(PE)提取兩次。為除去未衍生化的脂肪酸，有W目在所有情況下用2ml100mMNaHC03，pH8.0和2ml蒸餾水洗滌。1^,PE相用Na2S04干燥，在氬氣下蒸發(fā)并溶于100^1PE。樣品在配備有火焰電離探測器的Hewlett-Packard6850氣相色鐠內(nèi)的DB嗎23毛細管柱(30m，0.25mm，0.25fim，Agilent)上分離。用于GLC分析的條件如下爐腔溫度設(shè)置為以每分鐘5°C的速率從50°C升至250°C并且最后在250。C持續(xù)10分鐘(保持)。信號通it^目對于對應脂肪酸標準物(Sigma)比較停留時間進行鑒定。方法學描述于例如Napier和Michaelson，2001，Lipids.36(8):761-766;Sayanova等，2001，JournalofExperimentalBotany.52(360):1581陽1585，Sperling等，2001，Arch.Biochem.Biophys.388(2):293誦298和Michaelson等，1998，F(xiàn)EBSLetters.439(3):215-218。實施例7:大豆疫霉基因的功能性表征單個基因的活性和底物專一性可以在表達和攝取多種脂肪^進行確定。添加的底物大量存在于全部轉(zhuǎn)基因酵母內(nèi)，i^明這些脂肪酸攝取進入酵母。轉(zhuǎn)基因酵母揭示了新脂肪酸(基因的產(chǎn)物)的合成。這表明來自大豆疫霉的基因可以功能性表達.去飽和酶和延長酶的底物專一性可以借助多種酵母通過攝取而于酵母內(nèi)表達后進行測定。對測定各自活性的描述可以在對于03-去飽和酶的WO93/11245內(nèi)、在對于A12-去飽和酶的WO94/11516內(nèi)，在對于A6-去飽和酶的WO93/06712、US5，614，393、US5614393、WO96/21022、WO0021557和WO99/27111內(nèi)，在對于A4-去飽和酶的Qiu等2001，J.Biol.Chem.276，31561-31566內(nèi)，在對于A5-去飽和酶的Hong等2002，Lipids37,863-868內(nèi)、在對于延長酶的Zank，T.K.等PlantJournal31:255-268,2002內(nèi)找到。各種去飽和酶和延長酶的活性使用式底物/(底物+產(chǎn)物)xlOO從轉(zhuǎn)化率中進行計算。實施例8:轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生a)轉(zhuǎn)基因植物歐洲油菜的產(chǎn)生(Moloney等，1992，PlantCellR印orts，8:238-242的改良方法)。將如實施例5內(nèi)所述產(chǎn)生的具有大豆疫霉基因的雙元載體如pSUN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根瘤農(nóng)桿菌C58C1:pGV2260(Deblaere等，1984，Nucl.Acids.Res.13，4777-4788)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因歐洲油菜植物。為轉(zhuǎn)化歐洲油菜植物(Var.Drakkar,NPZNordeutschePflanzenzucht,Hohenlieth,Germany),使用在Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog1962Physiol.Plant.15,473)上陽性轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌落的過夜培養(yǎng)物的1:50稀釋物，其中所述的Murashige-Skoog培養(yǎng)基補加3。/。蔗糖(3MS培養(yǎng)基)，新鮮發(fā)芽的無菌的歐洲油菜植物的葉柄或下胚軸(在每一情況下約1cm2)在培養(yǎng)m內(nèi)與1:50的農(nóng)桿菌稀釋物共同溫育5-10分鐘。！^在含0.8%Bacto瓊脂的3MS培養(yǎng)基上于黑暗里在25。C共溫育3天。然后，使這些培養(yǎng)物在16小時光照/8小時黑暗內(nèi)生長3天，并且隨后每周依次在補加500mg/L頭孢漆將(頭孢蓬坊鈉)、50mg/L卡那霉素、20一芐氨基嘌呤(BAP)、現(xiàn)補加1.6g/L葡萄糖糖的MS培養(yǎng)基上生長。生長的芽轉(zhuǎn)移至補加2%蔗糖、250mg/L頭孢漆聹和0.8%Bacto瓊脂的MS培養(yǎng)基內(nèi)。若三周后根未發(fā)育，則將2-丐l哚丁酸添加至培養(yǎng)基內(nèi)作為用于生根的生長激素。在補加卡那霉素和頭孢漆肝的2MS培養(yǎng)基上得到再生苗；生根后，將這些苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)料，并且在受控的環(huán)境箱或溫室內(nèi)繼續(xù)生長兩周后開花，并且收獲成熟種子并如例如Qiu等2001，J.Biol.Chem.276，31561-31566所述，通過月旨分析法對去飽和酶基因和/或延長酶基因的表達進行分析。b)轉(zhuǎn)基因亞^HL物的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因亞麻植物可通過例如Bell等，1999，InVitroCell.Dev.Biol.Plant.35(6):456-465的方法經(jīng)粒子轟擊法產(chǎn)生。農(nóng)桿菌介導性轉(zhuǎn)化可以例如通過Mlynarova等(1994)，PlantCellR印ortl3:282-285的方法產(chǎn)生。實施例9:從種子中提取月旨可以通過在適當*(如上文所述)下培養(yǎng)修飾的微生物或修飾的植物并分析培養(yǎng)基和/或細胞組分的目的產(chǎn)物(即脂類或脂肪酸)產(chǎn)生的提高來測定植物、真菌、藻類或纖毛蟲中遺傳修飾對目的化合物(例如脂肪酸)產(chǎn)生的影響。這些分析技術(shù)為技術(shù)人員所熟知，并包括光鐠學、薄層色譜、多種類型的染色方法、酶和微生物方法和分析型色譜(如高效液相色i普)(參閱如UIlman，《EncyclopediaofIndustrialChemistry》，A2巻，89-90和443-613頁，VCH:Weinheim(1985);Fallon，A.，等(1987)《LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology》17巻中的"ApplicationsofHPLCinBiochemistry";Rehm等(1993)《Biotechnology》，第3巻，第III章"Productrecoveryandpurification",469-714頁，VCH:Weinheim;Belter,P,A.等(1988)《Bioseparations:ownstreamprocessingforBiotechnology》,JohnWileyandSons;Kennedy,J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)((RecoveryprocessesforbiologicalMaterials》,JohnWileyandSons;Shaeiwitz,J.A.和Henry,J.D.(1988)《Ullmann'sEncyclopediaoflndustrialChemistry》VCH:Weinheim，B3巻；11章，1-27頁的"BiochemicalSeparations";以及Dechow，F(xiàn)丄(1989)《Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology》，NoyesPublications),除了上述過程以外，如Cahoon等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(22):12935-12940以及Browse等(1986)AnalyticBiochemistry152:141-145所iiA植物材料中提Wi物脂類。脂類或脂肪酸的定性和定量分析描述于Christie,WilliamW.，AdvancesinLipidMethodology,Ayr/Scotland:OilyPress(OilyPressLipidLibrary;2);Christie,WilliamW.，GasChromatographyandLipids.APracticalGuide-Ayr,Scotland:OilyPress,1989，Repr.1992，IX，307pp.(OilyPressLipidLibrary;1);"ProgressinLipidResearch,Oxford:PergamonPress,1(1952)-16(1977)，題目為ProgressintheChemistryofFatsandOtherLipidsCODEN。除了測量發(fā)酵的終產(chǎn)物以外，還可能分析代謝途徑內(nèi)用于產(chǎn)生所需化合物的其它成分如中間體和副產(chǎn)物，以便確定化合物的整體生產(chǎn)效率。分析方法包含測量培養(yǎng)基內(nèi)養(yǎng)分(例如糖、碳水化合物、氮源、磷酸鹽和其它離子)的數(shù)量，測量生物量的組成和生長，分析生物合成途徑內(nèi)常規(guī)代謝物的產(chǎn)生以及測量發(fā)酵期間產(chǎn)生的氣體。用于這些測量的標準方法描述于AppliedMicrobialPhysiology;APracticalApproach,編者P.M.Rhodes和P.F.Stanbury，IRLPress，第103-129頁，第131-163頁和第165-192頁(ISBN:0199635773)及其中所引用的參考文獻內(nèi)。一個實例是脂肪酸的分析(縮寫FAME,脂肪酸甲基酯；GC-MS,氣液色譜/質(zhì)鐠；TAG,三酰甘油；TLC，薄層色謙).通過使用標準分析方法GC、GC-MS或TLC對重組生物進行分析可以明確檢測脂肪酸產(chǎn)物的存在，所述分析方法Christie以及其中的參考文獻進"f亍了描述(1997，AdvancesonLipidMethodology,第4版Christie,OilyPress,Dundee,119-169;1998，Gaschromatographie曙Massenspektrometrie腸VerfahrenGaschromatography/massspectrometricmethod],Lipide33:343-353)通過超聲、在玻璃磨粉機中研磨、液氮和研磨或者通過其它可適用方法將待分析材料^^碎。破碎后，必須將材料離心。將沉淀重懸浮于蒸餾水中，于100。C加熱10分鐘，水上冷卻并離心，接著在舍2%二甲氧基丙烷的0,5M硫酸(在甲醇中)中于卯。C提取1小時，這導致產(chǎn)生水解的油和脂化合物，這可以得到轉(zhuǎn)甲基脂。在石油醚中提取這些脂肪酸曱基酯并且最終4吏用毛細管柱(Chrompack，WCOT融合珪，CP畫Wax誦52CB，25pm，0.32mm)于170°C和240。C之間的梯度溫度20分鐘和240°C下5分鐘進行GC分析。所得到的脂肪酸曱基酯的同一性必須使用可從商業(yè)來源(即Sigma)得到的標準進行定義。最初通過在扦和研缽中粉碎將植物材料機械勻漿以便更適于提取。接著，于100°C加熱10分鐘，冰上冷卻后重新離心沉淀，將細胞沉淀在1M硫酸曱醇溶液和2%二甲氧基丙烷中于90。C氷解1小時，脂類被轉(zhuǎn)甲基.所得到的脂肪酸甲基酯(FAME)在石油醚中提取.所提取的FAME通過使用毛細管柱(Chrompack,WCOT融合硅，CP-Wax-52CB，25pm，0.32mm)于170。C-240。C的梯度溫度20分鐘和240°C下5分鐘進行氣相色譜分析。脂肪酸甲基酯的同一性必須通過與相應的FAME(即Sigma)比較證實。可以通過將FAME混合物進行適當?shù)幕瘜W衍生，例如通過GC-MS得到4，4-二甲^J^惡唑做生物(Christie，1998)進一步鑒定同一性和雙鍵位置。等效物本文中所迷的本發(fā)明具體實施方案的眾多等效物可以通過技術(shù)人員簡單得求助于常規(guī)實驗而鑒定或找到。這些等效物將處于本專利權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.用于在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)產(chǎn)生具有至少4個雙鍵的多不飽和C2『或C22-脂肪酸的方法，所迷脂肪酸的含量以重量計占轉(zhuǎn)基因植物中甘油三酯總含量的至少15%，其中所述方法的特征在于包含如下的步驟a)將包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶和A5-去飽和酶的核酸序列的核酸構(gòu)建體導入轉(zhuǎn)基因植物，或b)將包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A12-去飽和酶和①3-去飽和酶的核酸序列的核酸構(gòu)建體導入轉(zhuǎn)基因植物，或c)將包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶和A4-去飽和酶的核酸序列的核酸構(gòu)建體導入轉(zhuǎn)基因植物，或d)將包含編碼A6-去飽和酶、A6-延長酶、A5-去飽和酶、A5-延長酶、A4-去飽和酶、A12-去飽和酶和o3-去飽和酶的核酸序列的核酸構(gòu)建體導入轉(zhuǎn)基因植物，和e)得到來自該植物的油和脂。2.根椐權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于核酸構(gòu)建體包含選自如下的核酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25，3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于具有至少4個雙鍵的多不飽和C2。-或C22-脂肪^1花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。4.才艮據(jù)權(quán)利要求1至3中任意項所述的方法，其特征在于具有至少4個雙鍵的多不飽和C20-或C22-脂肪酸是花生四烯酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意項所述的方法，其特征在于具有至少4個雙鍵的多不飽和C2。-或C22-脂肪酸是二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意項所述的方法，其特征在于花生四烯酸或二十碳五烯酸在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的含量以重量計占甘油三酯總含量的至少15%。7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意項所逸的方法，其特征在于二十二碳六烯酸在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的含量以重量計占甘油三酯總含量的至少4%。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任意項所述的方法，其特征在于選自C22:4A7，10，13，16-、C22:5A4，7，"，"，"-或C22:5A7"，"，""-脂肪酸的多不飽和脂肪酸在甘油三酯內(nèi)的含量以重量計占甘油三酯的總脂肪酸舍量的少于0.5%.9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意項所逸的方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因植物是油料作物植物或有用植物。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意項所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因植物選自花生、歐洲油菜、油菜、向日葵、紅花(Carthamustinctoria)、罌粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄欖、芝麻、金盞花(Calendula)、石榴(Punica)、月見草、毛蕊花、薊、榛、扁桃、澳洲堅果、鱷梨、月桂、西葫，、亞麻、大豆、阿月混子、玻璃苣、油棕、椰子、核桃、玉米、小麥、黑麥、燕麥、小黑麥、稻、大麥、棉、木薯或胡椒。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任意項所迷的方法，其特征在于具有至少4個雙鍵的多不飽和<:20-或<:22-脂肪酸以斿離脂肪酸形式分離自油或脂。12.用于制備脂肪酸組合物的方法，其通過混合由根據(jù)權(quán)利要求l至ll中任意項所述的方法產(chǎn)生的油、脂或游離脂肪酸與動物的、微生物的或植物的油、脂或脂肪酸制備。13.由根據(jù)權(quán)利要求l至ll中任意項所述方法產(chǎn)生的油、脂或脂肪酸及根據(jù)權(quán)利要求12所制備的脂肪酸組合物在飼料、食品、化妝品或藥物中的用途。14.編碼具有A6-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:l所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:2所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:l所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:2在氨基酸氷平具有至少70%同一性并具有A6-去飽和酶活性的多肽。15.編碼具有A6-延長酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示序列的核餅列，b)編碼具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8所示序列的蛋白質(zhì)的核^f列，或c)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8在^J^酸水平具有至少70%同一性并具有A6-延長酶活性的多肽。16.編碼具有A5-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:9所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:10所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:9所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:10在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有A5-去飽和酶活性的多肽。17.編碼具有co3-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:23所示序列的核酸序列，b)編碼具有SEQIDNO:24所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:23所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:24在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有G)3-去飽和酶活性的多肽。18.編碼具有A12-去飽和酶活性的多肽的分離核酸序列，其選自a)具有SEQIDNO:25所示序列的核酸序列，或b)編碼具有SEQIDNO:26所示序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，或c)SEQIDNO:25所示核酸序列的衍生物，其編碼與SEQIDNO:26在氨基酸水平具有至少40%同一性并具有A12-去飽和酶活性的多肽。19.根據(jù)權(quán)利要求14至18中任意項所述的分離核酸序列，其中該序列衍生自微生物或植物。20.蛋白質(zhì)，其由才艮據(jù)權(quán)利要求14至19中任意項所述的分離核^列編碼。21.包含根據(jù)權(quán)利要求14至19中任意項所迷的分離核酸的基因構(gòu)建體，其特征在于核酸與一種或多種調(diào)節(jié)信號有效地連接。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的基因構(gòu)建體，其特征在于核酸構(gòu)建體包含選自下列的額外的脂肪酸或脂代謝生物合成基因?；o酶A脫氫酶、酰基-ACP[?；泽w蛋白去飽和酶、iL^-ACP琉酯酶、脂肪酸?；D(zhuǎn)移酶、?；?輔酶A:溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸合酶、脂肪酸羥化酶、乙酰輔酶A羧化酶、?；o酶A氧化酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸乙炔酶、脂加氧酶、三酰甘油脂肪酶、丙二烯氧化物合酶、氫過氧化物裂合酶或脂肪酸延長酶o23.如權(quán)利要求21或22所述的基因構(gòu)建體，其特征在于核酸構(gòu)建體包含選自下列的額外的脂肪酸或脂代謝生物合成基因A4-去飽和酶、A5-去飽和酶、A6-去飽和酶、A8-去飽和酶、A12-去飽和酶或A9-延長酶。24.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求14至19中任意項所述的核酸或根據(jù)權(quán)利要求21或22所迷的基因構(gòu)建體.25.轉(zhuǎn)基因非人生物，包舍根據(jù)權(quán)利要求14至19中任意項所述的至少一種核酸、根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的基因構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求24所述的栽體，26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的轉(zhuǎn)基因非人生物，其中生物是植物。全文摘要本發(fā)明涉及用于通過將核酸導入植物而在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法，其中所述的核酸編碼具有Δ6-去飽和酶、Δ6-延長酶、Δ5-去飽和酶、Δ5-延長酶、Δ4-去飽和酶、Δ12-去飽和酶和/或ω3-去飽和酶活性的多肽。這些去飽和酶和延長酶有利地衍生自大豆疫霉(Phytophthorasojae)。本發(fā)明還涉及核酸序列、核酸構(gòu)建體、包含本發(fā)明核酸序列的載體和生物、包含核酸序列和/或核酸構(gòu)建體的載體，并且涉及包含上述核酸序列、核酸構(gòu)建體和/或載體的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的又一部分涉及由本發(fā)明方法產(chǎn)生的脂肪酸組合物及它們的用途。文檔編號C12N15/82GK101146911SQ200680009188公開日2008年3月19日申請日期2006年3月21日優(yōu)先權(quán)日2005年3月22日發(fā)明者J·鮑爾,P·奇爾普斯申請人:巴斯福植物科學有限公司